（苏州大学附属第二医院 苏州 215004）
摘要： 目的：探讨莪术醇对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖与凋亡的作用及对细胞周期的影响，为莪术醇用于临床治疗多发性骨髓瘤提供理论依据。方法：不同浓度的莪术醇(0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)及阴性对照组处理多发性骨髓瘤细胞RPMI8226，应用MTT法检测莪术醇对RPMI8226生长增殖抑制作用，用流式细胞术检测RPMI8226的凋亡及细胞周期变化情况。 结果：莪术醇处理组能明显抑制多发性骨髓瘤RPMI8226的增殖 (P<0.01)，药物作用24 h后，RPMI8226的凋亡率也随莪术醇浓度的增加而增加，10μg/ml的莪术醇处理组凋亡率可达32%，与阴性组比较存在显著差异 (P<0.01)，莪术醇可引起MM细胞周期的紊乱，其对细胞周期的影响是阻断RPMI8226于G1期，从而抑制其后续的DNA合成及有丝分裂。 结论：莪术醇对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226具有显著的增殖抑制作用，并能诱导RPMI8226细胞凋亡，其影响细胞周期是通过阻断RPMI8226于G1期实现的。
关键词： 莪术醇；多发性骨髓瘤；凋亡；细胞周期
多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是一种起源于 B淋巴细胞的血液恶性肿瘤。其特征表现为恶性浆细胞克隆性异常增殖，血清出现单克隆异常免疫球蛋白和/或本周蛋白，导致机体多器官损害，患者最终出现肾功能损害、贫血和骨质破坏[1]。MM 是血液系统的第二大恶性肿瘤，约占整个血液肿瘤10%左右，占所有恶性肿瘤的1%[2]。中药莪术(蓬莪术、广西莪术、温郁金)是治疗肿瘤的常用药，其主要含有挥发油和姜黄素2大类成分，挥发油类成分包括莪术二酮、莪术醇、吉马酮等[3]，莪术醇（Curcumol）是挥发油的重要组成成分之一[4]，是近年来发现具抗肿瘤活性的中药单体之一，对胃癌、妇科肿瘤、肝癌、肺癌、鼻咽癌等具有较好的治疗作用[5]。我们通过观察莪术醇对体外MM细胞的干预，探讨莪术醇对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖与凋亡的作用及对细胞周期的影响，为其用于多发性骨髓瘤的临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 药品与试剂 莪术醇(批号：100185-201310)购于中国食品药品检定研究院，纯度99％，RPMI－1640培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司，488 Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自美国 Invitrogen 公司，6孔板和96孔板购自美国COSTAR公司。MTT购自美国Sigma-aldrich公司。
1．1．2 细胞株 多发性骨髓瘤RPMI8226，由苏州大学生物技术研究所张学光教授惠赠。
1．1．3 主要仪器 超低温冰箱（日本SANYO）、CO2 培养箱（美国Thermo）、全自动酶标仪(美国Bio-rad)、低温超速离心机（美国Thermo）、超净工作台(苏州净化设备一厂)，流式细胞仪(Ex=488nm,Em=530nm)(美国BD公司)，倒置荧光显微镜（德国Carl-Zeiss公司）。
1．2 实验方法
1．2．1 配制莪术醇：称取10mg莪术醇，溶于适量无水乙醇，振摇溶解，待全部溶解后，加无水乙醇稀释至5ml，混合均匀使浓度至2mg/ml。临用前，用细胞培养液稀释成终浓度0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml莪术醇。
1．2．2 MM细胞株 多发性骨髓瘤RPMI8226，置于37℃，饱和湿度，体积分数为0.05%的CO2境况箱中培养。培养液为含10%胎牛血清的PRMI1640培养基。
1．2．3 MTT法分析增殖抑制：取对数生长期的RPMI8226，计数后以每孔2×104个细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后，吸出上清，加入不同浓度的莪术醇：0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml，设加入0μg/ml的为阴性对照组。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆实验设5个复孔，分别于24h、48h、72h及96h时加入10μl MTT，放置4小时后向其中加入100μl酸化SDS（10%的SDS与1mmol/L的盐酸按99：1的比例合成），震荡10min，充分溶解结晶物，使用酶标仪在波长570nm处读取吸光度值（OD570），测定各孔的光吸收值并取平均值，分析莪术醇对RPMI8226增殖抑制的影响，结果用excel软件分析作图。
