段毅涛[1]2012年在《大肠杆菌中多顺反子表达人血小板因子4》文中提出血小板第4因子(platelet factor4, PF4)是CXC趋化因子家族中的一员，储存于血小板α颗粒，血小板活化后得以释放。除了肝素中和作用外，PF4有多种生物功能：对人单核细胞和中性白细胞的趋化性，参与成纤维细胞的黏附，免疫调节和抑制肿瘤细胞的生长等。PF4属于小分子多肽，在体内易降解，半衰期短，因此其克隆、表达等常遇到一些困难，在一定程度上制约了其工业化生产。本文采用多顺反子串联表达策略，提高PF4的表达量，为其工业化生产、深入研究和临床应用奠定基础。首先，根据优化后的人PF4DNA序列设计引物，重迭PCR得到人PF4DNA序列，连接T载体；其次，又设计串联单位、第一串联单位和相应引物，重迭PCR获得串联单位和第一串联单位的DNA序列，分别连接T载体，标记为pEASY-T1-PF4和pEASY-T1-f PF4；再次，用同尾酶对质粒pEASY-T1-PF4和pEASY-T1-f PF4酶切、连接，得到质粒pEASY-T1-2f PF4；同理，对质粒pEASY-T1-PF4和pEASY-T1-2f PF4酶切、连接，可得质粒pEASY-T1-3f PF4；依次循环可得pEASY-T1-nfPF4(n=4,5,6)；最终，双酶切质粒pBV220、pET28a(+)和pEASY-T1-nf PF4(n=1,2…6)，分别连接大小片段，连接产物分别转化E. coliDH5α和BL21(DE3)，获得工程菌E. coli DH5α/pBV220-nf PF4和E. coliBL21(DE3)/pET28a(+)-nf PF4(n=1,2…6)。工程菌E. coli DH5α/pBV220-nf PF4经诱导表达，重组PF4蛋白没有表达或表达极少；工程菌E. coliBL21(DE3)/pET28a(+)-nf PF4培养至OD_(600)约为0.6时，加入终浓度为0.6mM的IPTG，在23°C下诱导表达12小时，PF4包涵体和可溶性蛋白均有产生；SDS-PAGE电泳和Western blot检测全菌蛋白时，发现随着拷贝数的增加，表达逐渐增加，至4个拷贝时，趋于平衡，其中工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-nfPF4(n=4,5,6)中，重组PF4分别占菌体总蛋白的44.45%、44.03%和43.28%。选工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-4f PF4诱导表达，上清可溶性蛋白经Ni亲和纯化柱和凝胶脱盐柱后其纯度可达95%以上；纯化的融合蛋白经肠激酶酶切和质谱鉴定，确为PF4。用集落形成试验验证重组人PF4的活性，发现融合蛋白可抑制HEL细胞集落的形成，抑制率为55.6%。本论文从解决重组小分子多肽药物产量低、纯化困难和纯化后的目标产品末端不能完全忠实于野生型氨基酸序列等技术难题入手，有效地改进了PF4生产工艺，同时也为其它小分子多肽药物生物合成提供了崭新的思路。
杨岚, 陈衍, 陈苏民[2]2005年在《重组人血小板因子4基因的克隆、表达、纯化与活性初步鉴定》文中提出目的血小板因子4(platelet factor 4,PF4)作为一个多功能趋化因子,具有潜在的应用前景。除了趋化因子共有的调节炎症反应和介导免疫应答外,更主要的是一种造血及血管生成的负性调控因子。PF4可优先同体内血管生成活跃的组织部位结合,这为肿瘤的靶向治疗提供可能。本研究的目的是对人PF4(hPF4)基因克隆、表达、纯化及活性分析,以获得有活性的hPF4。方法首先人工合成了hPF4 cDNA的两条寡核苷酸链,经PCR一轮反应,得到PF4基因的全长模板。再合成重组人PF4基因的扩增引物,经PCR大量扩增PF4基因。PF4基因扩增产物经纯化后,克隆人大肠杆
