刘桢付[1]2001年在《费氏中华根瘤菌的基因标记与竞争结瘤的研究》文中研究说明本研究以叁亲本接合转移将含有发光酶基因luxAB的重组质粒pHN102导入费氏中华根瘤菌WWG18，得到标记菌株WWG18-lux。以同样的方法将含有绿荧光蛋白基因gfp的重组质粒pHN129导入费氏中华根瘤菌HNT29，得到另一标记菌株HN729-gfp。分别在自生和与大豆共尘条件下对标记菌株进行稳定性检测，结果表明：在两种条件下报告基因在标记菌株中遗传稳定性均为100％。 在砂培岔栽条件下，当供试菌株WWG18-lux与HNT29-gfp的体积比为100：1时，供试菌株从接种后第2天到第8天，WWG18-lux在根系的定殖密度高于HNT29-gfp，但是其接种后第11天到第32天，WWG18-lux在根系的定殖密度低于HNT29-gfp。当体积比为1：1时，供试菌株在接种后第2天，WWG18-lux在根系的定殖密度略高于HNT29-gfp，但是供试菌株从接种后第4天到第32天，WWG18-lux在根系的定殖密度始终低于HNT29-gfp。当体积比为1：100时，在接种后第2天到第32天，供试菌株WWG18-lux在根系的定殖密度始终低于HN729-gfp。占瘤率的检测结果表明：在叁种不同体积比的条件下，HNT29-gfp的占瘤率始终明显高于WWG18-lux，表明HNT29-gfp的竞争结瘤能力高于WWG18-lux。砂培盆栽结瘤试验结果表明：占瘤率主要由菌株自身的竞争能力决定。根系定殖密度高的供试菌株的占瘤率高，占瘤率高的供试菌株的竞争结瘤能力强。接种量对占瘤率影响的结果表明：适当增大接种量能提高标记菌株的占瘤率。灭菌土培混合接种定殖密度测定结果表明：当体积比为100：1时，在接种后第2天到第16天，WWG18-lux在根系的定殖密度高于HNT29-gfp，在接种后第20天到第28天，其在根系的定殖密度低于HNT29-gfp。接种后第32天，其在根系的定殖密度高于HNT29-gfp。土培占瘤率的结果表明：HNT29-gfp的占瘤率高于WWG18-lux。灭菌土培混合接种时供试菌株的占瘤率高于非灭菌土培混合接种时的占瘤率。土培条件下结果表明：土壤中的其它因素(如：土着根瘤菌数量和土壤特性等)影响接种根瘤菌的竞争结瘤能力。供试菌株在土培和砂培时，其定殖密度变化不同。 用微根盒分根装置研究一侧根的结瘤对另一侧根结瘤影响的结果表明：用相同的菌株来接种根的左侧和右侧，在结瘤时期内，随着时间的延迟，一侧根的结瘤对另一侧根的结瘤有抑制作用。用竞争能力不同的标记菌株来接种根的左侧和右侧寸的结果表明：一侧根的结瘤对另一侧根的结瘤亦有抑制作用。本研究考察了(NH_4)_2SO_4对供试菌株结瘤的影响，结果表明：随着费氏中华根瘤菌基因标记与竞争结瘤的研究困H4)250。浓度的增加，总瘤数明显减少，1 omM倒H;)250;使供试菌株不结瘤。在倒H月)2504存在情况下，一侧根的结瘤对另一侧根结瘤影响的结果表明:不同浓度卿H4)2504存对根的两侧结瘤均有影响。随着倒H。)250;浓度的增加，与不加(NH;)2504时相比，一侧根的结瘤对另一侧根的结瘤抑制作用加强。10mM(NH刁2504使供试菌株两侧均不结瘤。
缪礼鸿[2]2001年在《费氏中华根瘤菌内源质粒间的相互作用及其对共生固氮的影响》文中进行了进一步梳理利用带有枯草芽胞杆菌蔗糖敏感基因sacB的Tn5-Mob转座子标记了费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HN01、YC4B和WWG18不同的内源质粒；在含有10％蔗糖的TY培养基上，除YC4的第二大质粒外，均获得了消除标记的质粒的突变株。深入的比较研究结果证明： 1．