【关键词】机械刺激；子宫内膜；容受性；胞饮突【ABSTRACT】Objective: To study the effect of mechanical stimulation on endometrial receptivity. Methods: A total of 96 female mice were randomlydivided into two groups: control group and stimulation group. In stimulation group, emdometrium was scraped both in proestrus and estrus, compared thatonly in estrus in control group. Pinopod expression in the endometrial were determined by scanning electrom microscopy (SEM). Results: The expressionof pinopod in the stimulate group mices’ endometrial were significantly richer than in the control group mices’ endometrial, the difference between eachtwo groups was significant (P<0.01). Conclusions: Mechanical stimulating improve the endometrial receptivity perhaps by improving the expression ofpinopod.【Keywords】Mechanical stimulation; Endometrial; Receptivity; Pinopod【中图分类号】R8【文献标识码】A【文章编号】1276-7808（2015）-07-026-02
胚胎着床是从胚泡植入子宫内膜开始的一系列细胞、分子信号传递过程，成功的着床不仅取决于胚胎的质量，而且取决于子宫内膜的容受性。子宫内膜容受性是指子宫内膜对胚胎的接受能力，即允许胚胎粘附其上直至植入完成的特定阶段，它受严格的时空限制。体外受精—胚胎移植( IVF-ET) 着床失败的病例中约有三分之二是由于子宫内膜容受性不良导致的，因此提高子宫内膜容受性对提高胚胎着床率及临床妊娠率非常重要。
对子宫内膜回声紊乱或子宫内膜异常增厚的患者，采用机械刺激子宫内膜可以提高患者胚胎着床率、临床妊娠率和活产率，但对其机理尚缺少理论研究。本研究将用动物模型进行研究，比较未接受机械刺激和机械刺激子宫内膜的胞饮突的表达，从形态特征探讨机械刺激对子宫内膜的影响，寻找调节子宫内膜胚胎着床的基础，为人工调控子宫内膜接受性提供可靠的理论依据和实践基础。
1 材料与方法1.1 动物分组雌性小白鼠动情周期为4d～5d，分为4期：动情前期、动情期、动情后期和动情间期。每日上午9:00时取清洁级、体重20g～25g的雌性8周龄昆明小白鼠阴道分泌物涂片行HE染色检查，确定其动情周期，连续2个动情周期均正常，将小白鼠编号，用Excel分析工具中随机数字发生器产生随机数字，对应随机数字将小白鼠分成对照组和刺激组，每组48只。
1.2 机械刺激子宫内膜方法及标本采集对照组在动情前期将刮匙放进子宫但不刺激内膜，在动情期刮取子宫内膜；刺激组在动情前期用特制小号刮匙刺激子宫内膜前、后壁各一次，动情期刮取子宫内膜。将对两组小鼠所刮取的新鲜子宫内膜用PBS 洗涤3 遍后，固定于2.5%戊二醛液中储存于4℃冰箱待行扫描电子显微镜观察。
1.3 扫描电镜观察用PBS 缓冲液彻底冲洗后浸入系列丙酮液中脱水，样本置入2%的乙酸异戊酯中3h，临界点干燥，装台粘胶，涂银粉导电胶，用真空镀膜仪对样本进行金属镀膜，上镜观察。电镜下胞饮突分为发育中胞饮突、完全发育胞饮突、退化的胞饮突。发育中胞饮突，微绒毛细胞开始突出，微绒毛已变短；发育成熟的胞饮突表面裸露，无微绒毛；退化的胞饮突表面皱缩并且出现微绒毛。按Rebecca S, 等的方法，每个样品选取12 个视野观察胞饮突，根据胞饮突的范围进行评分，0分：无胞饮突；1 分：＜25%；2 分：25%～50%；3 分：＞50%，然后对评分进行统计学分析。每例标本的结果为5 帧画面的平均值1.4 统计学处理用SPSS17.0 统计学软件，对实验所获得的计量资料，用x ±s 表示，两组间数据比较采用独立样本t 检验，p＜ 0.01 认为差异有显著统计学意义。