陈衍[3]2002年在《重组人血小板因子4基因的克隆、表达、纯化和活性初步鉴定》文中认为血小板因子4(platelet factor4，PF4)属趋化性细胞因子CXC亚家族，分子量为7767，基因定位于4号染色体长臂。它在巨核细胞中合成，在α颗粒中包装，在血小板粘附、聚集等活化状态时以高分子量蛋白多糖-PF4复合物的形式从血小板中释放。 PF4具有多种生物学功能。其除了趋化因子共有的调节炎症反应和介导免疫应答外，更主要的是一种造血及血管生成的负性调控因子。PF4能降低正常造血干细胞对化疗药物的敏感性，其机制是可逆性地抑制细胞增殖，将细胞阻止在S期，同时还可保持其活力，而对肿瘤细胞生存能力及化疗敏感性没有明显作用。因此PF4可用于临床作为治疗肿瘤时造血细胞的防护剂。PF4还是一种血管生成的抑制因子。已证实PF4在体内有抑制实体肿瘤生长的作用，就是通过抑制肿瘤诱导的血管新生机制来抑制肿瘤生长。PF4可优先同体内血管生成活跃 第四军医大学硕士论文的组织部位结合，这为肿瘤的靶向治疗提供可能。 本研究的目的是对重组人 PF4（rhPF4）基因克隆、表达、纯化及活性分析，以获得有活性的rhPF4，为下一步的深入研究和临床应用奠定基础。 本文首先人工合成了 rhPF4 cDNA的两条寡核茸酸链，经 PCR一轮反应，得到PF4基因的全长模板。再合成rhPF4基因的扩增引物，经PCR大量扩增PF4 g因。PF4基因扩增产物经纯化后，克隆入大肠杆菌克隆载体 pUC中，筛选带有插段的阳性克隆，经序列测定，证实基因正确无误。再将测序正确的PF4基因亚克隆入大肠杆菌融合表达载体pGEXAT3中，经酶切鉴定后将重组表达载体命名为pGEX－4T）PF4。将 pGEXAT3fF4转化大肠杆菌 DH5a，用 lmmol／L IPTG于 37T 4小时诱导 pGEX－4T3－PF4的表达，并进行 western blot t＊变分析和蛋白表达形式分折石DS－PAGE结果表明：重组表达载体pGEX－4T3．PF4在大肠杆菌DH5a中得到表达，表达产物GSTPF4融合蛋白分子量约为34 KDKD，与二者分子量之和相符。光密度扫描结果表明，GSTPF4融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的 20％。western blot印迹检测到了该融合蛋白的特异存在，而以空白菌株作为对照的泳道上则无任何杂交带。通过对不同裂菌组分的电泳分析发现，表达蛋白均以包涵体形式存在。 为使包涵体形式表达的GSTPF4融合蛋白以可溶形式分泌，本文尝试了改变诱导条件。我们首先将宿主菌改为BLZI（DE3卜并用WTG低温诱导（28－30℃），SDS－PAGE结果表明，表达产物有50O出现于细菌外周质中，为可溶性。接着本文利用 Glutathione Sepharose 4B对可溶性表达的GSTPF4 融合蛋白直接进行亲和层析纯化，再利用GSTPF4融合表达蛋白上的凝血酶识别位点，用凝血酶将GST从目的 ．4． 第四军医大学硕士论文蛋白的N段切除。将纯化后的蛋白进行蛋白定量，结果表明所得到的蛋白浓度约为0329／L。本文还采用鸡胚尿囊膜血管生长抑制模型 （CAM）进一步对纯化复性后的 rhPF4进行初步的活性鉴定。实验结果表明，本实验所得到的dF4对CAM血管生长具有抑制活性。 PF4作为一个多功能趋化因子，具有潜在的应用前景，随着其竹用机制的进一步阐明，它可能会成为一种有效的临床药物。以上买验结果表明rhPF4cDNA基因己成功扩增、克隆，并在融合表达载体中获得可溶性表达，表达产物得到有效纯化，纯化后初步鉴定其具有生物学活性，为进一步研究其机制及其临床应用奠定了基础。