在辅助质粒pRK2073的协助下，实现了费氏中华根瘤菌HN01、YC4B和WWG18中的6个标记内源质粒在种内不同菌株之间和费氏中华根瘤菌与农杆菌之间诱动转移。通过植物盆栽结瘤试验，从功能上证明HN01的第二大质粒pSymHN01b为共生质粒。将标记共生质粒pSymHN01转入大豆品种专一性结瘤菌株AB359后，可使后者成为能在黑农33等大豆品种上结瘤的广品种范围结瘤的菌株，从而证明费氏中华根瘤菌品种专一性结廇性状受共生质粒控制。 2．将HN01共生质粒pSymHN01b分别转入WWG18SR和C361SR后的质粒快速检测、质粒消除和植物盆栽结瘤试验结果证明：HN01的共生质粒与WWG18SR的共生质粒具有不相容性，但能与其非共生质粒相容。相反，HN01的共生质粒可与C361SR的共生质粒相容，但与其中一个非共生质粒具有不相容性。利用费氏中华根瘤菌不同菌株质粒间的不相容性，本研究成功地消除了WWG18SR的共生质粒和C361SR的一个非共生质粒。 3．将YC4B的标记共生质粒pSymYC4b导入HN01的研究结果证明YC4B的共生质粒pSymYC4b与HN01的非共生质粒pHN01c具有不相容性，并同时与其共生质粒pSymHN01b出具有不相容性。将YC4B的pSymYC4b导入HN01后，通过质粒间的不相容性在含蔗糖的平板上获得了同时消除HN01菌株中的两个稳定的内源大质粒(pSymHN01b和pHN01c)的突变株HND100。 4．从在大豆上正常结瘤和固氮的野生型菌株YC4中分离到两个结瘤性状改变的自发突变株YSC3和YC4B，其中YSC3在所有供试的大豆品种上只形成无效的根瘤，而YC4B则完全失去了在大豆上结瘤的能力。进一步研究证明，突变株YSC3的共生质粒发生了扩增，并引起结瘤因子(LCOs)组分的改变。突变株YC4B的质粒带未发生任何可见的变化。用TLC技术检测的LCOs结果还表明：YC4及其突变株YSC3产生的LCOs结构明显不同于其它4个野生型S.fredii菌株。培养温度对YC4及其突变株产生的LCOs量的影响不同。野生型菌株YC4在较低培养温度(23℃)和正常培养温度(28℃)下产生的LCOs的量变化不大，但突变株YSC3产生的LCOs的量在28℃下却大大增加。 5．发现HN01的共生质粒pSymHN01b在转入WWG18SR的过程中发生缺失，并导致转移接合子WWG18SRN1在大豆上结瘤的品种范围缩小的现象。通过盆栽结瘤试验证明：pSymHN01b的缺失导致转移接合子WWG18SRN1由广品种结瘤菌株转变为品种专一性结瘤菌株，并失去了在所有供试大豆品种上固氮的能力。 6．通过两亲本接合转侈，将豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum bv.viciae)1229的共生质粒pSym1229分别转入费氏中华根瘤菌HN01SR及其消除了共生质费氏中华根瘤菌内源质粒问的tI]互作用及J〔对共生固氮的影响 粒的突变株!INI)l()()‘1，。实验结果表I梦」:转移接合子1 IND x 00(psyml229)厂白二’!二的l矛C()s 组分与豌豆根瘤菌1229相同。IIND100(psyml229)能够在豌豆，{石种Nigra上形成 白色球状的无效根瘤;但豌豆根瘤菌1229则形成正常的长圆柱状的有效根瘤。 将psyml229转入}INolSR后，部分接合子表现出与}以D100(psyml229)珊·}11司的结 瘤性状，而另一部分接合子的结瘤性状与11丫olSR相同，显示了IIN0lSR与1229 r内异源共乙卜质粒之I司结瘤功能fl勺寺fl互扣J制作川。7.本研究采用发光酶丛因(ju川功标记技术，在无菌的砂培条件下测定了费氏【!，华 根瘤菌内源质粒和大豆品种对菌株竞争结瘤能力的影响。结果表明:供试菌株的 竞争结瘤能力主要取决于染色体携带的从因，内源质粒(包括共生质粒和非共生 质粒)对竞争结瘤能力没有明显的影响。结瘤试验还证明，消除】IN01和wwG18的 非共生质粒对它们的I司氮效率没有显着影响。将psymllNol卜转入AI3359后，转移 接合子在黑农33等大豆品种上表现出卜与!!功!相同的固氮效率。
