（长沙医学院基础医学院医学生物细胞学教研室 湖南长沙 410219）
[摘要]：目的：三七总皂苷对胃癌侵袭能力的影响及机制研究，探讨三七总皂苷抗肿瘤作用的机理，为三七总皂苷作为抗肿瘤药物开发提供理论依据。研究方法：本项目研究应用临床样本在体研究MMP-9/TIMP-3-MAPK是否是TSPN发挥抗癌作用的主要通路。选择细胞模型进一步研究TSPN抗癌作用及分子机制。通过形态学检测、体外细胞培养、Transwell侵袭实验，随机计数10个视野内的细胞数，计算平均值与标准差。实验重复3次。侵袭抑制率% =(对照组穿膜细胞数—处理组穿膜细胞数)/对照组穿膜细数×100%。结论：三七总皂苷对胃癌侵袭能力预防疗效较为显著，值得临床应用。
[关键词]三七；胃癌；侵袭能力
胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，每年约有64万人因胃癌死亡，居癌症死因的第2位。在我国，胃癌也是最常见的恶性肿瘤，占全部肿瘤的1/3，占消化道肿瘤的1/2，其死亡率居恶性肿瘤的首位。临床统计，约有80%以上的肿瘤病人死于肿瘤的侵袭与转移。肿瘤侵袭转移的过程虽然很复杂，但其基本步骤包括压力的作用，癌组织的黏附性降低，癌细胞的迁移，细胞黏附分子的作用和细胞外基质的降解[1]。为改善疗效，笔者采用三七总皂苷对胃癌侵袭能力影响疗效的治疗，现报道如下。
1.资料与试剂
1.1细胞株：人肝癌细胞购自上海复旦大学细胞库三七总皂苷：购于上海科兴生物科技有限公司，用双蒸水配成母液（浓度8000mg/L），-20。C保存。实验时用双蒸水稀释。
1.2主要试剂：各类试剂盒，抗体;神经元培养基及培养液; 各类缓冲液;PVDF膜等。
2.方法
2.1形态学检测方法
a、免疫组织化学方法 荧光双标标记胃癌组织，检测MMP-9、TIMP-3的表达和ERK的表达；
b、Western blot技术 检测胃癌组织ERK和pERK的表达。
2.2体外细胞培养
用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液培养SGC7901细胞于37℃，含5%CO2的恒湿培养箱中。细胞呈单层生长，铺满培养瓶后传代。传代时常规吸去培养液，用2.5g·L-1胰蛋白酶消化，在显微镜下观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，立即倾去胰酶，加适量含血清培养液吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度用于实验。划痕试验：将2×106个SGC7901细胞接种在6孔板，常规培养至90%的融合状态。用无血清培养液洗细胞3次，加入新鲜的无血清培养基；用10µl Eppendorf Tip在细胞板上划痕，用无血清培养液洗细胞3次，加入新鲜的无血清培养基；加入不同浓度（0，10、20、30、40、50mg·L-1）的tspn，放入37度5%CO2培养箱，培养24 h,48h,72h；按24h,48h,72h取样，拍照。测量划痕的距离，计算平均值与标准差。以未加DADS组为对照，进行组间比较。实验重复3次。
2.3 Transwell侵袭实验
体外细胞侵袭实验采用Transwell培养板，迁移孔上下槽间为直径6.3mm,孔径8.0μm的多聚碳酸膜。具体的步骤：基质胶准备：将冻存于－80℃冰箱的BD matrigel 4度过夜（24h），变成液态；将Transwell放在24孔板内，BD Matrigel（5mg/ml），用无血清培养基以1：9稀释，在Transwell嵌套上层均匀铺50μl稀释的Matrigel，37°C放置过夜；当出现“白色层”时，说明已经变为固态。