佚名[4]2002年在《作者索引》文中认为(按汉语拼音字母顺序排列,索引论文前3位作者)AAdrian W Gelb Development 0f anaesthesiology (15):1 345一1346艾玉峰应用带蒂皮瓣、肌皮瓣修复小腿骨外露、骨髓炎创面 (2):183 组织工程骨复合骨
张俊芳[5]2002年在《人血小板因子4（hPF4）原核高效表达体系的构建、纯化及特性研究》文中研究指明目的 1 人血小板因子4(h PF4)原核高效表达克隆的构建 2 重组h PF4的表达及分离、纯化工艺研究 3 重组h PF4的特性研究 方法 根据原核细胞表达真核蛋白的基因表达调控特点，设计合成一对特异引物，在PT7-7-r PF4表达质粒的基础上，应用聚合酶链式反应(PCR)对其c DNA进行改造，通过DNA重组技术构建成重组h PF4原核表达质粒PBV220-r hPF4，用快速PCR检测法、DNA测序分析，鉴定重组h PF4表达质粒的正确性。 PBV220-r hPF4用氯化钙法转化大肠杆菌DH5 α、BL21(DE3)，温控诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE、Western-blotting鉴定表达产物。采用超声结合溶菌酶法破碎大肠杆菌，分析蛋白表达形式，可溶性重组蛋白部分用肝素—琼脂亲和层析、RP-HPLC纯化重组h PF4，非可溶性部分经包涵体分离、洗涤纯化。研究重组h PF4的复性条件，采用空气氧化法使重组h PF4正确重折迭。采用鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验观察重组h PF4的血管生成抑制活性及复性效果。 结果 1 DNA测序证明PBV220-r hPF4表达质粒构建成功。PCR扩增得到的h PF4基因片段去除了h PF4 c DNA 3末端AT富含的侧翼区序列，原终止密码子TAG定位突变为原核系统强的串联终止密码子TAATAA，3端设有SalⅠ位点，5、末端设有EcoR Ⅰ、NcoⅠ位点，h PF4基因片段以EcoR Ⅰ/SalⅠ位点定向插入PBV220载体。 山西医科大学2002届硕士学位论文 一 2 DHS a／PBV220－r hPF4经温控诱导表达后，SDS－PAGE及凝胶密度扫描分 析，表达产物占总国体蛋白的25－30％，凝胶迁移特性与hPF4标准品相同。 Western－blotting检测表达产物与兔抗人 h PF4抗体发生特异的抗原抗体反 应。表明我们成功构建了hPF4原核高效表达体系。 3 超卢结合溶由酶法破碎人肠杆菌后，经分析 r hPF4主要以包涵体的形式存＿在，包涵体经洗涤液I uOmMTrk－mPhs．趴10OmMN＊m：0．5mME0T儿 ZM瞧：0．2％TritonX－100 0．2％DOC）洗涤，再经洗涤液 11（50mol几，PH80 Trk．C卜mo＊M N＊m 山．5＊M EDTA：4M尿素：0．2％（Vv）Tr讨。＊x－100 0．2％DOC）溶解包涵体沉淀。r hPF4纯度可达 85％ 以上。r hPF4 E透析的 同时，采川立气氧化法，加以 Cu‘至终浓度川”mol／1加速空气氧化，使 r hPF4 上确显折迭。 4 鸡胚绒毛尿素膜血管生成抑制实验测定复性后的rhPF4的生物学活性，初 步结果显示：rhPF4具有野生蛋白抑制血管生成的活性。 