姜淼[1]2006年在《黄连人参对药改善2型糖尿病胰岛素抵抗机制研究》文中认为本课题基于中医药治疗2型糖尿病胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的临床实践经验,将《内经》“壮火食气”病机理论应用于2型糖尿病IR治疗实践和实验研究,提出治疗2型糖尿病IR存在火热伤正病机,可采用“热者寒之”的治疗原则,应用泻火补气治法进行治疗。选用临床有效的黄连人参药对作为治疗药物,观察其对2型糖尿病IR和继发的β细胞功能损害的影响。探讨2型糖尿病“壮火食气”病机和泻火解毒与补气扶正治法的治疗作用,为建立中医药治疗的新理论提供基础。1文献研究:全面查阅了近年来国内外2型糖尿病IR、过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)γ研究、实验性2型糖尿病IR动物模型的相关研究文献资料,对目前现代医学和中医学对于2型糖尿病IR的发病机理、治疗用药、研究方法;对于PPARγ的近期研究成果;动物模型的建立及研究方法等概况进行了较为系统的总结和综述,掌握了相关项目科研前沿动态。2理论研究:在中医理论指导下,选取IR作为中医药治疗2型糖尿病的切入点,综述了目前清热泻火补气扶正治法在2型糖尿病IR临床治疗中的应用现状,并对2型糖尿病IR发生发展的中医病机进行了阐述,在以往认识的基础上提出了IR及其相关病证“壮火食气”的病机假说和泻火解毒祛邪与补气扶正相结合的治法,对于阐发2型糖尿病IR的中医病因病机,寻找积极有效的治疗方法具有重要意义,丰富了2型糖尿病IR的中医病机学及治法学内容。3实验研究研究目的:观察黄连人参对药对实验性2型糖尿病IR大鼠的治疗作用及机制。研究方法:以长期高糖高脂饮食喂养加小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法复制实验性2型糖尿病IR大鼠动物模型,应用黄连人参对药对其进行干预,以吡格列酮作为阳性对照药,观察药物对实验性2型糖尿病IR大鼠糖代谢、脂代谢、胰岛素敏感性、胰腺病理形态学、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平、游离脂肪酸(FFA)水平和PPARγ基因表达等的影响。研究结果:①模型评价:成功复制了实验性2型糖尿病IR大鼠模型,该实验模型动物表现为高血糖、高胰岛素血症、高FFA和高水平TNF-α,其胰岛素作用指数(IAI)明显低于正常动物,不仅表现IR,且有部分胰岛β细胞功能受损,符合2型糖尿病IR临床特点。药物治疗后,其检测结果均有不同程度的改善,用以评价药物疗效结果可信。可操作性强,死亡率低,成功率高,经济成本适宜,为研究2型糖尿病及IR的理想载体。②基础药效研究:在成功建立实验性2型糖尿病IR大鼠模型的基础上,观察黄连人参对药对于实验性2型糖尿病IR大鼠糖、脂代谢以及胰腺病理形态学、主要肝功能指标改变的影响。糖代谢指标血清生化检测结果表明,黄连人参对药能够明显降低模型动物空腹血糖水平,
邵月[2]2010年在《运动地P53调节能量代谢信号通路相关基因表达的影响》文中研究说明细胞能量代谢异常和内外稳态环境紊乱是肿瘤和糖尿病发生的重要原因。骨骼肌是人体最大的运动和内分泌器官,骨骼肌细胞能量代谢相关基因表达对长期运动的适应是运动预防肿瘤发生、胰岛素抵抗和Ⅱ型糖尿病非常重要的因素。P53作为肿瘤抑制蛋白、细胞周期调控检查点、能量代谢的调节者、氧化应激的平衡者,位于多个细胞信号转导通路的核心位置,是生物体内部多个信号通路的调节者、平衡者、整合者,对调节细胞能量代谢、保持细胞氧化应激信号稳态和保持生物体内稳态效应都具有非常重要的作用,保持P53基因的稳态表达是预防肿瘤和延缓衰老的策略之一。体育锻炼能促进机体新陈代谢,延缓细胞衰老,减少细胞癌变几率,适宜的运动能够通过影响P53调节的能量代谢信号通路延续P53信号稳态。目的：本研究分别建立长期耐力训练模型、间歇性冲刺训练模型和一次急性运动模型,耐力训练模型以长时间、低强度为特征,间歇性冲刺训练模型以短时间、大强度、间歇性为特征,分别探讨、比较运动影响下SD大鼠、糖尿病GK大鼠骨骼肌的基因表达应答,期望能从基因表达水平上揭示骨骼肌细胞适应不同运动类型保持能量代谢和氧化应激平衡的分子机制,为运动保持骨骼肌正常生理功能和促进病理状态的改善和恢复提供一定的科学参考。方法：清洁级Sprague-Dawley雄性大鼠40只,约4周龄,体重100±5g,随机分为4组,即安静组(CON, n=10),耐力组(ET，n=10),冲刺组(SIT, n=10),急性组(AE,n=10)；糖尿病雄性大鼠12只,约8周龄,体重250±5g,随机分为2组,即GK安静组(GKC, n=6),GK耐力组(GKE, n=6)。耐力训练：正常SD大鼠和糖尿病GK大鼠均进行每天30-60min低强度(≤16.7m/min)的持续跑台运动；每周训练6天,训练6周。间歇性冲刺训练：正常SD大鼠每天9-10次10s最大强度(≥42m/min)的跑台运动,间歇时间30-60s,训练6周。最后一次训练结束后24h,所有大鼠依次断颈处死。一次急性运动：正常SD大鼠6周期间饲养环境等各方面均与安静组相同,进行一次60min低强度(≤16.7m/min)急性跑台运动后断颈处死。心脏取血,检测血清血糖、胰岛素、脂联素、甘油叁酯、总胆固醇、糖化血清蛋白和红细胞糖化血红蛋白；取腓肠肌检测乳酸、GSH、GSSG含量；用实时荧光定量PCR法检测腓肠肌P53、SCO2、SCO1、COXⅡ、TIGAR、HKⅡ、PGM2、PDK4、PFKm、CPT1-β、AMPKa2、GLUT4的基因转录水平；用Western blot测定腓肠肌细胞P53、TIGAR、SCO2、SCO1、COXⅡ的蛋白表达水平。结果：(1)在正常生理条件下,一次急性运动、耐力训练和间歇性冲刺训练并没有从整体水平上影响机体血糖稳态和胰岛素抵抗指数,都显着降低了总胆固醇、甘油叁酯和糖化血清蛋白水平,耐力训练还显着增加了脂联素分泌。在糖尿病病理条件下,耐力训练表现出良好的降低血糖、糖化血清蛋白、胰岛素抵抗指数、总胆固醇和升高脂联素的效果。(2)在正常生理条件下,一次急性运动、耐力训练、间歇性冲刺训练对P53基因转录和蛋白表达均没有产生显着性影响。在病理条件下,耐力训练对P53基因表达的影响与正常生理状态下不同,P53基因转录和蛋白表达均显着降低。(3)在正常生理条件下,一次急性运动显着增加了SCO2基因转录,对SCO2蛋白表达、SCO1和COXⅡ基因表达均没有产生影响。耐力训练显着增加了SCO2、SCO1基因转录,对COXⅡ基因转录影响不大,但却显着增加了SCO2、COXⅡ蛋白表达水平。间歇性冲刺训练对SCO2基因转录没有影响,非常显着增加了SCO1、COXⅡ基因转录水平,同时显着增加了SCO2和COXⅡ的蛋白表达水平。叁种运动方式都显着升高了GSH/GSSG比率。