李淑娟[1]2004年在《酿酒酵母耐盐基因HAL1的功能验证》文中提出耐盐基因工程育种的一个十分重要的环节是分离耐盐相关基因，进行基因功能验证，为基因工程育种提供优良的基因资源。本研究利用从酿酒酵母菌株AS2.375中克隆出来的HAL1基因构建成的植物表达载体pAHF，通过叁亲杂交转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中。用农杆菌介导的叶盘法将HAL1基因转入模式植物烟草，对转基因烟草的耐盐性进行评价；并进一步转化木本植物小黑杨(Populus simonii×P.nigra)花粉植株以期获得耐盐杨树新品种。主要研究结果如下： 1．以烟草为实验材料，建立了较为理想的植株组培再生体系。烟草叶片诱导不定芽分化培养基为MS+0.5mg／L 6-BA+0.05 mg／L NAA，生根培养基为1／2MS+0.5 mg／L NAA，卡那霉素的选择压为50 mg／L，在此基础上进行遗传转化。 2．获得了烟草转化再生植株。经PCR扩增检测8个烟草转化子的再生苗，有6个获得约900 bp的特异性扩增谱带，初步证明HAL1基因已整合到烟草基因组中。 3．耐盐试验表明，在被检测的900株烟草转化再生植株中有481株可在含NaCl0.80％～1.50％的生根培养基中生根，生根率为53.45％；而对照烟草植株在含NaCl0.80％的生根培养基中生根率为0，仅在低于0.80％NaCl的生根培养基中生根。 4．对转基因烟草的自由授粉子代进行了子代测定。在含NaCl培养基中进行的种子萌发试验显示，转基因烟草子代种子幼苗的耐盐能力明显优于对照；PCR检测结果显示，外源基因仍存在于烟草子代的基因组中。 5．通过卡那霉素抗性筛选试验，确定了小黑杨花粉植株遗传转化中卡那霉素的选择压。小黑杨叶片诱导不定芽卡那霉素的选择压为20mg／L，植株再生卡那霉素的选择压为50mg／L，生根选择压为30mg／L。 6．获得小黑杨转化植株。PCR检测结果显示，10个转化子中有8个获得特异性扩增谱带。有待进一步验证和筛选。
穆敏, 舒娜, 王帅, 郭丽雪, 樊伟丽[2]2016年在《酵母耐盐相关基因HAL1在棉花中的功能表达》文中提出【目的】克隆酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)耐盐基因HAL1(halotolerance)并转化棉花,探究该基因在棉花中的功能,进一步探究酵母耐盐相关基因在高等植物中的具体功能。【方法】根据随NCBI核酸数据库中酵母耐盐基因HAL1的mRNA全长序列信息,利用RT-PCR技术从酿酒酵母AS2.375中克隆该基因。选择酶切位点XbaⅠ和SmaⅠ对表达载体pBI121::GFP进行双酶切,采用In-Fusion技术构建pBI 121-ScHAL1::GFP融合表达载体。以自发荧光较弱的陆地棉品种Y-2067、ZA-23、GZ-2的花粉为材料,用基因枪轰击棉花花粉进行瞬时表达研究。采用基因枪活体转化技术将外源基因表达载体pBI121-HAL1::GFP转化棉花盐敏感材料中s9612,获得T_0棉花转基因种子。用100mol·L~(-1)NaCl盐溶液对转基因T_0种子进行耐盐性发芽试验,并进行分子检测,对鉴定出的转基因植株进行叶盘耐盐性分析。【结果】从酿酒酵母As2.375中克隆耐盐基因ScHAL1,基因全长885 bP,共编码294个氨基酸。对其序列进行分析,发现HAL1蛋白中丝氨酸所占比例最大,整个蛋白呈碱性且带正电,属于亲水性蛋白。根据蛋白二级结构预测结果,推测该蛋白的结构功能域可能主要由无规则卷曲和β-折迭片构成。棉花花粉瞬时表达结果表明,转化HAL1后,3种陆地棉花粉的绿色荧光现象都明显增强,说明该基因可以在这3种陆地棉的花粉中表达。用100 mol·L~(-1)NaCl盐溶液对转基因棉花T_0种子和受体材料中s9612自交种进行胁迫,发现转基因种子萌发能力明显强于受体材料,表明HAL1可以提高种子耐盐性。根据基因核苦酸序列设计2对引物对T_0转基因棉花幼苗进行分子检测,将纯化后的PCR产物进行直接测序,测序结果证明转基因成功。对鉴定出的转基因植株进行叶盘耐盐性分析发现;在600 mol·L~(-1)NaCl和400 mol·L~(-1)NaCl盐胁迫下转基因植株叶盘叶绿素含量均高于对照植株,且在600 mol·L~(-1)NaCl溶液胁迫后,转HAL1植株叶绿素含量反而高于400 mol·L~(-1)NaCl溶液处理后的叶盘。【结论】成功从酿酒酵母中克隆基因HAL1;酵母HAL1对提高棉花耐盐性具有重要作用。