结论 本研究运用 PCR定点突变技术，完全去除了 hPF4 cDNA基因 3”端 UTR AT 富含区：改用大肠杆菌强串联终止密码子T AAAATAA，成功构建高效表达克隆 PBV220－rhPP4。我们构建的r hPN原核高效表达系统经m－PAGE及凝胶密度 扫描分析结果表明，r hPF4表达量占菌体总蛋白量的 25－30％，较原表达克隆 PT7－7／r h PF4提高了近80倍，经快速高效的包涵体分高纯化工艺和复性工 艺，rhPF4具有野生蛋白活性。本研究为rhPF4的结构与功能关系研究及规模 化生产奠定了坚实的基础，也为真核蛋白在原核细胞中的表达调控机理提供 了理论依据。
佚名[6]2003年在《作者索引》文中进行了进一步梳理第四军医大学学报(J Fourth Milit Med Unsv)2003年24卷索引AAdrian T.TINGB细胞成熟抗原BCMA在细胞内诱导NF-KB的活化(19):1729一1732CClaus H.Schroder慢性乙肝病毒感染的诊断和治疗
郑小坚[7]2003年在《猪瘟病毒囊膜糖蛋白E_2基因融合表达载体的构建及初步表达》文中提出猪瘟病毒(CSFV)囊膜糖蛋白E2是CSFV的主要保护性抗原，可诱导产生中和抗体和保护性免疫。本研究将CSFV F114株的E_2基因克隆进GST融合原核表达载体pGEX-4T-1的EcoRI和BamHI位点，获得重组原核表达载体pGEX-4T-E_2。以大肠杆菌BL21为宿主菌进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示，在约63kD处有一特异性条带，其分子量与由目的基因所推导的蛋白质分子量相符，推测为E_2与GST融合表达基因产物。将E_2基因克隆进杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californiamultiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)转移载体pAcSecG2T的EcoRI和BamHI位点，获得了带有核型多角体病毒囊膜蛋白gp67信号肽序列与GST-E_2融合表达杆状病毒重组转移载体pAcSecG2T-E_2。在脂质体的介导下，pAcSecG2T-E_2载体与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6共转染家蚕培养细胞Bm-N，空斑筛选分离纯化重组病毒(Bm-BacPAK6-E_2)。PCR检测表明所分离的重组病毒含有目的片段E_2基因。SDS-PAGE检测表明，在感染重组病毒后，无论是家蚕细胞，还是家蚕幼虫、蛹的血淋巴中都可以检测到一条分子量约为63kD的特异性条带，推测为外源基因的表达产物。本研究在原核细胞与家蚕杆状病毒表达系统中均成功地融合表达了CSFV F114E_2基因，为进一步纯化表达的E_2抗原蛋白和CSFV诊断试剂的开发应用奠定了基础，为研制CSFV新型亚单位疫苗进行了有益的探索。
郭文忠[8]2000年在《食管癌血管形成及抗血管治疗的实验研究》文中指出食管癌是我国常见的一种恶性肿瘤，尽管其早期诊断、手术治疗及放化疗取得了较大进展，但其长期疗效仍不满意，复发和转移率较高，因此迫切需要研究新的治疗策略，以改善患者的长期生存率。大量的研究证实实体肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤的血管形成，抗血管治疗为肿瘤的治疗提供了一种新手段。本课题首先研究了血管形成及其主要调节因子在食管癌中的作用，在此基础上探讨了食管癌抗血管治疗的策略和作用。 