在病理条件下,耐力训练没有影响SCO2、SCO1基因表达,而且还极大降低了COXⅡ蛋白表达水平。但GSH/GSSG比率却显着上调。(4)在正常生理条件下,一次急性运动显着增加了TIGAR、PGM2基因转录,对TIGAR蛋白表达、HKⅡ和PFKm基因转录、乳酸含量均没有产生影响。耐力训练显着增加了TIGAR基因转录和蛋白表达水平,但对PGM2、HKⅡ、PFKm和乳酸含量均没有产生影响。间歇性冲刺训练非常显着增加了PFKm基因转录和乳酸含量,但对TIGAR基因表达、PGM2、HKⅡ、PFKm基因转录没有产生影响。在病理条件下,耐力训练显着增加了HKⅡ、PFKm、GLUT4、AMPKα2基因转录,但对TIGAR基因表达、PGM2基因转录和乳酸含量没有影响。(5)在正常生理条件下,一次急性运动非常显着降低了PDK4基因转录水平,对CPT-1β则没有影响。耐力训练在非常显著降低PDK4基因转录水平的同时非常显着升高了CPT-1β基因转录水平。间歇性冲刺训练使PDK4、CPT-1β基因转录水平均显著升高。在糖尿病病理条件下,耐力训练显着降低了GK大鼠PDK4水平,但是,耐力训练并没有像在正常生理条件下一样对大鼠CPT-1β基因表达产生影响。结论：(1)在正常生理条件下,从血液指标来看,运动并没有从整体水平上影响机体的正常生理稳态,机体的整体生理调节尚处于稳态范围内,运动对改善健康机体整体水平糖脂代谢能力具有一定效果。在糖尿病病理条件下,从整体水平上来讲,耐力训练可能是改善糖尿病高血糖症状的有效方式。(1)在正常生理条件下,运动对P53没有产生显着性影响,而是促进P53充分发挥其调节、检查、平衡、整合的稳态效应以保持机体发挥正常生理功能。在病理条件下,耐力训练使P53基因表达能力下降,可能是受糖尿病病程的影响,P53无法继续保持机体生理功能在正常稳定状态,其基因表达能力的下降极有可能是为了促进细胞的生存,也许是为了延缓GK大鼠病态细胞的凋亡和衰老进程。(2)在正常生理条件下,从SCO2、COXⅡ基因表达结果可以看出,耐力训练和间歇性冲刺训练对长期训练能产生很好的运动适应,都呈现出促进线粒体有氧呼吸效应,一次急性运动则没有使有氧呼吸链组分改善达到期望效果。SCO1基因表达似乎对运动方式不敏感,其基因转录水平的极显着性升高不能排除最后一次训练短时的应激反应。从对GSH/GSSG比率的影响来看,运动可能都改善了机体的氧化还原环境。在糖尿病病理条件下,似乎耐力运动对线粒体有氧呼吸轴并没有产生积极而有效的影响,综合P53和GSH/GSSG结果来看,也许是P53促生存功能所致。在病理条件下,也许细胞更重要的功能不是提高运动能力,而是积蓄一切力量,促使细胞生存。(3)在正常生理条件下,耐力训练诱导的TIGAR基因表达水平显着上调必将有利于机体能量代谢转向更经济高效的有氧呼吸通路,是机体对耐力训练产生的一种良好的运动适应现象。运动没有对骨骼肌摄取糖的能力造成大的冲击,这种对血糖稳态的有力控制对保持机体正常生理功能的发挥具有重要的意义。运动诱导的P53基因的稳态表达似乎也保持了糖酵解通路其直接靶基因的稳态表达,耐力训练对线粒体有氧呼吸通路具有较好的促进作用,但对糖酵解通路影响不是太大。冲刺训练诱导的乳酸产生与PFKm基因转录水平呈现一致性升高,可在一定程度上印证间歇性冲刺训练能量产生很可能以无氧代谢为主,这与其运动方式能量代谢需求特点相吻合。耐力训练降低了糖尿病大鼠的氧化应激能力,这也许是耐力训练对糖尿病大鼠细胞生存能力的一大贡献。(5)在糖尿病病理条件下,耐力训练极有可能通过能量敏感性通路AMPK-GLUT4葡萄糖转运机制极大地促进了骨骼肌糖摄取能力,对于改善GK大鼠高血糖症状是一种非常有效的方式。但结合P53基因表达水平显着下调结果来看,GLUT4和HKⅡ好像失去了P53对其直接抑制作用,朝向促进糖酵解的方向发展,下调的P53亦不能通过TIGAR来抑制糖酵解通路。这些变化虽然降低了血糖,但也有可能为恶性病变埋下隐患,可能是机体对运动并没有很好适应的一种表现。也许在病理状态下,细胞分子之间的信号转导通路可能会发生一定的改变,本实验耐力训练方式未必对糖尿病大鼠完全有利,运动对糖尿病的重要意义也许重在防而不是治。(6)在正常生理条件下,耐力训练非常显着减弱了PDK4对PDC的磷酸化抑制,加强了骨骼肌线粒体丙酮酸氧化能力,同时非常显着增加了CPT-1β表达,也加强了脂肪酸氧化能力,表明耐力训练是激活线粒体呼吸的有效运动方式。间歇性冲刺训练极有可能加强了PDK4对PDC的磷酸化抑制,其供能可能以糖酵解为主,但其同时也升高了CPT-1β表达,表明间歇性冲刺训练也有可能是激活线粒体呼吸的一种有效运动方式。在糖尿病病理条件下,耐力训练显着性降低了GK大鼠PDK4水平,对促进糖尿病大鼠有氧呼吸能力是有利的,也是运动能改善糖尿病症状的一种分子水平上的依据,但是,耐力训练并没有像在正常生理条件下一样对大鼠CPT-1β基因表达产生良好的适应性反应。(7)综合结果显示,在正常生理条件下,不同的训练方式对机体不同组分产生的影响也各不相同,长期运动训练更能使机体产生较好的运动适应。冲刺训练与耐力训练相比,在诱导肌肉运动适应方面具有相似性,可能是一种更有效的时间节省化方式。(8)在运动影响下的P53调节能量代谢通路中,并不是每一个因子都遵循其能量产生需求方式,尤其在糖尿病病理状态下,耐力训练糖尿病大鼠各因子变化有些甚至是明显的无氧供能特征。可能在病理状态下,运动确实影响了能量代谢途径,有些有利于机体的恢复与健康,而有些指标的改变却对机体产生了不良的影响。运动对机体的影响非常复杂,我们不能仅从一个方面或很少的几个方面来简单地下结论,运动对机体是有益还是有害,而是应该综合地观察其效果,毕竟整体水平机能的改善才是我们追求的终极目标。
欧丽娜[3]2007年在《芪蓝糖脂宁胶囊复方再优化研究及其糖脂双调的机理探讨》文中研究说明糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是一种常见的内分泌代谢性疾病,其基本病理特点为胰岛素分泌绝对或相对不足,或外周组织对胰岛素不敏感,引起以糖代谢紊乱为主,包括脂肪、蛋白质代谢紊乱的一种全身性疾病。因此,单纯控制血糖不能完全消除糖尿病患者冠心病等大血管并发症,往往同时进行调脂治疗。中医传统复方注重整体调节,标本兼治,近年来,在治疗糖尿病合并高脂血症方面表现了巨大的潜力。芪蓝糖脂宁胶囊是导师高学敏教授针对糖尿病合并高脂血症的病因病机,在中医基础理论指导下,结合现代药理学研究成果创制的科研处方。前期张德芹博士已对其进行了文献、理论和药效学实验研究,证明其有显着的糖脂双调的效果,是治疗糖尿病合并高脂血症的有效良方。但是,该方含有黄芪、绞股兰、红曲等九味中药,药味较复杂,为生产、质控和服用都带来了不便,因此,本课题以此方为研究对象,采用直接实验设计法,对其进行复方再优化研究,然后,对再优化所得最优方进行糖、脂双降的药效和机理探讨。