1.岳阳市一人民医院 湖南岳阳 410004；2.中南大学湘雅二医院药学部 湖南长沙 410011；3.中南大学药学院 湖南长沙 410013
【摘 要】目的 建立注射用埃索美拉唑钠无菌和细菌内毒素的检查法。方法 采用中国药典2010年版二部附录无菌和细菌内毒素检查法。结果 样品管无菌生长，6株阳性对照菌生长良好。注射用埃索美拉唑钠稀释至浓度为1.0mg•mL-1时对细菌内毒素检查法无干扰作用。结论 采用薄膜过滤法进行注射用埃索美拉唑钠的无菌检查，使用细菌内毒素检查法检查注射用埃索美拉唑钠中的细菌内毒素是可行的。
【关键词】注射用埃索美拉唑钠；无菌；薄膜过滤法；细菌内毒素；鲎试剂
ABSTRACT：Objective To establish bacterial endotoxin test and sterility test for esomeprazole sodium for injection. Methods According to the method of determination of bacterial endotoxin and sterility approved by Chinese Pharmacopoeia 2010 edition. Results All of six strains positive control tubes reveal growth of micro-organism and the substance control gives no evidence of growth.The interference on the determination of bacterial endotoxin can be excluded when esomeprazole sodium for injection was diluted 1.0mg•mL-1. Conclusion It is feasible to detect the bacterial endotoxin and microbial contamination of esomeprazole sodium for injection by the method of determination of bacterial endotoxin and membrane filtration，respectively.
KEY WORDS：Esomeprazole sodium for injection；Sterility test；Membrane filtration method；Bacterial endotoxin test；Tachypleus amebocyte lysate
注射用埃索美拉唑钠是一种质子泵抑制剂，通过抑制胃壁细胞的H+/K+-ATP酶来降低胃酸分泌，防止胃酸的形成，用于患胃食管反流疾病而无法吞食埃索美拉唑缓释胶囊患者的短期治疗[1]。鉴于近年来该制剂销售势态良好，其临床应用疗效肯定，无明显毒副作用，故立项研究开发规格为40mg的注射用埃索美拉唑钠。目前尚未见注射用埃索美拉唑钠无菌及细菌内毒素检查方法研究的报道，本品属注射类制剂，为了确保临床用药安全，故参考相关文献[2-5]，并按照中国药典2010年版二部无菌和细菌内毒素检查法的要求[6-7]，对本品进行了无菌和细菌内毒素检查方法学的研究。现将其研究结果报告如下。
1 试验材料
仪器：HTY-2000型智能集菌仪及一次性全封闭集菌器（杭州泰林医疗器械厂生产）；SW-CJ-2D净化工作台（苏州净化有限公司）；FA2004A电子分析天平（上海精天电子仪器有限公司）；PYX－DHS细菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；MJ-160B霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；YXQ-LS－50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗器械厂）；201-1-S型电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；XW—8/0A涡轮混合器（上海琪特分析仪器有限公司），ET-96内毒素凝胶法测定仪（天津市天大天发科技有限公司），规格为250μL和1000μL的微量移液器（大龙兴创实验仪器有限公司）。
菌种与培养基：：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]；生孢梭菌（Clostridum sporogens）[CMCC（B）64941]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]。营养肉汤培养基（批号：121022）；营养琼脂培养基（批号：130516）；改良马丁琼脂培养基（批号：120113）；硫乙醇酸盐流体培养基（批号：120409）；改良马丁培养基（批号：120410）。以上菌种和培养基均由中国药品生物制品检定所提供，菌种代数均为第3代。
鲎试剂（TAL）：湛江安度斯生物有限公司，规格：0.1mL，批号：1310230，灵敏度：0.25 Eu/mL；湛江安度斯生物有限公司，规格：0.1mL，批号：1310301，灵敏度：0.125 Eu/mL；湛江博康海洋生物有限公司，规格：0.1mL，批号：1306070，灵敏度：0.25 Eu/mL；湛江博康海洋生物有限公司，规格：0.1mL，批号：1306060，灵敏度：0.125 Eu/mL。
细菌内毒素国家标准品：中国食品药品检定研究院，规格：1mL，批号：150601-201377，效价：70Eu/支。
细菌内毒素检测用水（BET）：中国食品药品检定研究院，规格：5mL，批号：2011-8。
供试品：注射用埃索美拉唑钠由中南大学湘雅二医院药学部研制生产，批号：20130901、20130902、20130903，规格：40mg。
2 无菌检查方法学
2.1 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，于30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于23～28℃培养24～48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数小于100CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，于23～28℃培养5～7d，加入5mL含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数小于100CFU的孢子悬液。