食管癌中血管形成主要调节因子的研究： 利用RT-PCR或免疫组化的方法研究了56例食管癌组织中血管形成主要调节因子VEGF、MMP-9、Endostatin的表达与食管癌中血管形成及临床的关系。结果显示在食管癌中VEGF的表达显着高于癌旁组织，VEGF的表达与肿瘤内血管形成密切相关，VEGF表达及肿瘤中血管密度计数与食管癌的进展和淋巴结转移也密切相关，表明VEGF在食管癌血管形成和转移中起重要作用，VEGF可以作为抗血管治疗的靶点，用于食管癌的治疗。 在食管癌中MMP-9的表达显着高于癌旁组织，但MMP-9的表达与食管癌中的血管密度计数没有相关性，MMP-9表达与食管癌的临床病理指标之间也没有相关性。本研究还表明在食管癌中缺乏血管形成抑制因子Endostatin的表达。 用ELISA的方法测定了低氧对食管癌细胞系中血管形成调节因子表达的影响，发现低氧可以显着增加食管癌细胞系中VEGF的表达，表明低氧可能通过调节VEGF的表达在食管癌血管形成过程中起重要作用。同时还发现低氧对食管癌细胞系中MMP-9的表达影响不显着。 血管形成抑制因子Endostatin的克隆及治疗食管癌的实验研究： 应用RT-PCR方法从胎儿肝脏组织中克隆了血管形成抑制
何小平[9]2006年在《重组人Canstatin蛋白及溶瘤腺病毒He-Cans治疗胰腺癌的实验研究》文中提出本课题旨在将抗血管生成治疗与基因治疗相结合,探讨胰腺癌治疗新策略。首先利用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从人胎盘组织扩增出新的血管生成抑制剂基因canstatin,插入质粒pET-22b(+)构建原核表达载体pET/canstatin,转化大肠杆菌,在IPTG诱导下表达出重组人Canstatin蛋白,体内实验证实其能通过抑制血管生成有效抑制胰腺癌生长。继而,将canstatin基因插入载体pCA13和pXC7C,构建出穿梭载体pCA13-Cans和pXC7C-Cans,再分别与pBGHE3共转染293细胞,获得重组非增殖型腺病毒Ad5-Cans和增殖型腺病毒(溶瘤病毒)He-Cans。体内外实验证实,溶瘤病毒He-Cans能有效抑制胰腺癌生长,疗效强于Ad5-Cans和Canstatin蛋白,且副作用少,具有良好临床应用前景。其作用机制主要是:①表达Canstatin蛋白,抑制肿瘤新生血管形成;②在肿瘤细胞中特异性增殖并裂解肿瘤细胞,从而发挥溶瘤作用。
亓民[10]2010年在《腺病毒介导canstatin基因抑制肝癌的实验研究》文中进行了进一步梳理原发性肝癌是全球发病率很高的恶性肿瘤之一,目前据世界卫生组织统计,全世界每年新发现病例超过26万人,肝癌的发病率和死亡率均占我国癌症中的第叁位。肝癌的发生经过多个环节调控,由启动、促癌和发展等多个步骤形成,涉及多个基因参与和突变,最终导致肝细胞由不典型增生直到肝细胞癌变,病因并不完全清楚。目前大部分研究认为肝细胞癌的发生与肝硬化结节、乙型和丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素、基因变异和地理环境因素密切相关。由于原发性肝癌经血及淋巴液转移早,局部侵润性强,多数确诊时已经发展到了中晚期,预后较差。绝大多数肝癌患者在明确诊断时往往已进入中、晚期,癌细胞已经在肝脏内外发生广泛的转移,虽然手术、介入、化疗及放疗等传统治疗手段在肝癌治疗方面取得一些重大进展,但肝癌患者的近期生存率和远期预后没有明显改善,因此,寻找新的治疗方法成为了临床医生和科研工作者最关注的问题。目前除了医院常用的传统手术、化疗和放射治疗之外,随着基因工程技术的日益成熟,许多医院逐渐开展了各种各样的基因介导治疗,这些基因治疗技术包括自杀基因治疗、免疫基因治疗、导入抑癌基因治疗、抗肿瘤血管基因治疗等等,其中以腺病毒介导抗肿瘤血管基因治疗方法已经成为目前的研究热点之一。