1文献研究1.1糖尿病合并高脂血症与胰岛素抵抗全面查阅了近年来国内外糖尿病合并高脂血症、胰岛素抵抗及理论的相关研究文献资料,阐明了胰岛素抵抗为糖、脂代谢紊乱的共同病因,并对糖尿病合并高脂血症胰岛素抵抗的发病机理及研究方法进行了系统的总结和综述。1.2中药复方再优化研究进展查阅整理了目前应用于复方再优化的主要实验设计方法及数据优化处理方法,掌握了相关项目科研的研究动态。2.实验研究2.1芪蓝糖脂宁复方再优化试验运用直接实验设计法安排药效实验,获得实验信息,在前期复方再优化理论研究的基础上,结合专业知识,将药味间的交互作用引入变量筛选过程,利用SAS软件进行多元线性回归分析,得到针对不同效应指标的回归方程,并预测出各指标相应的优化方。依据传统中医药理论及各优化方中药味和药量出现的频次,拟合出最优方――芪曲糖脂宁胶囊(QQTZN)。筛选所得最优方QQTZN由黄芪、葛根等五味中药组成,药味精良,且符合医理药理,功能益气健脾,生津止渴,化瘀降浊。2.2最优方药效实验验证采用高糖高脂饲料合并小剂量链脲佐菌素注射的方法复制2型糖尿病合并高脂血症模型。在此基础上观察最优方对模型大鼠糖、脂代谢以及胰腺和肝脏病理形态学改变。2.2.1对糖代谢血清生化学指标的影响给药6周后,二甲双胍组、最优方高、中、低剂量组血糖水平均较模型组有显着的下降,而反证方组降糖作用明显不如最优方。大鼠糖耐量实验结果表明,与模型组相比,最优方高、中、低剂量组可不同程度的降低糖耐量曲线下面积,疗效优于反证方。2.2.2对脂代谢血清生化学指标的影响给药6周后,模型组大鼠血清TC、TG与给药前相比也有所下降,分析与给药期间停止高脂饮食及大鼠自身的脂质清除能力较强有关。各给药组血清TC、TG和血清LDL-C水平与模型组相比均明显下降。同时,血清HDL-C水平均较模型组有显着上升。最优方降低血清TC和TG的作用优于反证方。2.2.3胰腺、肝脏组织病理形态学改变胰腺、肝脏HE染色结果显示,最优方高、中、低剂量组可不同程度的改善胰腺、肝脏病理损害,效果优于反证方。综上所述,最优方药少力专,糖脂双调的药效学作用确切,明显优于反证方,与理论预测结果一致,进一步证实了复方再优化方法对确有疗效的中药复方的筛选和精练处方的作用。结合现代医学知识和中医传统理论,分析反证方的组方特点,可以看出数据筛选剔除了部分滋阴及降脂作用相对较强而补气和降糖作用相对较弱的中药,从而达到精练处方的目的,使最优方更突出了补气健脾,化瘀降浊,进而糖脂双调的特点。2.3机理探讨2.3.1对胰岛素受体前水平影响采用放射免疫技术研究了最优方对模型大鼠血清胰岛素含量的影响,结果表明,QQTZN高剂量组与模型组相比,血清胰岛素水平明显降低,胰岛素敏感性指数明显升高。中、低剂量组与模型组相比,血清胰岛素水平无明显变化,但胰岛素敏感性指数明显升高。采用免疫组化技术研究了最优方对模型大鼠胰岛α、β细胞胰岛素、胰高糖素表达的影响。结果显示,QQTZN高、中、低剂量组β细胞数量比模型组增多,胰岛素表达较模型组明显增强;α细胞数量比模型组减少,胰高血糖素表达较模型组明显降低。上述结果表明,QQTZN可以通过增加胰岛素敏感性,修复链脲佐菌素(STZ)造成的胰岛β细胞损伤,以及调节胰岛α细胞分泌胰高糖素水平来影响胰岛素发挥正常的生物效应。2.3.2对胰岛素受体后PI-3K信号传导途径的影响采用免疫组化技术研究了最优方对肝脏组织IRS-2及PI-3K表达的影响。结果表明,最优方高、中、低剂量组肝脏组织IRS-2表达较模型组明显提高。QQTZN低剂量组与模型组相比PI-3K的表达有明显提高,QQTZN高、中剂量组PI-3K表达与模型组相比有升高的趋势,但无显着差异。采用RT-PCR产物半定量技术对实验大鼠骨骼肌GluT4mRNA进行了检测,结果表明,QQTZN高、低剂量组GluT4 mRNA表达与模型组相比有显着升高。从上述结果可以看出,QQTZN可以使IRS-2、PI-3K以及GluT4的表达有不同程度的提高,表明该药可以从多个位点改善胰岛素的信号传导障碍,使胰岛素得以发挥其正常的生理功能,调节糖、脂代谢。2.3.3对PPARγ调控及其它脂肪源性细胞因子的影响采用免疫组化技术研究了最优方对肝脏组织PPARγ表达的影响。结果表明,与模型组相比,高、中剂量组有不同程度的增加模型大鼠肝脏PPARγ表达的作用。采用ELISA法检测了最优方对脂肪组织TNF-α表达的影响。结果显示,QQTZN高、中剂量组有显着降低脂肪中的TNF-α浓度的作用。提示最优方可通过降低TNF-α水平,解除TNF-α对脂肪和肌肉GluT4表达抑制,刺激脂肪分解等作用提高胰岛素敏感性。采用比色法研究了最优方对血清中FFA含量的影响。结果表明,QQTZN高、中、低剂量组均可显着降低血清中FFA的含量。提示最优方可以通过降低脂毒性对机体的损害而达到调节糖、脂代谢的作用。上述结果表明,QQTZN可增加PPARγ表达,抑制TNF-α及FFA的释放,调节脂代谢,而且可以通过抑制TNF-α、FFA的释放,及改善胰岛素信号传导通路障碍等多条途径增加胰岛素的敏感性,从而对糖代谢进行调节。本课题的创新点在于:(1)在张学中教授的指导下,将直接实验设计法用于中药有效复方的再优化研究,在考察单味药对药效贡献度的基础上,根据中药复方用药的特点,考虑了多味药交互作用对药效的贡献度,更加符合中医基础理论及用药规律。(2)本课题研究的是中药复方对糖尿病合并高脂血症的影响,发病机理存在糖代谢紊乱和脂代谢紊乱并存的现象,因此在机理探讨方面,从二者的共同致病因素胰岛素信号传导通路障碍入手,同时考察了对脂肪源性细胞因子的影响,更好的解决了糖、脂共调的问题,为中药干预糖、脂代谢的作用机理研究提供了新的思路。综上所述,通过本实验研究,在原有效复方芪蓝糖脂宁的基础上凝炼出了药味精良的新复方QQTZN,并在复方优化过程中考察中药交互作用的贡献度,丰富了复方优化的方法。随着数理统计学的发展,将不断有新的方法产生,不断探索更符合中医理论特点的数据处理方法是我们努力的目标。在机理探讨的过程中,通过对胰岛素信号传导通路以及脂源性细胞因子的研究,表明QQTZN从多环节、多靶点影响胰岛素信号传导通路,从而实现糖、脂双调的效果,为中药复方治疗糖尿病合并高脂血症提供了科学证据,具有一定的理论和实践价值。