1．2．4流式细胞术分析凋亡：取对数生长期的多发性骨髓瘤RPMI8226，计数后以每孔1×105/ml的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，吸出上清，加入不同浓度的莪术醇：0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml，设加入0 μg/ml的为阴性对照组。实验设3个复孔，24小时后收集悬浮细胞，分别加入5μl Annexin V-FITC及10μl碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）混匀，室温、避光反应15min，用流式细胞仪检测RPMI8226凋亡情况。数据以Cell Quest.软件分析作图。
1．2．5 流式细胞术分析细胞周期：取对数生长期的多发性骨髓瘤RPMI8226，计数后以每孔1×106/ml的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，吸出上清，加入不同浓度的莪术醇：0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml，设加入0 μg/ml的为阴性对照组。作用8小时后收集细胞，PBS洗涤后，制成1×106/ml的单细胞悬液，并将上述细胞悬液转移到已在-20℃预冷的4ml无水乙醇中，-20℃放置30min后离心去上清，加入5mlPBS缓冲液重悬，水合15min后离心，弃上清后加入1ml细胞周期检测试剂孵育30min后流式细胞仪检测，结果用Cell Quest.软件分析。
1．2．6 统计学处理 数据用SPSS17.0软件处理数据，以均数±标准差（x±S）表示，组间的比较采用非配对的t检验。
2 结果
2.1 莪术醇引起骨髓瘤8226细胞剂量及时间依赖性增殖抑制
MTT显示，4个浓度梯度的莪术醇对RPMI8226的增殖均有不同程度的抑制作用，且随着莪术醇浓度增高和作用时间的增长而逐渐增强。莪术醇浓度在0.1μg/ml时，对细胞的抑制随着时间逐渐增强，浓度分别在0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml时，其抑制程度随剂量增大逐渐增加，作用72h时抑制最强。当莪术醇浓度达1-10μg/ml时，与阴性对照组比较，差异极显著，有统计学意义（P＜0.01）
讨论
多发性骨髓瘤(MM)是来自淋巴结后生发中心(PGC)成熟浆细胞的恶性肿瘤，以大量分泌单克隆免疫球蛋白为特性[6]，本病常表现为贫血、骨痛、高粘滞血症、肾脏损害等，严重威胁着人们的身体健康及影响着生存质量。目前，在临床上对恶性肿瘤尚无十分理想的治疗药物，放疗化疗的副作用也很大。近年来，从天然产物中寻找新的抗肿瘤药物已发展成为新药筛选的主要方向之一，体外筛选实验也成为抗肿瘤药物研发过程中必不可少的一部分[7]。
莪术为姜科植物蓬莪术(Curcuma phaeocaulis va1．)，广西莪术(Curcuma kwangsiensis S．Lee et C．F．Liang)和温郁金(Curcuma wenyujin Y．H．Chen et C．Ling)的干燥根茎。中医理论认为，莪术味辛、苦、温，归肝、脾经，具有行气破血、消积止痛的功效，用于治疗瘀血经闭、食积胀痛、症瘕痞块等。莪术主要含有挥发油和姜黄素等成分，挥发油被认为是抗肿瘤的主要成分，姜黄素为莪术降血脂、抗氧化、抗炎的主要有效成分[3]。莪术醇是莪术挥发油中抗菌、抗病毒、抗癌等作用的重要有效成分[5] ，其既能针对多种癌细胞有直接破坏的作用，又能促使机体免疫系统特异性增强从而获得明显抗癌效应。本实验以多发性骨髓瘤细胞株为研究对象，用不同浓度莪术醇干预RPMI8226，并设阴性对照组，结果发现，莪术醇引起骨髓瘤8226细胞增殖抑制，并存在剂量及时间依赖性。当莪术醇浓度达1-10μg/ml时，对照组与阴性组比较，差异极显著，有统计学意义（P＜0.01）。莪术醇可促进MM凋亡，低浓度莪术醇如0.5μg /ml即可触发MM凋亡，与对照组比差别明显（p＜0.05），其作用随浓度增加而进强，呈浓度依赖性，当莪术醇浓度达1-10μg/ml时，与对照组存在显著差异（P＜0.01）。
参考文献：
[1] Mahindra A, Hideshima T, Anderson KC. Multiple myeloma: biology of the disease. Blood Rev 2011;24 Suppl 1:S5-11.
[2] Jemal A, Siegel R, Xu J, et al. Cancer statistics, 2010. CA Cancer J Clin 2010，60:277-300.
[3] 梁小立，陈琳. 不同品种与产地莪术四个活性成分的比较[J]．临床医学工 程，2012，19（6）：965-967
论文作者:孙红 李凌云 朱勤贤 傅晋翔
论文发表刊物:《健康前沿》2016年3月
论文发表时间:2016/6/14
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