2.2方法验证 按中国药典2010年版二部附录Ⅺ H，采用薄膜过滤法进行验证。取供试品20支，加0.9%氯化钠溶液适量使溶解；采用一次性二联滤器，先将滤器用少量稀释剂润湿，使稀释剂顺利流出，再将供试品溶液注入滤器，滤干，每筒用100mL 、200mL 0.1%无菌蛋白胨水溶液（含小于100CFU试验菌）冲洗，滤干，将硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基100mL注入二联滤器。置规定温度培养5d逐日观察结果。
2.3 试验结果 试验结果见表1。表1中的结果表明：按规定量取供试品照薄膜过滤法处理，当每膜用0.1%蛋白胨水溶液冲洗达100mL时，可消除本品对试验所用细菌、霉菌和酵母菌生长的影响。
2.4 结论 经上述方法验证试验，确定本品无菌检查方法如下：取本品，加0.9%氯化钠溶液适量使溶解，经薄膜过滤法处理，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗（每膜100mL），以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查（中国药典2010年版二部附录Ⅺ H），应符合规定。
3 细菌内毒素检查方法学
3.1 细菌内毒素限值（L）的确定 根据公式：L=K/M，其中K为按规定的给药途经，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，静脉注射K=5 EU•kg-1•h-1，M为人用每公斤体重每小时接受注射用埃索美拉唑钠的最大剂量。参考本品临床的用法用量可知，推荐每日1次静脉注射或静脉滴注本品20-40mg。反流性食管炎患者应使用40mg，每日1次；对于反流疾病的症状治疗应使用20mg，每日1次。注射用药：配制溶液的静脉注射时间应至少在3min以上；滴注用药：配制溶液的静脉滴注时间应在30min内。滴注液的制备是通过将本品1支溶解至0.9%氯化钠溶液100mL，供静脉滴注使用。M= 40mg/（60kg•1h）≈0.67mg•kg-1•h-1，K= K1+ K2，其中K1为人用每公斤体重每小时最大可接受本品的内毒素剂量，K2为人用每公斤体重每小时最大可接受0.9%氯化钠溶液100mL的内毒素剂量，K2＝100×0.5/（60kg•1h）≈0.83EU•kg-1•h-1，因此，K1＝（K－K2）=5－0.83=4.17 EU•kg-1•h-1。L＝K1/ M＝4.17/0.67≈6.2 EU•mg-1。国家食品药品监督管理局进口药品注册标准JX20080211中规定注射用埃索美拉唑钠的细菌内毒素检查为：每1mg埃索美拉唑钠中含内毒素量应不得过2.0EU，严于理论限值，为了便于操作和从严控制产品质量，确保临床用药安全，本品细菌内毒素限值（L）定为2.0EU•mg-1。
3.2 有效稀释浓度（MVC）的计算 根据公式MVC=λ/L，其中L为供试品的细菌内毒素限值，λ为鲎试剂标示灵敏度。目前市售鲎试剂灵敏度λ通常在0.5～0.03EU•mL-1之间，则本品的对应有效稀释浓度为：C0.5=0.5/2.0=0. 25mg•mL-1；C0.03=0.03/2.0=0.015mg•mL-1。
3.3 鲎试剂灵敏度的复核
按中国药典2010年版二部附录“细菌内毒素检查法”规定的方法进行TAL灵敏度复核，将细菌内毒素工作标准品用BET溶解，在涡轮混合器上混合15min后分别制成不同浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在涡轮混合器上混合30S。取复溶后的每支0.1mL不同浓度的内毒素标准溶液，每个内毒素浓度平行4管，另取2管加入0.1mLBET作为阴性对照。2批不同灵敏度的TAL分别进行试验，测定结果见表2。
3.6 结论 经上述方法验证试验，确定本品细菌内毒素检查方法如下：依法检查（中国药典2010年版二部附录Ⅺ E），每mg埃索美拉唑钠中细菌内毒素含量应小于2.0EU。
4 讨论
4.1 无菌检查法所用冲洗液为0.9%灭菌氯化钠溶液，该液主要有调节等渗作用，而无菌检查中还需考虑在大量冲洗后细菌易受损及营养支持问题，因此选用含营养成分的0.1%蛋白胨水溶液即可满足要求。此外，拉唑类药物在蛋白胨溶液中易形成混悬液影响过滤，故本品应先用0.9%无菌氯化钠溶液溶解后过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗。本品需用100 mL0.1%蛋白胨水溶液冲洗后才能消除抑菌成分，应少量多次冲洗，每张滤膜每次冲洗量不能过多，总冲洗量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。
4.2 无菌检查目的，既要保证中国药典2010年版二部规定的所有阳性对照菌正常生长，又要准确无误检查样品染菌情况。经实验建立的方法验证试验其既能保证6株阳性对照菌正常生长，又能准确无误检查本品染菌情况，故可作为注射用埃索美拉唑钠的无菌检查法。
4.3 样品预干扰试验的目的是评价样品浓度对鲎试剂与内毒素凝集反应的干扰程度及干扰性质，以便初步筛选出对检查无干扰的样品浓度范围。试验结果表明，样品浓度在0.015-1.0 mg•mL-1时，对细菌内毒素检查法均无干扰作用。采用1.0 mg•mL-1供试品溶液进行干扰确证试验，Es在2.0λ至0.5λ之间（包括2.0λ和0.5λ）及Et在2.0Es至0.5Es之间（包括2.0Es和0.5Es），说明1.0 mg•mL-1供试品溶液不干扰鲎试验。采用两个厂家的鳖试剂与供试品溶液（1.0 mg•mL-1）进行细菌内毒素检查，供试品细菌内毒素限量均在2.0EU•mg-1限值以下，供试品细菌内毒素限量均合格，故本品采用限值2.0EU•mg-1进行细菌内毒素检查法是可行的。
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作者简介：
刘志武，男，副主任药师，主要从事医院药学及管理工作，Tel：0730-8246705，E-mail：1009343512@qq.com
通讯作者：李健和，男，副主任药师，硕士生导师，主要从事新药开发工作，Tel：0731-85292093，E-mail：lijianhexy@126.com
论文作者:刘志武 武会芝 王霞 李健和
论文发表刊物:《航空军医》2016年第5期
论文发表时间:2016/6/12
标签：内毒素论文; 细菌论文; 检查法论文; 溶液论文; 培养基论文; 本品论文; 注射用论文; 《航空军医》2016年第5期论文;