刘丰彬[4]2009年在《负重训练和补充大豆多肽干预大鼠骨骼肌衰老效果及机制研究》文中提出随着全世界老龄化国家增多,老龄人口比率加大,人口的老龄化已经成为许多国家都要面对的新的突出的社会问题。如何延长老年人的健康寿命,提高生活质量已成为各国政府和社会各界关注的焦点。对衰老和衰老相关疾病的研究历来就是世界性的医学课题,探索衰老的本质,寻找有效的抗衰老药物和方法,以求得预防衰老过早出现和延缓衰老的进程已成为当前老年医学领域中的研究热点。近年来,老年人骨骼肌功能的衰退受到了科研人员的重视,因为人们发现骨骼肌的衰老会加速人体整体的衰老进程,而骨骼肌功能的恢复对提高老年人的健康水平和生活质量都十分有意义。目前对于预防和延缓衰老主要集中在药物研究上,尽管药物干预有一定的临床效果,但是同时又存在着作用局限、有毒副作用等不足。运动是生命活动的基础,而营养则是生命活动直接的保障,如何将运动和营养干预这两种更为经济和安全的方式结合起来,使身体各器管、各系统的功能产生良好的效应,以对抗机体衰老,特别是骨骼肌的衰老,值得深入研究和探讨。针对运动干预衰老的研究,国内外已有相关的报道,但多数研究是对人体整体机能的调节和影响,指标也较为单一,缺少针对某一器官和组织,尤其是缺少运动抗骨骼肌衰老的机理及综合指标的研究,选择形式也以有氧运动或短期力量训练为主,对骨骼肌刺激更明显的长期抗阻力量训练或负重训练的研究较少,作用效果也不明确。国内外针对营养干预衰老的研究也较多,相关的营养补剂产品也层出不穷,但从整体、组织、基因不同层面入手,观察长期补充大豆天然提取物大豆多肽对骨骼肌衰老的影响并探讨其机制,国内外还没有见到相关文献的报道。本研究就是运用衰老研究中常用的D-半乳糖皮下注射的方法,复制大鼠亚急性骨骼肌衰老模型,并在造模过程中和造模成功后都进行负重训练和补充大豆多肽的干预。通过观察一般指标、骨骼肌组织切片和相应的生化指标,判定两种干预方式对预防骨骼肌衰老过早出现和延缓骨骼肌衰老的作用效果,同时测量血清及骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)、血清睾酮(T)、皮质醇(C)、生长激素(GH)和胰岛素样生长因子- I (IGF-I)、骨骼肌总蛋白和脂褐素、骨骼肌肌动蛋白(α-actin)、IGF-I和生长分化因子-8(GDF-8)mRNA等指标,初步探讨两种干预方式在预防和延缓骨骼肌衰老中的作用机制,为进一步进行人群干预试验积累一定的理论和实验基础,为提供更有针对性的运动方式和研制、开发合理有效的营养补剂,以对抗中老年人骨骼肌的衰老,开辟一条新思路和新途径。同时,也为指导中老年人科学的健身,合理进行慢性病的康复,提高健康水平和生活质量,提供一定的帮助和借鉴。实验分为两部分:预防衰老实验和延缓衰老进程实验一、预防衰老实验3月龄SD雄性大鼠56只,随机分为7组:成年组(C)、D-半乳糖组(M)、D-半乳糖小负重组(S)、D-半乳糖大负重组(B)、D-半乳糖补肽组(P)、D-半乳糖补肽小负重组(PS)、D-半乳糖补肽大负重组(PB)。所有大鼠在6周D-半乳糖造模的过程中进行相应的负重训练和补充大豆多肽的干预。6周末处死,比较各组一般指标、骨骼肌组织切片、血清和骨骼肌组织生化以及分子生物学指标,结果如下:1.一般指标:所有造模组大鼠均出现了衰老的外观特征,体重呈现自然增长趋势,双侧腓肠肌总重量、腓肠肌相对重量有下降的趋势,各干预组大鼠以上变化幅度趋缓;所有组大鼠每日摄食量都有下降的趋势,造模组趋势更为明显。提示:两种干预方式可以有效改善衰老的外部特征。2.骨骼肌组织切片:光镜下观察C组大鼠为正常骨骼肌组织学特征,所有造模组大鼠均出现不同程度的肌细胞萎缩或退行性改变特征,以M组变化最为明显。提示:两种干预方式可以有效预防骨骼肌衰老过早的出现。3.血清学指标:与C组相比,M组大鼠血清中SOD活力及SOD/MDA、T含量及T/C、GH含量显着下降,血清MDA含量、C含量显着上升,(P<0.01或P<0.05)血清IGF-I含量有下降的趋势,但无显着性差异;负重训练或补充大豆多肽干预可以有效的逆转以上趋势,均以小负重组表现更为明显,并且两种干预方式均具有显着的交互作用。提示:两种干预方式可以减轻D-半乳糖造成的机体脂质过氧化和激素水平的紊乱。4.骨骼肌组织生化指标:与C组相比,M组大鼠骨骼肌SOD活力、MDA含量、脂褐素含量显着升高(P<0.01或P<0.05),SOD/MDA有降低的趋势,但无显着性差异;骨骼肌总蛋白含量显着下降(P<0.05);负重训练或补充大豆多肽干预除可以进一步提高骨骼肌SOD活力外,均可以逆转其他的趋势,多数以小负重组表现更为明显,并且以上情况两种干预方式均具有显着的交互作用。提示:两种干预方式可以减轻D-半乳糖造成的骨骼肌组织脂质过氧化和肌蛋白合成的减少。5.骨骼肌组织分子生物学指标:与C组相比,M组大鼠骨骼肌组织中α-actin mRNA和IGF-I mRNA表达显着下降(P<0.01);GDF-8 mRNA表达显着升高(P<0.01);负重训练或补充大豆多肽干预可以有效的逆转以上的趋势,均以小负重组表现更为明显,并且两种干预方式均具有显着的交互作用。提示:两种干预方式可以升高D-半乳糖造成的骨骼肌组织α-actin mRNA和IGF-I mRNA的低表达,降低GDF-8 mRNA的高表达。二、延缓衰老进程实验3月龄SD雄性大鼠60只,随机分为8组:6周安静对照组(C6)、6周模型组(M6)、12周模型组(M12)、造模后大负重组(B12)、造模后小负重组(S12)、造模后补肽组(P12)、造模后补肽大负重组(PB12)、造模后补肽小负重组(PS12),14月龄SD雄性大鼠8只作为自然衰老组(OC)。除C6组、M6组、M12组和OC组,其余各组在6周D-半乳糖造模后进行相应的负重训练和补充大豆多肽的干预。分别于6周末和12周末处死相应组大鼠,测试相关指标,结果如下:1. 6周组指标比较:与C6相比,M6组大鼠体重升高,腓肠肌总重量及相对重量均有降低的趋势,但均未达到统计学差异;血清SOD活力显着降低(P<0.05),血清MDA和骨骼肌脂褐素含量均显着升高(P<0.01);骨骼肌切片均出现不同程度的肌细胞萎缩或退行性改变特征。提示:造模成功。2. 12周一般指标:所有造模组和OC组大鼠均出现了衰老的外观特征,各干预组大鼠衰老特征较轻;所有组大鼠体重呈现自然增长趋势,各干预组大鼠其幅度明显趋缓(P<0.05),两种干预方式具有显着的交互作用;两种干预方式使双侧腓肠肌总重量显着降低(P<0.05和P<0.01),有显着的交互作用,腓肠肌相对重量有降低的趋势,无显着的交互作用;各组大鼠每日摄食量呈现平稳增长的趋势,两种干预方式使增长幅度趋缓,无显着的交互作用。提示:造模成功后,再进行两种方式的干预,可以有效延缓衰老进程中的外部特征。3. 12周骨骼肌组织切片:光镜下观察各组大鼠肌细胞形态有着不同程度的萎缩或退行性改变,以M12组和OC组变化最为明显,提示:造模成功后,再进行两种方式的干预,可以有效延缓骨骼肌衰老的进程。4. 12周血清学指标:与OC组相比,M12组大鼠血清SOD活力、MDA含量以及SOD/MDA、血清T含量、C含量以及T/C、血清GH和IGF-I含量均无显着性差异。负重训练或补充大豆多肽可以显着提高血清SOD活力以及SOD/MDA、T含量以及T/C、GH和IGF-I含量,降低血清MDA含量和C含量,多数以小负重组表现更为明显,并且两种干预方式都具有显着的交互作用。(P<0.05或P<0.01)提示:造模成功后,再进行两种方式的干预,可以减轻机体脂质过氧化和激素水平的紊乱。