早在二十世纪七十年代,Folkman首次提出了恶性肿瘤生长依赖于新生血管的形成,新生血管供给恶性肿瘤生长所需的营养,这种观点随后被大量研究证实。当肿瘤直径达到1mm时,如果没有新生血管支持其生长,肿瘤便进入休眠期或退化,如果新生的血管长入肿瘤组织,肿瘤将会快速生长达到失去控制的体积。新血管提供给肿瘤氧和各种营养并带走代谢废物。因此,抗肿瘤血管生成治疗可以直接切断肿瘤生长转移所依赖的营养供给,此种方法现在已成为肝癌研究领域新亮点。近年研究表明新生血管形成仅在少数组织中存在,除了女性生殖子宫内膜、胎盘组织和伤口修复等部位发生短暂的新生血管的现象,体内的血管系统大部分时间是保持静止状态的,体内的部分组织中血管是否发生主要取决于局部促血管发生因子和血管抑制因子之间的平衡状态。一方面促血管生长因子的上调促进血管生成,另一方面血管生长抑制因子水平的下调抑制血管生成。目前研究证明所有内源性血管生长抑制因子都能够抑制动物模型体内的肿瘤生长,但是直接应用血管生成抑制因子治疗恶性肿瘤目前仍面临许多问题：1)需要长期应用血管生成抑制因子；2)当大剂量应用可能会对人体产生有害的免疫反应。3)生产成本高导致巨额治疗费用使病人难易承担。基因治疗是通过生物载体或非生物技术将目的DNA或RNA转移到宿主细胞中使其能够有效的进行表达,即在宿主细胞内合成重组蛋白,作用于局部组织而发挥抗肿瘤的治疗作用。这种基因治疗的优点是：1)借助外源基因的导入,使宿主细胞本身可以合成重组蛋白,从而减少了生产成本；2)基因治疗是将目的基因导入肿瘤细胞内,使其能够有效表达,在肿瘤局部区域重组蛋白含量增多,明显提高治疗效果。如今,全世界正在进行的二百多个临床基因治疗试验项目中约有半数是针对于恶性肿瘤治疗的,而这其中又有一半的基因疗法又都是针对肿瘤细胞本身。目前应用抑制血管生成的基因治疗直接针对血管内皮细胞,因为血管内皮细胞遗传性十分稳定,目的基因可以在人体内稳定地表达数月或数年,并且这种基因治疗载体要比制造大量高纯度的蛋白质容易和减少许多花费。目前,腺病毒作为基因治疗中常用的载体工具,具有外源基因表达高效及转染率高等优点,重组腺病毒在局部肿瘤组织中大量表达重组蛋白,在局部抑制肿瘤血管的生成,同时腺病毒感染肿瘤细胞还能诱发宿主抗肿瘤免疫反应,可以从多种方面发挥抗肿瘤作用。近年,研究者发现了一种新的内源性血管生成抑制因子——canstatin蛋白,canstatin蛋白源于Ⅳ型胶原a2链C端非胶原区(NC1)结构域,对内皮细胞的增殖和迁移具有明显的抑制性作用,可诱导内皮细胞调亡,从而发挥抑制新生血管形成及其生长的作用。研究显示,canstatin蛋白可以明显抑制裸鼠人肾癌、前列腺癌、食管癌及卵巢癌的生长,但是canstatin蛋白对肝癌的抑制作用如何,由腺病毒介导的canstatin基因对人肝癌的治疗作用如何?这些问题目前国内外尚未见报道。在本研究中我们首先克隆了人canstatin基因,并构建了其原核表达载体和重组canstatin蛋白,继而证实了canstatin蛋白抑制肝癌生长的作用,然后我们又构建了携带canstatin基因的腺病毒载体,最后将携带canstatin基因的重组腺病毒注入小鼠肝癌移植瘤中,观察小鼠肝癌移植瘤体积变化、病理变化、微血管密度和肝癌组织中caspase-3及Flk-1达,探讨其在肝癌治疗中的作用。第一部分实验人canstatin cDNA基因的克隆目的：克隆人canstatin cDNA基因,分析其基因序列。方法：采用RT-PCR技术,从新鲜人胎盘组织中提取目的基因canstatin cDNA,进而克隆载体pGEM-T,然后获得重组质粒pGEM-T/canstatin,最后转化E.coliDH 5a,筛出阳性克隆基因,测定其序列。