2 结果对照组小鼠子宫内膜表面胞饮突数量少（见图1），刺激组小鼠胞饮突表达丰富,大部分胞饮突处于发育完全成熟阶段（见图2），两组比较差异有极显著意义（P ＜0.01）（见表1）。
表1 机械刺激对子宫内膜胞饮突的表达的影响（ x±s, n=48）Table 1 The effect of mechanical stimulation to endometrium on the pinopod（ x±s, n=48）
对照组 刺激组 t P
胞饮突 1.87±0.43 2.45 ± 0.57 4.31 0.000
3 讨论
3.1 提高子宫内膜容受性的意义胚胎着床是从胚泡植入子宫内膜开始的一系列细胞、分子信号传递过程，成功的着床不仅取决于胚胎的质量，而且取决于子宫内膜的容受性。子宫内膜容受性是指子宫内膜对胚胎的接受能力，即允许胚胎粘附其上直至植入完成的特定阶段，它受严格的时空限制。正常子宫内膜仅在一个极短的关键时期内允许胚胎着床，这一时期代表着子宫内膜对胚胎的接受性达到最高，称为“着床窗”（nidation window），或称“种植窗”（ implantation window,IW ），又称为“着床窗期”（peri-implantation period）。在人类，此期通常在正常月经周期排卵后的6d～8d，或受精后5d～7d，持续不超过48h；在大鼠、小鼠等啮齿类动物，种植窗在受精后4d，持续约24h。胚胎只有在这一时期才能植入，在种植窗开放前或后，胚胎都不能植入。
胚胎只有在子宫内膜“种植窗”(implantationwindow)开启时才能植入，在种植窗开放前或后，胚胎都不能植入。胚胎和子宫内膜按严格的时空顺序分泌相关蛋白和局部因子，达到相互识别，相互融合进而完成着床[1]。
Achache H 等认为IVF-ET 失败的原因，1/3 归因于胚胎质量欠佳，另外2/3 归因于子宫内膜容受性差。内膜不成熟或不处于着床窗口期，即使移植优质的胚胎，也会导致很低的着床率。胚胎着床的成功与否在很大程度上还取决于胚胎与可容受性子宫内膜间的相互作用，即双方建立“对话”机制，胚胎才可以在子宫内膜中正常着床[2]。
子宫内膜形态分为三型：A 型为三线型或多层子宫内膜，为外层和中部强回声以及内层低回声或暗区，宫腔中线回声明显；B 型为弱三线型，宫腔中线回声不明显；C 型为均质强回声，无宫腔中线回声。
研究显示，hCG 注射日子宫内膜回声类型和胚胎着床率相关，发现子宫内膜回声紊乱或子宫内膜异常增厚可能会影响子宫内膜接受性，阻止胚胎着床。
因此提高子宫内膜容受性对提高胚胎着床率及临床妊娠率非常重要。
3.2 机械刺激子宫内膜对子宫内膜容受性的影响如何提高子宫内膜容受性呢？目前已经有很对研究证实，可以通过对子宫内膜进行搔刮，提高子宫内膜的着床率。Narvekar SA等[3]。
选择100例前次移植优质胚胎而失败的患者，分为子宫内膜机械刺激组及对照组，发现机械刺激组其胚胎着床率、临床妊娠率和活产率均显著高于对照组(13.07% vs 7.1%；32.7% vs 13.7%；22.4% vs 9.8%)。
Potdar N 等[4]将7个对照研究(4个随机试验，3个非随机试验)进行了Meta分析，结果显示，在RIF患者促排卵周期中行子宫内膜机械刺激，临床妊娠率在70%左右，说明机械刺激子宫内膜可以提高RIF患者的临床妊娠率。罗国群，等[5]选取行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)且其自然月经周期卵泡晚期超声提示子宫内膜形态不良的不育患者63例，随机分为研究组和对照组。研究组在胚胎移植前1～2周对子宫内膜行机械刺激，对照组未行机械刺激。发现研究组子宫内膜形态及子宫内膜和内膜下血流均较对照组有明显改善(P ＜0.01)；研究组的胚胎种植率及临床妊娠率明显高于对照组(P＜0.01)，早期流产率明显降低(P＜0.01)。
可见，机械刺激子宫内膜有助于改善IVF-ET 的妊娠结局，其作为提高胚胎着床率的有效途径，对于IVF 助孕后的妊娠是极具价值的。
3.3 机械刺激子宫内膜提高子宫内膜容受性的作用机制Loeb等在1907年观察到，局部损伤几内亚猪的子宫内膜，能够促其快速蜕膜化，其蜕膜细胞的发育完全等同于正常蜕膜细胞的发育。