5. 12周骨骼肌组织生化指标:与OC组相比,M12组大鼠骨骼肌SOD活力、MDA含量及SOD/MDA、总蛋白含量和脂褐素含量均无显着性差异。负重训练或补充大豆多肽可以显着提高骨骼肌SOD活力及SOD/MDA、总蛋白含量,降低骨骼肌MDA含量和脂褐素含量,多数以小负重组表现更为明显,并且两种干预方式都具有显着的交互作用。(P<0.05或P<0.01)提示:造模成功后,再进行两种方式的干预,可以减轻骨骼肌组织脂质过氧化和肌蛋白合成的减少。6. 12周骨骼肌组织分子生物学指标:与OC组相比,M12组大鼠骨骼肌α-actin mRNA、IGF-I mRNA和GDF-8 mRNA表达均无显着性差异。负重训练或补充大豆多肽干预可以提高骨骼肌α-actin mRNA和IGF-I mRNA的表达,降低GDF-8 mRNA的表达,均以小负重组表现更为明显,并且两种干预方式都具有显着的交互作用。(P<0.05或P<0.01)提示:造模成功后,再进行两种方式的干预,可以升高骨骼肌组织α-actin mRNA和IGF-I mRNA的低表达,降低GDF-8 mRNA的高表达。结论1. 6周D-半乳糖皮下注射,可以成功复制大鼠亚急性骨骼肌衰老模型。可能的作用机制为:①增多血液中自由基;②增强骨骼肌氧化应激以及脂质过氧化;③增加骨骼肌脂褐素的沉积;④促使激素及相关因子的代谢紊乱;⑤降低骨骼肌α-actin和IGF-I mRNA的表达,提高骨骼肌GDF-8 mRNA的表达。2.负重训练或补充大豆多肽均可以有效的预防6周D-半乳糖造模过程中大鼠骨骼肌衰老过早的出现,以小负重训练效果最好,而且两种方式联合运用效果更为明显。3. 6周负重训练或补充大豆多肽的干预均可以对6周D-半乳糖造模后大鼠骨骼肌衰老有积极的延缓作用,以小负重训练效果最好,而且两种方式联合运用效果更为明显。4.负重训练和补充大豆多肽预防和延缓大鼠骨骼肌衰老的效果可能通过下列机制发挥作用:①减少血液中自由基;②减轻骨骼肌氧化应激以及脂质过氧化;③减少骨骼肌脂褐素的沉积;④纠正激素及相关因子的代谢紊乱;⑤提高骨骼肌α-actin和IGF-I mRNA的表达,降低骨骼肌GDF-8 mRNA的表达。
方彭华[5]2017年在《基于GALR2/GLUT4信号通路探讨黄芩苷干预胰岛素抵抗的作用及机制》文中提出研究背景:随着人民生活水平的提高,糖尿病已成为严重威胁人类生命健康的重要疾病之一。在我国大约有1.1亿糖尿病患者,其中90%以上是2型糖尿病。2型糖尿病主要病理特征是胰岛素抵抗。葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的膜转位障碍,是导致胰岛素抵抗的重要因素之一。骨骼肌承担了机体85%由胰岛素刺激引起的葡萄糖的转运,是影响机体糖代谢的最主要器官。因此,骨骼肌细胞膜上GLUT4的数量和活性,决定了机体对葡萄糖的摄取和胰岛素敏感性。我们过去的研究发现,脑室和腹腔注入甘丙肽,可以提高胰岛素敏感性。甘丙肽主要通过其叁个亚型受体(GALR)发挥作用,然而目前尚不清楚甘丙肽是否可以通过激活GALR2发挥调节胰岛素敏感性的作用。祖国医学将“糖尿病”归于“消渴”病范畴,认为2型糖尿病胰岛素抵抗主要病机是“阴虚燥热”,类似于《内经》中的“脾瘅”。《内经》论消渴病为“壮火食气”、“二阳结谓之消”、“胃热则消谷”、“甘者令人中满,肥者令人内热”等,强调“燥热”在消渴病发生发展过程中的作用。中医治疗2型糖尿病胰岛素抵抗在重视养阴益气的同时,特别强调清热治法。在清热类中药中黄芩是治疗本病常用药物。黄芩苷是中药黄芩主要成份之一,具有改善胰岛素抵抗、降低血糖的活性作用,但机制不清楚。黄芩苷增强胰岛素敏感性是否与激活GALR2有关以及其相关机制的研究国内外尚未见报道。研究目的:1、探讨GALR2干预胰岛素抵抗的作用机制。2、探讨黄芩苷干预GLUT4表达及膜转位的效应及机制。3、探讨GALR2是否介导黄芩苷降低胰岛素抵抗作用及其机制。研究方法:1、建立胰岛素抵抗小鼠模型、GALR2基因敲除小鼠模型以及GALR2沉默的L6细胞模型,结合GALR2特异性激动剂和拮抗剂,通过葡萄糖和胰岛素耐量实验,检测胰岛素抵抗指数的变化;ELISA法检测血浆中胰岛素的水平;流式细胞术检测L6细胞2-NBDG吸收率;Real-time PCR技术检测骨骼肌及L6细胞中GLUT4、PGC-1α表达水平;Western-blot法测定骨骼肌及L6细胞膜GLUT4蛋白含量以及细胞中PGC-1α、pAKT、pAS160、pP38MAPK水平;Westen-blot法测定AKT或P38MAPK抑制剂干预后L6细胞膜GLUT4蛋白含量;免疫组化和免疫荧光技术分别检测骨骼肌、L6细胞GLUT4表达形态学变化。2、通过黄芩苷干预胰岛素抵抗小鼠以及肌细胞,比较小鼠摄食、体重和血糖变化;通过葡萄糖和胰岛素耐量实验,检测胰岛素抵抗指数的变化;ELISA法检测血浆中胰岛素的水平;流式细胞术检测肌细胞2-NBDG吸收率;Real-time PCR技术检测骨骼肌及肌细胞中GLUT4、PGC-1α表达水平;Western-blot法测定骨骼肌及肌细胞膜GLUT4蛋白含量以及细胞中 PGC-1α、pAKT、pAS160、pP38MAPK 变化;Western-blot 法测定 AKT或P38MAPK抑制剂干预后肌细胞膜GLUT4蛋白含量;免疫组化和免疫荧光技术分别检测骨骼肌、肌细胞GLUT4表达形态学变化。3、运用GALR2基因敲除小鼠以及GALR2沉默的L6细胞,通过葡萄糖和胰岛素耐量实验,检测胰岛素抵抗指数的变化;ELISA法检测血浆中胰岛素的水平;流式细胞术检测L6细胞2-NBDG吸收率;Real-time PCR技术检测骨骼肌及L6细胞中GLUT4、PGC-1α表达水平;Western-blot法测定骨骼肌及L6细胞膜GLUT4蛋白含量以及PGC-1α、pAKT、pAS160、pP38MAPK变化;免疫组化和免疫荧光技术分别检测骨骼肌、L6细胞GLUT4表达形态学变化。研究结果:1、(1)与正常小鼠相比,胰岛素抵抗模型小鼠体重呈明显持续增加,小鼠多出现多饮、多尿等表现,后期小鼠出现嗜睡、眯眼、反应迟钝、毛枯黄稀少、大便干结、舌红等表现。小鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数显着增加,骨骼肌细胞GLUT4表达和膜转位水平以及AKT、AS160、P38MAPK磷酸化水平显着降低。(2)与模型对照组小鼠相比,M1145组小鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数显着降低,葡萄糖清除率及胰岛素反应性显着提高,骨骼肌细胞GLUT4、PGC-1α表达水平及AKT、AS160、P38MAPK磷酸化水平以及GLUT4膜转位水平显着增加。