消化细胞，无血清培养基洗3次，细胞活力计数仪计数，用含0.1%BSA的无血清培养基配成1.0×106个/ml细胞悬液；在上室每孔加入100μl DMEM无血清培养基,洗 Matrigel 1次；下腔室中加入500μl含有10％FBS条件培养基；在上室每孔加入100μl细胞悬液，即每孔1.0×105个细胞；加入TSPN，将细胞放入37℃培养箱中孵育24h； 取出transwell用PBS洗2遍，室温4%多聚甲醛固定10min；移去transwells,倒置，风干；加入结晶紫（0.1%）染色20min，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。以每个400倍高倍视野侵袭至滤膜下表面的细胞数目的多少反映肿瘤细胞侵袭能力的高低。随机计数10个视野内的细胞数，计算平均值与标准差。实验重复3次。侵袭抑制率% =( 对照组穿膜细胞数—处理组穿膜细胞数) /对照组穿膜细数×100%。WB/PCR法：检测MMP-9、TIMP-3的表达和ERK、pERK的表达
2.4 统计学处理
所有数据采用SASS20.0统计软件包进行处理，所得到的数值以“x+s表示，
组间采用重复测量方差分析，多个实验组均数之间比较采用t检验和方差分析，
以a=0.05为检验水准，P<0.05认为有统计学差异。
3.结果
3.1三七总皂苷对细胞的形态的影响
经不同浓度三七总皂苷作用后的细胞，可见细胞生长稀释，贴壁细胞减少，细胞之间的连接密度降低，细胞相互分离，悬浮细胞增多，细胞变小、变少，细胞核皱缩破裂，细胞内颗粒物质增多，培养液中可见细胞碎片。其中，尤以经浓度为三七总皂苷药物组处理后的细胞形态改变最为明显。见下图。
附图1 正常胃黏膜组织中MMP-9的表达情况;附图2三七总皂苷作用后的胃癌黏膜组织中MMP-9的表达情况
3.2 WB/PCR法检測三七总皂苷对MMP-9细胞增殖的影响
三七总皂苷能抑制MMP-9细胞的增殖，细胞经不同浓度三七总阜苷分别作用24h、48h、72h后，药物组细胞的增殖抑制作用明显且差异有统计学意义（P<0.01)，并且具有明显浓度依赖性，随浓度增加抑制作用更明显。从到三七总皂苷的作用具有时间依赖性，随时间延长，作用更明显。表1所示。
4.讨论
肿瘤细胞的侵袭、转移是恶性肿瘤最显著地生物学特性，直接影响肿瘤患
者的预后，也是癌症治疗的最大障碍，其过程十分复杂，主要涉及肿瘤细胞、宿
主细胞以及细胞外基质间一系列复杂的相互作用，即肿瘤细胞外基质的粘附、细胞外基质与基底膜的降解以及肿瘤细胞的运动[2-3]。肿瘤侵袭转移的过程虽然很复杂，但其基本步骤包括压力的作用，癌组织的黏附性降低，癌细胞的迁移，细胞黏附分子的作用和细胞外基质的降解[4]。基质金属蛋白酶9 (MMP-9)能降解细胞外基质中的主要成分Ⅳ型胶原，在肿瘤向周围组织浸润并侵入血管、淋巴管远隔转移中发挥重要作用[5]。TIMP-1是其组织抑制因子，能抑制MMP-9活性，对肿瘤的转移起抑制作用。MMP- 9的过表达与肿瘤的浸润深度，淋巴转移及器官的转移密切相关，说明MMP-9的过表达可能是细胞恶变后获得的一种有助肿瘤细胞浸润转移的能力，MMP-9的上升促进了胃癌的转移肿瘤的生长和转移必须依靠新生血管提供足够的营养才能实现[6-7]。在肿瘤形成早期，可诱导内皮细胞产生组织因子和金属基质蛋白酶等基质溶解酶，使凝血酶原转化为凝血酸，从而激活明胶酶原降解基质膜，有助于肿瘤细胞的侵袭转移。TSPN通过下调MMP-9，上调TIMP-3，由MAPK传导通路介导，抑制人胃癌细胞SGC7901的增殖、迁移与侵袭，阐明其作用的分子机制，证实TSPN抑制人胃癌细胞增殖、迁移与侵袭的作用，为开发抑制胃癌侵袭与转移的新药提供新靶点。
参考文献
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论文作者:郑建军 盛力翔 熊文武 龚厚武
论文发表刊物:《中国医学人文》2019年第10期
论文发表时间:2019/10/31
标签：细胞论文; 胃癌论文; 肿瘤论文; 基质论文; 作用论文; 皂苷论文; 血清论文; 《中国医学人文》2019年第10期论文;