Dekel N,et al[6]研究认为，机械刺激子宫内膜是通过提高免疫应答而增加子宫内膜的接受性。Gnainsky Y,et al[7]认为机械刺激子宫内膜后，在局部会产生炎症反应，使巨噬细胞和树突状细胞(DC)含量增加，两者在子宫内膜的蜕膜化和着床方面起非常重要的作用。罗国群，等[5]发现机械刺激子宫内膜可以促进上皮细胞和基质细胞的增生和分化以及调节毛细血管的舒缩活动，提高子宫内膜的血流量，增加基质的水肿和蜕膜化，从而促进胚胎着床。Almog B, et al[8]认为，机械刺激子宫内膜可以通过调节对着床起重要作用的相关因子如层粘连蛋白a4、整合素a6的表达来提高子宫内膜的容受性；Kalma Y, et al[9]认为，机械刺激通过增加生长因子的分泌使子宫内膜容受性提高。
机械刺激子宫内膜，能够提高子宫内膜容受性，但其作用机制不甚清楚。
为了探讨机械刺激子宫内膜改善其接受性的机理，寻找调节子宫内膜胚胎着床的分子生物学基础，为人工调控子宫内膜接受性提供可靠的理论依据和实践基础，本研究按随机数字表将雌性小白鼠分成对照组和刺激组，对照组在动情前期将刮匙放进子宫但不刺激内膜，在动情期刮取子宫内膜；刺激组在动情前期用特制小号刮匙刺激子宫内膜前、后壁各一次，动情期刮取子宫内膜。将两组的子宫内膜进行扫描电镜观察。
胞饮突是在扫描电镜下所见的子宫内膜上皮细胞膜顶端出现的大而平滑的膜突起。顶端质膜突起在大鼠、小鼠、兔、牛等动物，以及人的子宫内膜上都可见，由于其有吞饮作用而被称为胞饮突[10]。自然周期中，胞饮突发育依次分为3 个时期：发育中、完全发育、退化[11]。发育中的胞饮突表面有短的微绒毛；完全发育期的胞饮突表面无绒毛，持续时间约24h～48h；退化期的胞饮突表面皱缩，有微绒毛。
在人类正常月经周期，它出现在周期的第20d～21d，正是囊胚开始与子宫内膜粘附的时期[12]；在啮齿类，它的出现与子宫内膜种植窗完全一致[13]。在临床上，胞饮突可为胚胎移植提供线索，预计胚胎移植的时间，使胚胎着床和子宫内膜种植窗的开放同步，从而提高妊娠率[14]。
许多实验研究发现，子宫内膜上皮完全发育胞饮突的形成，是子宫内膜种植窗开放的重要形态学标志[15、16]。
本研究应用扫描电镜观察发现：刺激组小鼠胞饮突表达丰富，大部分胞饮突处于发育完全成熟阶段；对照组小鼠子宫内膜表面胞饮突数量较刺激组少，发育滞后，差异有显著意义（P＜0.05）。可见，机械刺激子宫内膜促进胞饮突的表达，有利于胚胎着床。
本研究结果显示，机械刺激可增强子宫内膜容受性标志物胞饮突的表达，推测机械刺激提高子宫内膜的容受性与增加子宫内膜容受性标志物的表达有关。
参考文献：[1]Bruce A，Lessey M． Assessment of endometrial receptivity[J]．FertilSteril，2011，96(3)：522-529．[2]Valbuena D, Jasper M, Remohi J. Ovarian stimulation andendometrial receptivity. Hum Reprod, 2009, 14(Suppl 2): 107-111.[3]Narvekar SA,Gupta N,Shetty N. Does local endometrial injury inthe nontransfer cycle improve the IVF-ET outcome in the subsequent cyclein patients with previous unsuccessful IVF? A randomized controlled pilotstudy[J].J Hum Reprod Sci,2010,(01):15-19.[4]Potdar N, Gelbaya T, Nardo LG. Endometrial injury to overcomerecurrent embryo implantation failure: a systematic review andmeta-analysis. Reprod BioMed Online, 2012, 25(6):561-571.[5]罗国群，邓伟芬，马文敏。机械刺激子宫内膜对内膜形态不良者IVF-ET 临床结局的影响。生殖与避孕，2012，32（2）：139-143[6] Dekel N, Gnainsky Y, Granot I, et al. Inflammation andimplantation. Am JReprod Immunol, 2010, 63(1):17-21.