(3)与正常对照组小鼠相比,GALR2基因敲除小鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数显着增加,葡萄糖清除率及胰岛素反应性显着降低,骨骼肌细胞GLUT4、PGC-1α表达水平及AKT、AS160、P38MAPK磷酸化水平以及GLUT4膜转位水平显着降低。(4)体外实验发现,与正常对照组相比,M1145组细胞2-NBDG吸收率、GLUT4和PGC-1α表达水平及AKT、AS160、P38MAPK磷酸化水平以及GLUT4膜转位水平显着提高;(5)与M1145组相比较,GKOM1145组2-NBDG吸收率、GLUT4和PGC-1α表达水平及AKT、AS160、P38MAPK磷酸化水平以及GLUT4膜转位水平显着下降。(6)与M1145组比较,AKTIM1145组和P38IM1145组细胞2-NBDG吸收率和GLUT4蛋白含量显着下降。2、(1)与模型组小鼠相比,黄芩苷组小鼠摄食、体重、血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数均显着下降,葡萄糖清除率及胰岛素反应性显着增加,骨骼肌细胞GLUT4、PGC-1α表达水平及AKT、AS160、P38MAPK磷酸化水平以及GLUT4膜转位水平显着增加。(2)体外实验发现,与正常对照组相比,黄芩苷组细胞2-NBDG吸收率、GLUT4和PGC-1α表达水平及AKT、AS160、P38MAPK磷酸化水平以及GLUT4膜转位水平显着提高;(3)与黄芩苷组比较,AKTI黄芩苷组和P38I黄芩苷组细胞2-NBDG吸收率和GLUT4蛋白含量显着下降。3、(1)与黄芩苷组小鼠相比,M871+黄芩苷组小鼠胰岛素抵抗指数显着提高,葡萄糖清除率及胰岛素反应性显着降低,骨骼肌细胞GLUT4、PGC-1α表达水平及AKT、AS160、P38MAPK磷酸化水平以及GLUT4膜转位水平显着下降。(2)与GALR2基因敲除对照组小鼠相比,GALR2基因敲除黄芩苷组小鼠血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数、葡萄糖清除率及胰岛素反应性无明显变化,骨骼肌细胞GLUT4、PGC-1α表达水平及AKT、AS160、P38MAPK磷酸化水平以及GLUT4膜转位水平均无明显变化。(3)体外实验发现,与黄芩苷组相比,M871+黄芩苷组细胞2-NBDG吸收率、GLUT4和PGC-1α表达水平及AKT、AS160、P38MAPK磷酸化水平以及GLUT4膜转位水平显着下降;(4)与GKO对照组相比较,GKO黄芩苷组GLUT4、PGC-1α表达水平及AKT、AS160、P38MAPK磷酸化水平以及GLUT4膜转位水平均无显着改变。研究结论:1、高脂饮食模拟中医多食肥甘而致模型小鼠出现多饮、多尿的消渴病症状,检测的骨骼肌胰岛素抵抗指标均明显提高,结合高血糖和低葡萄糖耐量的病理特点,符合早期2型糖尿病胰岛素抵抗症状。在国内外首次证实激活GALR2能够通过P38MAPK/PGC-1αα/GLUT4和AKT/AS160/GLUT4信号通路,促进GLUT4表达和膜转位,改善胰岛素抵抗,表明GALR2是治疗胰岛素抵抗的新靶点。2、黄芩苷能够降低胰岛素抵抗小鼠血糖和胰岛素抵抗指数,增加肌细胞中PGC-1α表达水平以及AKT、AS160、P38MAPK磷酸化水平,提高GLUT4表达及膜转位水平。因此,在国内外首次发现黄芩苷能通过激活P38MAPK/PGC-1α/GLUT4和AKT/AS160/GLUT4信号通路改善胰岛素抵抗。这些结果初步明确了黄芩苷缓解胰岛素抵抗的作用靶点,丰富了中医清热治则的科学内涵,为中药黄芩临床治疗和新药开发奠定了药理学基础。3、在国内外首次证实黄芩苷通过激活GALR2促进P38MAPK/PGC-1α/GLUT4和AKT/AS160/GLUT4信号通路传导,增加肌细胞GLUT4表达和膜转位,改善胰岛素抵抗。因此,GALR2是黄芩苷降低胰岛素抵抗的重要作用靶点之一,为中药黄芩干预胰岛素抵抗现代机制研究开辟了一条新的思路,填补国内部分空白。
王世东[6]2007年在《清热益气中药配伍治疗2型糖尿病机制研究》文中研究说明随着社会经济发展,人们饮食热量摄入增多,体力活动相对不足,2型糖尿病的发病率和患病率也呈进行性增长趋势,其众多的患病人数和严重的并发症为社会带来沉重的医疗负担。胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是引起胰岛β细胞损伤并进一步导致2型糖尿病的重要原因,中医药改善胰岛素抵抗、保护胰岛β细胞功能是中医药治疗2型糖尿病很有希望取得突破的研究热点。目的本课题基于中医药治疗2型糖尿病的临床实践经验,在导师赵进喜教授的指导下,将《内经》“壮火食气”病机理论应用于2型糖尿病胰岛素抵抗导致胰岛β细胞损伤的中医药治疗理论研究和实验研究,提出2型糖尿病存在火热耗伤正气的病机,可采用“热者寒之”的治疗原则,应用清热益气治法进行治疗。选用临床有效的清热、益气中药配伍作为治疗药物,观察其对2型糖尿病IR和继发的β细胞功能损害的影响,探讨2型糖尿病“壮火食气”病机和清热益气治法的治疗作用机制,为建立中医药治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的新病机理论和治疗方法提供依据。方法1.文献综述:全面查阅近年来国内外2型糖尿病、胰岛素抵抗、胰岛β细胞损伤、过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)γ研究、实验性2型糖尿病IR动物模型的相关研究文献资料。对目前现代医学和中医学对于2型糖尿病IR的发病机理、治疗用药、研究方法,对于PPARγ的近期研究进展、动物模型的制作方法等进行了较为系统的综述和总结。2.理论研究:在中医理论指导下,选取胰岛素抵抗导致胰岛β细胞损伤作为中医药治疗2型糖尿病的切入点,综述了目前2型糖尿病中医临床治疗中的现状,并对胰岛素抵抗导致2型糖尿病发生发展的中医病机进行了探讨。由此,在以往研究的基础上提出了胰岛素抵抗进一步导致胰岛β细胞损伤的“壮火食气”病机假说和清热泻火与益气扶正相结合的治疗方法,以探索2型糖尿病发病的中医病因和病机,寻找有效的中医治疗方法。3.实验研究:以高脂高热量饮食喂养加小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法制作具有胰岛素抵抗特征的实验性2型糖尿病大鼠动物模型,以PPARγ配体盐酸吡格列酮作为阳性对照药,观察清热、益气中药配伍对实验性2型糖尿病大鼠糖代谢、脂代谢、胰岛素敏感性、胰腺病理形态学、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平、游离脂肪酸(FFA)水平和PPARγ基因表达等的影响。