结果：1%琼脂糖凝胶电泳显示,人胎盘组织中mRNA有3条清晰条带(5S,18S,28S)；分光光度计测定显示,mRNA的A260=0.878, A280=0.411, A260/A280=2.136,计算总RNA浓度为1.76g/L。RT-PCR扩增物与目的基因canstatin长度基本一致。RT-PCR扩增产物与载体PGEM-T连接处理后,转化E.coli DH5a,可在有氨苄青霉素的LB平板上见到白色和蓝色菌落,挑选相对较好5个白色菌落做Bam HI和HindⅢ酶切鉴定,证实为阳性克隆。上海生物工程公司测定基因序列显示,重组质粒阳性克隆中的目的基因与GenBank公布的canstatin基因序列相同。结论：我们成功克隆了canstatin基因,为下一步利用canstatin蛋白抗肝癌治疗研究奠定了基础。第二部分实验原核表达并重组人canstatin蛋白目的：构建canstatin基因原核表达载体,表达并纯化重组人canstatin蛋白。方法：使用双酶切从重组质粒pGEM-T/canstatin上切下canstatin基因,插入到目的质粒pET-22b(+)相应位点,转化E.coli BL21,经过IPTG诱导重组人canstatin蛋白表达,使用SDS-PAGE电泳仪分析人canstatin蛋白表达情况。采用Ni-NTA柱亲和层析并纯化重组人canstatin蛋白,使用PBS对其透析复性。结果：从重组质粒PGEMT-T/canstatin切下目的基因canstatin cDNA,插入到质粒pET-22b(+)相应位点,转化E. coliBL21,挑选5个较好的菌落经Bam HI和HindⅢ双酶切后做电泳鉴定,显示所有菌落均含有2条特异性条带,分别与目的基因及原质粒对应。SDS-PAGE电泳仪分析结果显示在24KD出现新蛋白条带,诱导后1h、2h、3h和4h表达蛋白占菌体总蛋白的比例分别为17.2%,17.8%,21.0%和22.4%。Ni-NTA柱亲和层析显示,在125Mm和250mM洗脱液中均纯化出人canstatin蛋白.结论：canstatin原核表达载体可以被成功构建,并纯化出重组人canstatin蛋白。第叁部分实验探讨重组人canstatin蛋白在体内治疗肝癌的疗效目的：探讨重组人canstatin蛋白在体内治疗肝癌的疗效。方法：利用SMMC-7721肝癌细胞株建立30只裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,当肿瘤长至直径2-3mm时,随机分3组,即PBS对照组,5-Fu治疗组和canstatin蛋白治疗组,各组均经瘤体内多点注射给药。治疗期间定期测量移植瘤大小及重量；治疗后取出瘤体做常规病理检查免疫组化染色,总疗程为21天。结果：从治疗第3天,canstatin治疗组及5-Fu治疗组移植瘤体积显着小于对照组(P<0.05)；治疗第6天,有非常显着差异P<0.01。疗程结束时,虽然5-Fu治疗组疗效最显着,但全身的毒副作用明显,病理证实肝脏损害严重。结论：重组人canstatin蛋白可显着抑制肝癌组织生长,没有明显毒副作用,是肝癌患者较为理想的治疗方法。第四部分实验构建携带canstatin基因的腺病毒载体目的：利用基因工程技术,构建携带canstatin基因的腺病毒载体Ad-canstatin.方法；使用聚合酶链式反应(PCR)技术,扩增PET/canstatin载体上canstatin基因,双酶切后插入到pCA13质粒相应的位点,成功构建pCA13-Cans穿梭载体；pCA13-Cans与腺病毒骨架pBGHE3共转染293细胞,经3次病毒空斑纯化得到重组腺病毒,利用聚合酶链式反应(PCR)技术鉴定重组腺病毒。