穆敏[3]2016年在《酿酒酵母叁个耐盐相关基因克隆及其在棉花中转化》文中研究表明盐渍化是限制植物生长和农作物产量的一个重要因素。棉花是盐碱地的先锋作物,是开发利用盐渍化土地的理想作物之一。通过基因工程和转基因技术提高棉花耐盐性已经成为当前棉花育种的一个迫切需求和重要方向。相关研究表明,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组中与耐盐相关的基因有200多个。其中,ENA1(exitu natru 1)基因编码一种P型盐诱导的ATPase,具有外排Na~+、Li~+的功能;转化拟南芥后,转基因拟南芥在酸碱条件下的耐盐性均有所提高。HAL1(halotolerance 1)基因是ENA1基因的效应子,通过提高反馈调节中K~+吸收的量来促进K~+的吸收;ScHAL1基因转化植物后不仅可以提高转基因植株的耐盐性,而且提高其耐碱性和作物产量。酿酒酵母YCF1(yeast cadmium factor 1)蛋白是液泡膜上S-谷胱甘肽结合转运蛋白,依赖于Mg-ATP,在重金属Cd~+、Hg~(2+)的转运解毒中起作用;转ScYCF1基因拟南芥在较高盐胁迫下比野生型对NaCl的耐受性强。本研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)As2.375为实验材料,通过NCBI数据库得到酿酒酵母耐盐相关基因ENA1、HAL1和YCF1的mRNA序列,利用RT-PCR技术克隆了叁个基因。其中ENA1(GenBank:NM_001180348.1)基因全长3276 bp,编码1091个氨基酸;HAL1(GenBank:EF015596.1)基因全长885 bp,编码294个氨基酸;YCF1(GenBank:NM_001180442.3)基因全长4548 bp,编码1515个氨基酸。对叁个基因编码的蛋白进行生物信息学分析发现,叁个蛋白的等电点分别为5.53、9.01和8.64,ENA1蛋白呈酸性且带负电,HAL1和YCF1蛋白带正电荷呈碱性;亲疏水性分析结果表明,ENA1和HAL1蛋白表现为亲水性,而YCF1蛋白则是疏水性蛋白。同时,叁个蛋白二级结构中都含有α螺旋、β-折叠片、β-转角和无规则卷曲。构建绿色荧光融合表达载体pBI121-ENA1::GFP、pBI121-HAL1::GFP和pBI121-YCF1::GFP,对叁个基因进行洋葱内表皮亚细胞定位发现ENA1蛋白和YCF1蛋白在细胞膜上表达,而HAL1基因编码的蛋白则定位于表皮细胞的细胞质中。棉花花粉的瞬时表达分析中,基因枪轰击后花粉的绿色荧光都明显增强,证明叁个基因在棉花花粉中表达,为下一步使用基因枪活体转化技术获得转基因耐盐材料奠定基础。利用基因枪技术将叁个基因分别活体转化陆地棉(Gossypium hirsutum L.)材料中棉所12,并对收获的T1代转基因种子进行耐盐性筛选和分子检测。0.6%NaCl盐溶液胁迫下,转酿酒酵母ENA1、HAL1和YCF1基因的转基因种子的发芽率和根生长情况均优于对照中棉所12自交种,证明叁个基因转化棉花后均可以明显提高种子耐盐性。对T1代转基因种子进行分子检测,以载体质粒为阳性对照,中棉所12自交种DNA为阴性对照,用所设计的检测引物分别扩增,将有特异性条带的PCR产物纯化后直接测序。通过比对分析测序结果,表明共得到转基因植株18棵,其中转ENA1基因3棵,转HAL1基因9棵,转YCF1基因6棵。本研究利用基因枪活体转化技术,将来源于酿酒酵母的叁个耐盐相关基因ENA1、HAL1和YCF1分别转化棉花,初步鉴定出其可以提高棉花耐盐性,为进一步探究酵母耐盐相关基因在高等植物中的确切功能提供依据,同时为培育棉花耐盐的新品种提供基础材料。