结果①建立动物模型:制作实验性2型糖尿病大鼠模型,该实验模型动物表现为高血糖、高胰岛素血症、高FFA和高水平TNF-α等特征,其胰岛素敏感指数(IAI)明显低于正常动物,不仅表现有胰岛素抵抗,且有部分胰岛β细胞功能受损,符合2型糖尿病临床特点。药物治疗后,相关检测指标均有不同程度的改善,用以评价药物疗效结果可信,可操作性强,死亡率低,成功率高,能够较好的模拟人类2型糖尿病病理生理特点。②药物作用研究:在成功建立实验性2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型的基础上,观察清热、益气中药配伍对于模型动物糖、脂代谢以及胰腺病理形态学的影响。糖代谢指标血清生化检测结果表明:清热、益气中药配伍能够明显降低模型动物空腹血糖水平,降低空腹胰岛素水平,改善胰岛素抵抗,其作用效果与对照药盐酸吡格列酮效果相当。脂代谢指标血清生化学检测结果表明:清热、益气中药配伍能够明显降低血清胆固醇、甘油叁酯、低密度脂蛋白-胆固醇含量,升高高密度脂蛋白-胆固醇含量,对脂肪代谢的调节作用与盐酸吡格列酮效果相当。胰腺组织HE染色结果显示:高脂高热量饲料喂养加小剂量STZ腹腔注射诱导的模型动物胰腺内胰岛数目较少,胰岛形态欠规则,细胞排列紊乱,伴有细胞缺失、塌陷,盐酸吡格列酮和中药治疗能减轻胰岛病理形态损害。胰岛β细胞免疫组织化学染色结果,模型动物胰岛β细胞胞浆中胰岛素染色颗粒减少,β细胞浅染,细胞排列松散,分布不规则,部分细胞呈空虚状态,在用药后上述病理变化有不同程度的改善。③作用机制研究:在药效学实验研究基础上,进行药物作用机制探讨。观察清热、益气中药配伍对实验性2型糖尿病IR大鼠血TNF-α水平的影响。结果显示:清热、益气中药配伍可以显着降低模型动物血TNF-α水平,效果与盐酸吡格列酮相似,提示清热、益气中药配伍可能通过降低TNF-α水平,解除由TNF-α导致的对脂肪和肌肉细胞葡萄糖转运子(GLUT)4的表达抑制、胰岛素受体自身磷酸化及第二信使的活化抑制、刺激脂肪分解以及对胰岛β细胞凋亡基因表达的调节等作用,从而改善胰岛素敏感性,减轻胰岛β细胞损伤。观察清热、益气中药配伍对实验性2型糖尿病大鼠血FFA水平的影响,结果显示:清热、益气中药配伍可明显降低模型动物血FFA水平,作用效果与盐酸吡格列酮作用相似,提示清热、益气中药配伍可能通过降低高FFA的脂毒性作用而达到改善胰岛素抵抗及糖、脂代谢的异常。采用Western blot蛋白印记分析方法研究清热、益气中药配伍对实验性2型糖尿病大鼠脂肪组织PPARγ蛋白质表达的影响,结果表明:清热、益气中药配伍可以上调模型大鼠脂肪组织PPARγ蛋白质表达,其作用与盐酸吡格列酮相似,提示清热、益气中药配伍治疗2型糖尿病的作用机制可能是通过激活脂肪组织中的PPARγ,上调其基因表达,降低FFA水平,改善血脂紊乱,抑制TNF-α等炎症因子,增强胰岛素敏感性,降低血糖,减轻由胰岛素抵抗导致的高血糖、血脂紊乱、高FFA、高TNF-α形成的糖脂毒性,减轻胰岛病理改变,保护胰岛β细胞功能。结论本研究从不同途径,多层次、多靶点研究清热、益气中药配伍改善2型糖尿病胰岛素抵抗保护胰岛β细胞功能的作用机制,初步揭示了2型糖尿病由胰岛素抵抗导致胰岛β细胞损伤的中医“壮火食气”病机特点和清热益气治法的作用机制,为中医药治疗2型糖尿病提供新的治疗理念和研究思路。
于洋[7]2018年在《脂肪源性含miR-27a外泌体通过抑制PPARγ诱导骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制研究》文中提出肥胖是导致2型糖尿病胰岛素抵抗的重要病理基础。研究表明肥胖患者血清中miR-27a含量显着高于正常体重人群,且与空腹血糖呈正相关。脂肪组织是肥胖状态下循环系统升高的miRNA主要来源,且主要以外泌体形式分泌,发挥生物学活性。而mi R-27a高表达于脂肪组织,且被认为能够通过抑制PPARγ进而抑制脂肪细胞的分化与脂质生成。此外,miR-27a已被证实能够以外泌体形式被乳腺癌细胞所分泌。骨骼肌是外周葡萄糖摄取的主要效应器官,而PPARγ是骨骼肌葡萄糖摄取信号通路关键信号分子IRS-1和GLUT4的核转录因子。因此我们推测,肥胖状态下血清中升高的miR-27a可能是脂肪细胞以外泌体形式所分泌,进而通过抑制骨骼肌组织PPARγ,诱导骨骼肌胰岛素抵抗。本研究通过收集临床肥胖儿童血清、高脂饮食喂养建立C57BL/6J肥胖小鼠模型及慢病毒干预miR-27a沉默小鼠模型、db/db小鼠模型、骨骼肌细胞过表达miR-27a模型、棕榈酸处理的脂肪细胞及脂肪细胞mi R-27a沉默上清液共孵育的骨骼肌细胞模型,明确miR-27a与肥胖胰岛素抵抗相关性,探讨miR-27a通过抑制PPARγ调控骨骼肌胰岛素的作用机制,阐明肥胖状态下,脂肪源性含miR-27a外泌体诱导骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制,揭示mi R-27a在肥胖诱导胰岛素抵抗中的关键作用。本论文研究内容包括叁个部分。第一部分探讨miR-27a是否参与调控肥胖胰岛素抵抗。本实验部分通过收集临床肥胖儿童血清、高脂饮食喂养建立C57BL/6J肥胖小鼠模型及慢病毒干预miR-27a沉默小鼠模型、db/db小鼠模型,检测血清miR-27a、血糖、胰岛素、糖耐量、胰岛素耐量等水平,观察骨骼肌miR-27a和IRS-1/Akt/GLUT4糖摄取信号通路蛋白表达,结果显示肥胖儿童血清miR-27a与肥胖程度、空腹血糖、Visfatin、TNF-α和IL-6等促炎因子呈正相关;肥胖小鼠血清和骨骼肌miR-27a水平随高脂喂养时程呈进行性升高,并与全身胰岛素耐量异常水平、糖耐量异常水平和骨骼肌胰岛素抵抗水平趋势一致;肥胖小鼠沉默miR-27a后,胰岛素耐量异常、糖耐量异常和骨骼肌胰岛素抵抗程度均有所恢复;肥胖小鼠骨骼肌葡萄糖摄取信号通路关键因子IRS-1和GLUT4表达显着降低,而沉默mi R-27a后,IRS-1和GLUT4表达有所恢复。结果表明血清和骨骼肌中miR-27a随肥胖进程而增加,且升高的mi R-27a参与调控肥胖胰岛素抵抗。第二部分探讨miR-27a通过抑制PPARγ诱导骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制。本实验部分检测了肥胖小鼠模型及慢病毒干预miR-27a沉默小鼠模型中PPARγ表达,并在C2C12小鼠骨骼肌细胞过表达mi R-27a并联合PPARγ激活剂罗格列酮,检测骨骼肌细胞糖消耗、糖摄取及葡萄糖摄取信号通路的变化。结果显示,肥胖小鼠骨骼肌PPARγ表达显著降低,而miR-27a沉默后,肥胖小鼠骨骼肌PPARγ表达有所升高;C2C12骨骼肌细胞过表达miR-27a后,PPARγ表达显著下降,骨骼肌葡萄糖摄取信号通路关键信号分子IRS-1和GLUT4表达显着下降,且胰岛素刺激下的p-IRS-1和p-Akt蛋白激活能力显着下降,细胞糖消耗、糖摄取能力显着下降,;C2C12骨骼肌细胞过表达mi R-27a并联合应用PPARγ激活剂罗格列酮后,PPARγ表达显著上调,骨骼肌葡萄糖摄取信号通路关键信号分子IRS-1和GLUT4表达显着上调,且胰岛素刺激下的p-IRS-1和p-Akt的蛋白激活能力有所上调,细胞糖消耗、糖摄取能力显着上调。