缪礼鸿, 周俊初, 郑慧芬[3]2002年在《费氏中华根瘤菌内源质粒和大豆品种对菌株竞争结瘤能力及固氮效率的影响》文中进行了进一步梳理采用发光酶基因 (luxAB)标记技术 ,在无菌砂培条件下测定了费氏中华根瘤菌 (Sinorhizobiumfredii)内源质粒和大豆品种对供试菌株竞争结瘤和固氮效率的影响。结果表明 ,供试菌株的固氮效率主要由共生质粒所决定 ;而竞争结瘤能力主要取决于其染色体所携带的基因 ,内源质粒 (包括共生质粒和非共生质粒 )对供试菌株竞争结瘤能力没有明显的影响。菌株的竞争结瘤能力对供试的大豆品种依赖性较小 ,品种对不同组合中的菌株竞争结瘤能力影响效果不同
谢波[4]2005年在《费氏中华根瘤菌嘌呤合成酶基因purL表达的改造对共生能力的影响及其在生态安全防范中的应用研究》文中进行了进一步梳理根瘤菌的嘌呤合成途径在共生固氮过程中有重要作用，已知多数嘌呤缺陷型突变株都不能与宿主植物共生固氮。有报道认为嘌呤代谢途径中purL基因的转座子插入突变能导至腺嘌呤缺陷型和脂多糖LPS组分改变，该突变株与大豆只能形成微小无固氮活性的假瘤，虽在培养液中添加5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸或腺嘌呤和VB_1可以提高突变株的结瘤能力，但仍不能恢复固氮功能。为进一步探讨purL基因对根瘤菌共生固氮能力的影响，并通过改造purL基因表达方式实现根瘤菌应用中的生态防范，本研究对purL基因进行了不同时间和水平的表达改造，以探讨菌株共生能力、竞争结瘤与purL基因表达的关系，并获得了既能有效共生固氮、又可较快消亡的共生诱导表达重组菌。此外，本研究还考察了PurL突变对其它生理过程的影响。 本研究通过对费氏中华根瘤菌嘌呤合成酶purL的基因置换构建出腺嘌呤缺陷型突变株P825和P618，P825 purL的NotⅠ-ⅩhoⅠ片段被luxAB基因取代，P618的purL结构基因发生了1.98kb片段的缺失。两突变株只能在大豆上形成不固氮的假瘤，purL表达载体pBBR-PG在P825和P618中可恢复其在基本培养基上的生长情况和共生能力，同时对费氏中华根瘤菌SMH12、HN01、WH3和S11进行purL的基因置换，获得突变株SMH12-P1、HN01-P1、WH3-P1、S11-P1、SMH12-P2、HN01-P2、WH3-P2和S11-P2。 用fixK和fixR启动子启动purL表达的载体pHN801K和pHN801R，使P825仍需要添加腺嘌呤和VB_1才能生长，在1％琼脂的基本培养基穿刺培养中，P825(pHN801R)和P825(pHN801K)有弥散性的生长，表明两启动子能够在微氧条件下启动purL的表达。而两种purL诱导表达重组菌只形成假瘤，均没有恢复共生固氮的能力。以purL-gusA转录融合单元构建出purL基因渗漏表达载体pHN811(1／3野生型、组成型表达水平)、含nifH、nifQ、fixN启动子的共生诱导表达载体pTPG-PnifH、pTPG-PnifQ、pTPG-PfixN和超量表达载体pBBR-PG(10倍野生型水平)。结果表明pHN811和适宜的共生诱导表达的pTPG-PnifH与pTPG-PnifQ都可使重组菌与大豆在无外源嘌呤添加物时建立有效的共生固氮体系。添加腺嘌呤和VB_1，依然不能使突变株P618和purL不表达重组菌菌株P618(pTPG-PfixN)恢复共生固氮的功能，仅形成少数有侵染的无效根瘤。研究结果证明：只有表达了一定水平的purL基因才能进行有效侵染与共生固氮，而purL基因的表达在结瘤后期也是必需的。渗漏表达purL基因重组菌的现瘤时间晚于野生型2-3天，对植株鲜重和干重均、根瘤结构和含菌细胞中类菌体数量、固氮酶活的研究结果表明适宜的purL表达量对根瘤的正常发育和固氮效率发挥是必要的。 在植物砂培竞争结瘤实验中，purL基因渗漏表达、共生诱导表达和超量表达重组菌的竞争能力均显着下降，砂土盆载条件下重组菌的竞争能力均有所提高，添加