杨小玲[4]2010年在《SeNHX1耐盐分子机制与耐盐洋桔梗培育》文中研究指明盐碱胁迫是造成世界农作物减产的主要原因。通过种植耐盐碱植物既能改良土壤，又有一定的效益，是一种相对耗资少，见效快的盐碱地农业发展方式。随着植物耐盐分子生物学的发展，植物耐盐基因工程在培育耐盐新品种中成为研究热点。本文在研究SeNHX1于酵母中的功能、定位和SeNHX1转基因烟草的耐盐性及耐盐机制的基础上，将SeNHX1转化洋桔梗，以期培育耐盐洋桔梗新品种。SeNHX1基因是从盐角草克隆得到。在研究中，构建了pYES2-SeNHX1，pYES2-GFP和pYES2-SeNHX1-GFP叁种酵母表达载体和pBin438-SeNHX1植物表达载体。带有SeNHX1目的基因的酵母表达载体转化酵母nhx1缺陷型菌株296H，可部分恢复Na~+的解毒功能，并提高野生型菌株W303的耐盐性；荧光观察表明，SeNHX1定位于酵母液泡膜。植物表达载体pBin438-SeNHX1转化烟草，过量表达SeNHX1的转基因烟草在离体和盆栽盐胁迫下，均可提高其耐盐性。盆栽盐胁迫下，经过相同盐量的处理，盆栽土Na~+含量大于9.7mg/g时，SeNHX1转基因烟草下部老叶Na~+含量比野生型相应部位的Na~+含量高2.3mg/g FW，嫩叶中的脯氨酸含量比野生型高0.36mg/g FW，两者均达到显着水平；而丙二醛（MDA）含量显着更低。这些结果可以初步推断SeNHX1转基因烟草提高其耐盐性的机制：首先，转基因烟草可吸收盐土中更多的Na~+，促进水份的吸收与利用。其次启动离子分配机制，将吸收的Na~+更多地积累于老叶，防止幼嫩组织受到Na~+的毒害；在细胞水平上，SeNHX1转基因烟草将更多Na~+的区隔化于液泡，防止膜脂和酶活性受到伤害。植物表达载体pBin438-SeNHX1转化洋桔梗，通过检测表明SeNHX1基因已经整合到洋桔梗基因组中，并实现转录。过量表达SeNHX1的转基因洋桔梗组培苗可在含有150mmol/L NaCl培养基中正常生长，叶片中脯氨酸含量比野生型高0.5mg/g FW，两者间达到显着差异，表现了更强的耐盐性。通过移栽管理，获得10株苗龄2个月的转基因洋桔梗。
付畅, 杨传平, 刘桂丰, 李淑娟, 姜静[5]2003年在《酿酒酵母HAL1基因的克隆及植物表达载体的构建》文中指出HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以酿酒酵母AS2 .375菌株的DNA为模板 ,根据已发表的序列设计引物 ,经PCR扩增得到约 90 0bp的HAL1基因片段 ,连接到 pMD1 8 T载体上 ,转化大肠杆菌JM 1 0 9,筛选重组质粒进行酶切分析和序列测定 ,结果显示已克隆到完整的可读框 ,该基因的序列与已知序列同源性达 99%。将HAL1基因从T 载体上切下连接到pAM 1 94载体上构建了HAL1基因的植物表达载体 ,用于烟草的转化获得了耐盐性提高的转化植株。
孔娜[6]2008年在《耐盐相关基因HAL1在烟草、小麦上的遗传转化研究》文中研究表明土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的主要非生物逆境之一。随着人口的增加和耕地的减少,如何开发利用盐渍化土壤己成为农业生产和环境生态亟待解决的问题。利用耐盐相关基因遗传转化提高栽培作物的耐盐性,为盐渍化土地的开发与利用,增加粮食产量和维持农业可持续发展提供了一条新的途径和方法。HAL1基因是酿酒酵母中的重要耐盐因子,其表达参与调节细胞内离子浓度。