以上结果说明肥胖状态下,骨骼肌miR-27a表达显着升高,且过表达的miR-27a能够引起骨骼肌细胞胰岛素抵抗,其潜在机制可能是通过抑制PPARγ。第三部分探讨脂肪源性的含mi R-27a外泌体能否通过抑制PPARγ诱导骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制。本部分实验首先在肥胖小鼠模型和棕榈酸处理的脂肪细胞模型中,检测脂肪组织和细胞miR-27a含量,并检验血清和上清液内miR-27a和FABP4含量变化,进一步提取血清和细胞上清液外泌体,扫描电镜和CD63进行外泌体鉴定,免疫荧光检测血清外泌体和FABP4及上清液内miR-27a和FABP4,验证脂肪细胞能够分泌含miR-27a外泌体。结果显示,肥胖小鼠从4w喂养后,脂肪组织miR-27a表达显着降低,肥胖小鼠血清和棕榈酸处理过的脂肪细胞上清液FABP4显着升高,肥胖小鼠血清外泌体呈FABP4阳性表达,且脂肪细胞外泌体呈miR-27a阳性共表达,并能够被骨骼肌细胞摄取,说明肥胖状态下,脂肪细胞能够分泌含miR-27a外泌体。本部分接下来检测肥胖小鼠骨骼肌FABP4含量,并利用棕榈酸处理的脂肪细胞上清液构建条件培养基孵育骨骼肌细胞,进一步沉默脂肪细胞内的miR-27a,并将沉默miR-27a后的脂肪细胞上清液构建条件培养基孵育骨骼肌细胞,检测孵育前后上清液FABP4和miR-27a含量,骨骼肌细胞FABP4和miR-27a含量,荧光标记外泌体后的骨骼肌摄取,及孵育48 h后,骨骼肌细胞糖消耗、糖摄取、PPARγ和葡萄糖摄取信号通路的变化,验证脂肪源性含miR-27a外泌体能够被骨骼肌摄取,并探讨其影响骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制。结果显示,肥胖小鼠骨骼肌及棕榈酸处理过的脂肪细胞上清液孵育后的骨骼肌细胞内FABP4含量显着升高,且孵育后上清液内的FABP4和miR-27a含量显着下降,棕榈酸处理过的脂肪miR-27a沉默细胞上清液孵育的骨骼肌细胞内miR-27a相较于棕榈酸未处理组无显着变化,棕榈酸处理过的脂肪细胞上清液孵育后的骨骼肌细胞糖消耗、糖摄取能力显着下降,PPARγ表达显著降低,且葡萄糖摄取信号通路关键分子IRS-1和GLUT4显着降低,且胰岛素刺激下的p-IRS-1和p-Akt的蛋白激活能力显着降低,而给予脂肪细胞miR-27a沉默后,上述指标均有所改善。结果表明,脂肪源性含miR-27a外泌体能够被骨骼肌摄取并诱导骨骼肌胰岛素抵抗,其潜在机制可能是通过miR-27a抑制PPARγ。因此,本课题阐明了1.MiR-27a在肥胖诱导的骨骼肌胰岛素抵抗中发挥重要作用;2.MiR-27a能够由脂质过度堆积的脂肪细胞以外泌体形式分泌,且能够被骨骼肌细胞所摄取;3.脂肪细胞以外泌体形式分泌的mi R-27a能够引起骨骼肌胰岛素抵抗,其潜在机制可能是通过mi R-27a抑制靶基因PPARγ引起骨骼肌葡萄糖摄取受损。本实验为脂肪组织与骨骼肌组织在肥胖模型中的交叉对话提供了新机制,为肥胖治疗、药物干预提供新靶点。
汤链[8]2013年在《黄连素改善1型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的机制研究》文中研究表明糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种因胰岛素绝对或相对不足而引起的新陈代谢慢性紊乱综合征。持续高糖、高脂及氧化应激等因素导致机体内胰岛素抵抗形成，从而加速糖尿病的发展与恶化。研究发现，黄连素能够通过降低血糖、血脂和氧化应激等改善胰岛素抵抗，但其具体机制尚不十分清楚。论文采用四氧嘧啶诱导1型糖尿病（T1DM）大鼠模型，观察黄连素对糖尿病大鼠体重与进食量、血糖、血清及肝脏甘油叁酯（TG）与丙二醛（MDA）、血清游离脂肪酸（FFA）含量的影响，通过Western Blot检测黄连素对糖尿病大鼠骨骼肌腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）及其下游乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、骨骼肌细胞葡萄糖转运蛋白酶4（GLUT4）蛋白活性的影响，初步探讨黄连素（通过激活AMPK信号通路）降糖调脂、改善胰岛素抵抗的作用机制，为黄连素应用于糖尿病的治疗提供一定的实验依据。研究结果显示经黄连素（200mg/kg/d）治疗9天后，黄连素治疗组相较于模型组，其进食量有所减少；各组体重增长值也有差异，黄连素治疗组体重增加量相较于糖尿病模型组有所提升；黄连素组空腹血糖、血清TG、FFA、MDA及肝脏TG、MDA含量均显着低于模型组；Western Blot检测结果显示，与正常组相比，模型组大鼠骨骼肌AMPK及其下游ACC的磷酸化水平、肌细胞膜上的GLUT4蛋白活性均明显下降，而黄连素组与模型组相比，大鼠骨骼肌AMPK及其下游ACC的磷酸化水平明显上升、骨骼肌细胞GLUT4蛋白向细胞膜转位量显着增加。因此，黄连素能够显着降低四氧嘧啶诱导1型糖尿病大鼠空腹血糖，抑制血清及肝脏中的脂质过量堆积，降低肝脏氧化应激水平，这一作用可能是通过激活AMPK及其下游ACC信号、介导GLUT4蛋白向细胞膜转位而实现的。
参考文献：
[1]. 黄连人参对药改善2型糖尿病胰岛素抵抗机制研究[D]. 姜淼. 北京中医药大学. 2006
[2]. 运动地P53调节能量代谢信号通路相关基因表达的影响[D]. 邵月. 华东师范大学. 2010
[3]. 芪蓝糖脂宁胶囊复方再优化研究及其糖脂双调的机理探讨[D]. 欧丽娜. 北京中医药大学. 2007
[4]. 负重训练和补充大豆多肽干预大鼠骨骼肌衰老效果及机制研究[D]. 刘丰彬. 河北师范大学. 2009
[5]. 基于GALR2/GLUT4信号通路探讨黄芩苷干预胰岛素抵抗的作用及机制[D]. 方彭华. 扬州大学. 2017
[6]. 清热益气中药配伍治疗2型糖尿病机制研究[D]. 王世东. 北京中医药大学. 2007
[7]. 脂肪源性含miR-27a外泌体通过抑制PPARγ诱导骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制研究[D]. 于洋. 吉林大学. 2018
[8]. 黄连素改善1型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的机制研究[D]. 汤链. 湖南大学. 2013