唐美琼, 申佩弘, 许兢, 蒋承建, 陈钢[5]2010年在《费氏中华根瘤菌HN01的putA基因克隆》文中研究表明从快生型大豆根瘤菌费氏中华根瘤菌HN01的基因组文库中克隆到一个putA(脯氨酸脱氢酶)基因,该基因与已报道的苜蓿中华根瘤菌1021中putA基因在核苷酸和氨基酸水平上分别有82%和86%相似性.利用自杀性质粒pK18mob构建含有putA基因部分片段的重组质粒,通过叁亲本结合导入出发菌株HN01中,获得正向插入的极性突变体GXHNPA和反向插入非极性突变体GXHNPB.将putA基因完整的ORF连接到广宿主载体pLAFRJ上,获得用于互补的质粒pGXHN37,通过叁亲接合,将pLAFRJ导入GXHNPA和GXHNPB获得互补菌株GXHNPHA和GXHNPHB.对出发菌株、突变菌株、互补菌株进一步的研究发现,以脯氨酸为唯一C、N源的MM培养基中培养时,突变体均不能生长,互补菌株和野生型HN01没有差异,而在完全培养基YMB中培养时,突变菌株生长不受影响.植株实验发现,突变体均能有效结瘤,但是固氮酶活与出发菌株相比有所下降,结瘤时间延迟1d,竞争结瘤能力下降,而互补菌株与野生型HN01没有明显的差异.
李友国, 周俊初[6]2000年在《导入额外拷贝nifA基因对费氏中华根瘤菌HN0 1NL根圈定殖与竞争结瘤的影响(英文)》文中进行了进一步梳理本文研究了导入额外拷贝的肺炎克氏杆菌 (Klebsiellapneumoniae)nifA基因对受体费氏中华根瘤菌 (Sinorhizobiumfredii)HN0 1在大豆根圈的定殖和竞争结瘤的影响。将HN0 1分别与带有标记基因luxAB的参照菌株HN0 1L和带有nifA基因和标记基因luxAB的重组菌株HN0 1NL按照 1∶1等量比例接种于大豆黑龙 3 3种子表面 ,在灭菌土和非灭菌土中研究其定殖动态。每一供试菌株在根圈中的比例依次于播种后第 3天、第 7天、第 1 0天、第 1 2天、第 1 4天、第 1 6天、第 2 1天和第 3 6天进行测定 ,占瘤率在播种后第 4 0天进行比较测定。盆栽实验结果表明 :导入了额外拷贝nifA基因的重组菌HN0 1NL与受体菌HN0 1和参照菌HN0 1L相比较 ,在灭菌土和非灭菌土中均表现出显着增强的大豆根圈适应性和竞争能力
参考文献：
[1]. 费氏中华根瘤菌的基因标记与竞争结瘤的研究[D]. 刘桢付. 华中农业大学. 2001
[2]. 费氏中华根瘤菌内源质粒间的相互作用及其对共生固氮的影响[D]. 缪礼鸿. 华中农业大学. 2001
[3]. 费氏中华根瘤菌内源质粒和大豆品种对菌株竞争结瘤能力及固氮效率的影响[J]. 缪礼鸿, 周俊初, 郑慧芬. 中国农业科学. 2002
[4]. 费氏中华根瘤菌嘌呤合成酶基因purL表达的改造对共生能力的影响及其在生态安全防范中的应用研究[D]. 谢波. 华中农业大学. 2005
[5]. 费氏中华根瘤菌HN01的putA基因克隆[J]. 唐美琼, 申佩弘, 许兢, 蒋承建, 陈钢. 应用与环境生物学报. 2010
[6]. 导入额外拷贝nifA基因对费氏中华根瘤菌HN0 1NL根圈定殖与竞争结瘤的影响(英文)[J]. 李友国, 周俊初. 华中农业大学学报. 2000