尽管HAL1基因本身不是转运蛋白,但在盐胁迫下能与ENA1基因协同作用促进Na+外排,与其它转运系统协同作用增加K+的吸收,保持细胞内低的Na+/K+比,以减轻Na+毒害,因而在植物耐盐基因工程上具有很大的潜力。本研究通过农杆菌介导和基因枪轰击,进行了耐盐相关基因HAL1转化普通烟草和小麦的研究,探讨了农杆菌介导的烟草及基因枪轰击的小麦遗传转化条件及其影响因素,将HAL1基因转入模式植物烟草和栽培小麦,获得了以下主要研究结果: 1.优化了农杆菌介导的烟草遗传转化体系:研究了秦烟96和秦烟97烟草叶片的耐卡那霉素水平,为转基因株系的选择提供有效依据,卡那霉素浓度梯度筛选试验表明,以50mg/L卡那霉素作为秦烟96和秦烟97在农杆菌转化后抗性芽的筛选浓度为宜;在除菌步骤中,800 mg/L羧苄青霉素(Cb)进行除菌可以获得理想的筛选和除菌效果。通过对农杆菌介导的烟草转化条件的探索,建立起了一个快速有效的烟草遗传转化体系,优化的农杆菌介导烟草叶片遗传转化条件为:受体烟草品种秦烟96和秦烟97叶圆片未经预培养(预培养0 d)用稀释150倍的农杆菌菌液(OD600 0.5)浸泡1 min,转至MS1培养基上共培养48 h,无菌水冲洗后于体积分数2 % NaClO中浸泡15 min,无菌水冲洗4～5次,置800 mg/L Cb+质量分数0.1 %的甘露醇中浸泡约12 h除菌,后培养于MS1培养基上诱导烟草叶圆片不定芽的发生,50mg/L卡那霉素筛选秦烟96和秦烟97在农杆菌转化后的抗性芽;抗性芽在MS3培养基上生根成苗。2.获得了烟草转HAL1基因株:经农杆菌介导和抗性筛选共获得了69株抗性苗,经分子检测,有6株在879bp处有特异性扩增条带的烟草植株,初步证明HAL1基因已整合到两个烟草品种的基因组中。3.优化了基因枪转化小麦幼胚愈伤组织技术体系:在采用基因枪轰击法对小麦幼胚愈伤组织进行转化的体系中,DNA微弹的最佳浓度采用1.0μg/枪;靶材料的被轰击次数为1次;受体愈伤的最佳发育阶段为胚性启动前期;高渗处理可以使基因枪转化频率得到明显提高,用0.4mol/L的蔗糖在轰击前6h和轰击后18h进行高渗处理转化效果最佳,建立起了高效蔗糖高渗基因枪转化受体系统。研究通过小麦愈伤组织对卡那霉素的敏感性试验及其对转化植株的筛选试验,证明了针对小麦上的NPTⅡ抗性标记基因,卡那霉素的适宜用量为100mg/L。基因枪转化技术体系为:以小偃22和213两个品种(系)的幼胚愈伤组织为为受体,基因枪轰击DNA微弹浓度1.0μg/枪;轰击1次;受体愈伤组织的最佳发育阶段为胚性启动前期;轰击前6h和轰击后18h用0.4mol/L的蔗糖于20℃黑暗条件进行高渗处理,筛选,后在含30g/L蔗糖的幼胚愈伤组织诱导培养基上于26℃、3 000Lx光照条件下恢复培养14d,待胚性愈伤组织充分分化后,再用附加100mg/L Kan的再生培养基MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.5mg/L+NAA 0.01mg/L+Surose 30g/L+Ag 6.0g/L (PH5.8)筛选转化体。4.获得了小麦抗kan再生株:通过基因枪轰击转化与抗Kan筛选,共获得了26株抗Kan再生株。
王明霞[7]2012年在《大豆耐盐基因GmHAL3a和GmHAL3b的克隆与初步功能验证》文中进行了进一步梳理作物在生长发育的过程中难免会受到各种胁迫的影响,比如干旱、高盐。这些胁迫能够影响作物生长和降低产量。然而作物已经形成复杂的机制来应对这种胁迫,但这是远远不够的。研究这种复杂的机制,挖掘发掘抗逆基因资源,培育抗逆高产新品种来应对逆境胁迫是刻不容缓的。本研究从耐盐大豆品种苏协1号克隆两个耐盐基因GmHAL3a和GmHAL3b,对其进行了序列比对分析,组织表达分析和非生物胁迫分析。同时构建了这两个基因的表达载体,并成功转入拟南芥,用高盐、山梨醇和锂离子处理纯系后代,初步分析两个基因在非生物胁迫反应中的功能。此外对这两个耐盐基因GmHAL3a和GmHAL3b,分别克隆了两个RNA干扰片段,构建四个RNA干扰载体,并成功转入根癌农杆菌EHA105中。