[7]Gnainsky Y, Granot I, Aldo PB, et al. Local injury of theendometriuminduces an inflammatory response that promotes successfulimplantation. Fertil Steril, 2010,94(6):2030-2036.[8] Almog B, Shalom-Paz E, Dufort D, et al. Promoting implantationby local injury to the endometrium. Fertil Steril, 2010,94(6):2026-2029.[9] Kalma Y, Granot I, Gnainsky Y, et al. Endometrial biopsyinducedgene modulation: first evidence for the expression bladder-transmembranaluroplakin Ib in human endometrium.Fertil Steril, 2009, 91(4):1042-1049.[10]Murphy CR, Understanding the apical surface markers ofreceptvity: pinopodsor uterodomes? Hum Reprod, 2000, 15(12):2451-2454.[11] Aghajanova L,Stavreus--Evers A,Nikas Y, et al.Coexpression ofpinopodes and leukemia inhibitory factor, as well as its receptor, in humanendometrium. Fertil Steril, 2003,79(3)[Suppl1]:808-814.[12] Nikas G, Aghajianova L. Endometrial pinopodes:some moreunderstanding on human implantation? Reprod Biomed Online,2002,4[Suppl3]:18-23.[13] Nikas G, Osman HD, James PT, et al. Endometrial pinopodesindicate a shift in the window of receptivity in IVF cycles. Hum Reprod,1999, 14(3): 787-792.[14] Petersen A, Bentin-Ley U, Ravn V. The antiprogesteroneOrg31710 inhibits human blastocyst-endometrial interactions in vitro.FertilSteril, 2005, 83[Suppl 4]:1255-1263.[15] Usadi RS, Murray MJ, Bagnell RC, et al. Temporal andmorphologic characteristics of pinopod expression across the secretory phaseof the endometrial cycle in normally cycling women with proven fertility.Fertil Steril, 2003, 79(4): 970-974.[16] Nikas G, Makrigiannakis A.Endometrial pinopodes and UterineReceptivity. Ann, N. Y . Acaa , Sci, 2003, 97(11): 120-123.
论文作者:罗国群1 马文敏1 陈孟循1 叶泉英2 杨美琼1 柳倩茹1
论文发表刊物:《世界复合医学》2015年第7期供稿
论文发表时间:2015/9/7
标签：子宫内膜论文; 胚胎论文; 着床论文; 机械论文; 动情论文; 对照组论文; 回声论文; 《世界复合医学》2015年第7期供稿论文;