经293细胞扩增重组腺病毒、采用氯化铯密度梯度法离心纯化重组腺病毒并使用TCH150检测重组腺病毒的滴度。结果：从PET/canstatin载体上成功扩增出709bp含canstatin基因的DNA片段,将其插入到pCAl3质粒中成功构建了pCA13-Cans质粒,并经PCR及酶切鉴定正确后,与腺病毒骨架pBGHE3在293细胞内同源重组获得重组腺病毒,再经PCR鉴定重组腺病毒构建正确,命名为Ad-canstatin,使用TCH150检测重组病毒的滴度为3.1×109pfu/ml。结论：获得了高滴度重组腺病毒Ad-canstatin为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。第五部分实验Ad-Canstatin治疗肝癌实验研究目的：观察Ad-Canstatin在小鼠肝癌瘤体内抑制肝癌疗效。方法：以SMMC-7721人肝癌瘤细胞建立裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型。首先培养人肝癌瘤细胞悬液,将24只裸鼠随机均分成3组,每只裸鼠左侧腋窝皮下注射瘤细胞悬液0.1ml(浓度为2×107/ml),等到裸鼠肿瘤体积生长至50mm3左右时,将荷瘤裸鼠随机平均分成Ad-canstatin治疗组、PBS对照组和GFP空载组,每组有8只荷瘤裸鼠。每个肿瘤均行两次瘤内注射,间隔72小时,Ad-canstatin组和GFP空载组裸鼠瘤内注射病毒量分别为为8×109PFU,PBS对照组裸鼠注射0.1ml PBS。主要观察指标有：1、肿瘤生长抑制率2、肿瘤体积生长曲线。3、病理学检查：在注射药物30天后裸鼠均被处死,比较各组组织病理学变化。4、免疫组织化学方法检查：检测各组的肿瘤组织中caspase-3和Flk-1表达情况。结果：1.在注射Ad-canstatin基因治疗后第3天,Ad-canstatin组裸鼠的肿瘤体积明显小于PBS和GFP组(P<0.05)；其后观察发现,随着时间延长各组裸鼠肿瘤体积均增大,但Ad-canstatin组裸鼠的肿瘤生长速度和肿瘤体积均显着小于PBS和GFP组(P<0.05)。2.病理学检测显示,各组裸鼠瘤体内均见有不同程度的坏死组织,Ad-canstatin治疗组裸鼠瘤体内的坏死组织显着多于PBS和GFP组。3.Ad-Canstatin治疗组Flk-1的表达明显低于PBS组和GFP组,差别有统计学意义(x2=7.778,p<0.01)；4.Ad-canstatin治疗组caspase-3的表达明显高于GFP组和PBS组,差别有统计学意义(分别x2=6.563和x2=10.50,p<0.01)。结论：利用腺病毒载体Ad-Canstatin能够成功抑制裸鼠肝癌组织的生长,并能够降低肝癌组织中Flk-1的表达和提高caspase-3的表达。我们认为Ad-canstatin治疗肝癌的作用机制是：一方面在肿瘤组织中表达canstatin蛋白从而抑制肝癌血管的生成,另一方面,可能是降低Flk-1的表达和提高肝癌组织caspase-3的表达,促进了肝癌细胞的凋亡,从而也起到抑制肝癌细胞的生长。总之,canstatin蛋白作为新的内源性血管生成抑制剂有望成为治疗肝癌的新药物,利用腺病毒介导canstatin基因治疗肝癌不但能发挥强大的抗肿瘤作用而且能减少治疗费用,为肝癌治疗开辟了新方法,未来将会有良好的应用前景。
参考文献：
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