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【摘要】目的：建立美司钠注射液的细菌内毒素检查方法。方法:依照《中国药典》2015 年版四部1143 检查法。结果：美司钠注射液在稀释60倍时对细菌内毒素检查无干扰，细菌内毒素的限值为0.3EU?mL-1。对3批美司钠注射液进行常规检查，结果均符合规定。结论:本文建立的细菌内毒素检查法适用于美司钠注射液细菌内毒素检查。
【关键词】美司钠注射液；细菌内毒素；凝胶法；干扰实验
【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）29-0250-03
美司钠注射液为预防环磷酰胺、异环磷酰胺、氯环磷酰胺等药物的泌尿道毒性[1]。现有的该品种检测标准“中国药典”2015年4期9301版“注射安全检验方法应用指南”[2]。有必要对该品种建立细菌内毒素检测方法。细菌内毒素检测方法快速，敏感，准确，符合3R原则[3-4]，逐步取代兔热原试验方法。本研究建立了美司注射液细菌内毒素检查，大大提高了临床用药的安全性。
1.实验材料
细菌内毒素工作标准品(中国食品药品检定研究院，批号：150601-201885，效价：80EU/支)；鲎试剂(TAL，湛江安度斯生物有限公司，规格：0.1mL/支，批号：1710162，灵敏度：0. 25EU?mL-1；湛江博康海洋生物有限公司，规格：0.1mL/支，批 号：1711092，灵敏度：0.25EU?mL-1)；细菌内毒素检查用水(BET水，中国食品药检监督检定研究院，规格：5mL/支，批号：160006-201704；美司钠注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：170126，规格：4ml：0.4g ；批号170312,规格：4ml：0.4g；批号170617，规格：4ml：0.4g）；仪器ZH-2BLENDER型旋涡混合器(天津药典标准仪器厂)；MET-50 型智能恒温仪(天大天发科技有限公司)；GZX-9146MBE型电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)。
2.方法与结果
2.1 鲎试剂敏感性检查
根据中国药典，2015年版四部通则1143，鲎试剂敏感性试验[5]，所测试的鲎试剂的灵敏度值均在0.5λ至2.0λ的范围内，符合要求，见表1。
2.2 样品内毒素限制L的确定
细菌内毒素限量公式L=K/M，其中K是每人每公斤体重最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5EU?(kg?h)-1；每千克体重用于人体的M以小时计的最大剂量。
对照用药说明书，该药的常用剂量为20%环磷酰胺，异环磷酰胺，氯磷酰胺剂量，静脉滴注或静脉滴注，给药时间为0小时（与细胞抑制剂同时），4小时后和8小时后，儿童的给药频率应相对较频繁（例如6次），间隔时间较短（例如3小时）。
根据环磷酰胺注射规范，成人常用量：单药静脉注射体表面积500～1000mg/m2，加生理盐水20～30ml，静脉注射，每周一次，每次2次，休息1～2周，重复。人的体表面积按1.62m2计，注射用环磷酰胺最大剂量27mg/kg，美司钠注射液最大剂量5.4mg/kg，K=5EU/Kg，L=K/M=5EU/Kg/5.4 mg/Kg=0.926EU/mg，由于该药为联合用药，可严格至限值的1/2或者1/3，因此，限制设定为0.3EU?mL-1[6]。
2.3 干扰测试预实验
凝胶法用于检测细菌内毒素。鲎试剂的灵敏度为0.03～0.5 EU?mL-1，L=0.3EU?mL-1，试验样品用BET水制成60,120,240,500，1000倍系列浓度的溶液，并将获取的溶液作为试验溶液（NPC），制备一系列含有2λ细菌内毒素的各稀释比的试验阳性对照溶液（PPC）。使用鲎试剂进行干扰预试验，敏感度为0.25EU/mL-1。从表2中初步确定，三批Mesna注射液稀释60倍，不干扰鲎试剂与内毒素的反应，见表2。
2.4 正式干扰试验
根据预测试结果，从不同批次中取出三批测试样品，并用BET水稀释1：60倍作为测试溶液。细菌内毒素工作标准分别由试验溶液和BET水制成,使用浓度为2λ、λ、0.5λ和0.25λ的溶液，两种不同制造商生产的灵敏度为0.25 EU?mL-1。根据《中国药典》2015年版四部通则 1143细菌内毒素试验凝胶法干扰试验操作。不同批次的TAL和WSE反应之间没有干扰,Mes注射钠以1：60稀释，见表3。
2.5 标准建立
根据上述结果，可以建立美司钠细菌内毒素检验标准。细菌内毒素：取本品并依法检查(《中国药典》2015年版四部通则 1143)，每1mg美司钠的内毒素含量应小于0.3EU。
2.6 样品检测
根据本研究中建立的细菌内毒素检查，取鲎试剂，灵敏度为0.25EU?mL-1。常规检查三批美司钠注射液，结果符合规定。见表4。
3.讨论
美司钠注射液常用量为环磷酰胺、异环磷酰胺、氯磷酰胺剂量的20%，由
于是联合用药，所以在限值上需要严格控制，期间根据注射用环磷酰胺和注射用
异环磷酰胺的说明书，得出的理论限值为：注射用环磷酰胺＜注射用异环磷酰胺，所以选用注射用环磷酰胺的理论限值，最终确定为L=0.3EU?mL-1。
在干扰预实验中，我们发现美司钠注射液几乎不存在干扰作用，所以选择最小的稀释倍数（1：60）作为干扰试验的浓度进行正式干扰试验。
由于该药的标准既没有细菌内毒素检查项又没有热原检查项，所以可以在两者之间随便选择一项作为检查项，综合各种条件考虑，最终还是选择细菌内毒素较为妥当。
查询文献，没有找到美司钠注射液的细菌内毒素检查方法，该文建立的细菌内毒方法为：取本品并依法检查(《中国药典》2015 年版四部 1143)，每1mg美司钠的内毒素含量应小于0.3 EU。
【参考文献】
[1]国家药品标准，美司钠注射液[S].2003:152.
[2]中国药典[S].2015 年版．四部:9301ChP［S］.2015．Vol Ⅳ:9301.
[3]张虞婷,丁苏苏,李倚云.细菌内毒素的研究进展及其检查法的应用[J].天津药学,2015,27(5):69.
[4]曾艳,孙阳,蓝燕．动态浊度法检测冻干甲型肝炎减毒活疫苗细菌内毒素含量的研究[J].微生物学杂志,2016,35(4):66.
[5]中国药典[S].2015 年版.四部:154ChP[S].2015.Vol Ⅳ:154.
[6]中国药典[S].2015 年版.四部:400ChP[S].2015.Vol Ⅳ:400.
论文作者:冯亮1,刘益庆2
论文发表刊物:《医药前沿》2019年29期
论文发表时间:2019/11/20
标签：内毒素论文; 细菌论文; 注射液论文; 酰胺论文; 药典论文; 干扰论文; 中国论文; 《医药前沿》2019年29期论文;