主要研究结果如下：1.氨基酸序列比对发现这两个基因的蛋白序列含有和其它物种相似的保守位点,进化树分析结果说明其蛋白序列与拟南芥HAL3基因亲缘关系是最高的。2.理化性质分析结果为,两个蛋白都呈酸性；发现这两个基因都可能定位于叶绿体中；且它们都具有两个潜在的跨膜螺旋区域。组织表达分析发现,GmHAL3a和GmHAL3b基因在苗期到开花后30天都是在根中表达量最高,开花期在叶中表达量最低,在茎中的表达量随着植株的生长是呈上升趋势的；开花后55天之前,两个基因在荚中的表达量都高于籽粒中,从开花后55天开始,籽粒中两个基因的表达水平就高于荚中,开花后65天籽粒中两个基因的表达量都达到最高值。3. GmHAL3a和GmHAL3b基因都受盐、山梨醇和LiCl的诱导表达,受LiCl的诱导表达最强烈。4.将连接有GmHAL3a和GmHAL3b基因的过表达载体成功转入拟南芥,发现转基因株系的开花时间提前,叶片中的AtHAL3a、AtHAL3b和AtHIP1基因的表达量在胁迫前后都高于对照。推测过表达GmHAL3a和GmHAL3b基因能够激活拟南芥叶片中AtHAL3a、AtHAL3b和AtHIP1基因的表达。5.用NaCl、山梨醇、LiCl处理转基因拟南芥纯合株系,转基因拟南芥的萌发速度比对照植株快,根长也显着高于对照植株,转基因拟南芥叶片中的脯氨酸含量在处理前后都比野生型多,但活性氧含量比野生型少。这些结果表明过表达GmHAL3a和GmHAL3b基因能够提高植株的耐盐性和耐锂性,增强拟南芥的抗渗透能力。
兰蓓[8]2008年在《酿酒酵母HAL5的功能研究》文中进行了进一步梳理细胞的一个重要特性是调节胞内的离子平衡,维持离子代谢的稳态。对于酿酒酵母的研究已在分子水平上发现了许多离子通道,但是到目前为止,调节离子进出和维持细胞内离子浓度的信号传导途径还有待于进一步深入的研究。酿酒酵母蛋白激酶Hal5和蛋白磷酸酯酶Ptc1都参与调控细胞对Li+耐受,但是并没有研究发现在这一调控过程中两者之间存在联系。在本论文中,我们首先构建了表达Hal5-HA融合蛋白的单拷贝质粒pHAC111-HAL5以及多拷贝质粒pHAC181-HAL5,从而为进一步研究HAL5的功能奠定了基础。其次,通过传统的遗传学表型鉴定和Western Blot检测蛋白方法,研究了酿酒酵母的HAL5基因和PTC1、PTC7基因在调节细胞对Li+的耐受性方面的相互作用关系。实验发现在酿酒酵母中过量表达HAL5能够压制因ptc1单缺失和ptc1ptc7双缺失所引起的细胞对于Li+的敏感性,证明了HAL5和PTC1之间存在遗传互作。进而我们又在蛋白水平上研究了两者之间的关系,结果显示ptc1缺失会引起HAL5的表达量上升,说明PTC1基因对HAL5在蛋白水平上存在负调控。最后,我们还研究了HAL5与受PTC1调控的HAL3、PPZ1,2的相互关系。证明了HAL5与PPZ2,HAL3之间都存在遗传互作。
龙瑞才[9]2013年在《紫花苜蓿与蒺藜苜蓿盐胁迫应激调控蛋白和miRNA的鉴定分析》文中指出盐胁迫是全世界普遍存在的一种非生物胁迫，也是导致作物减产的主要环境因素之一。在盐渍化土壤中植物生长和生理功能受盐胁迫环境因素的影响。目前为止，已在植物中发现多个参与盐胁迫逆境调控的基因，这些基因对增强植物的耐盐性具有重要意义。紫花苜蓿是一种重要的豆科牧草植物，蒺藜苜蓿是一种重要的豆科模式植物，为了研究紫花苜蓿“中苜一号”（Medicago sativa cv. Zhongmu-1）和蒺藜苜蓿“Jamalong A-17”（Medicago truncatula）在盐胁迫下应激反应机理，本研究使用差异蛋白质双向电泳技术对300mM NaCl胁迫处理0h和10h后的中苜一号和Jamalong A-17根中的蛋白进行差异蛋白质组学分析。从中苜一号根蛋白双向电泳凝胶中鉴定出超过1000个非冗余蛋白点，经分析后发现其中40个蛋白点在盐胁迫后表达丰度下降，53个蛋白点在盐胁迫后表达丰度升高；在JamalongA-17根中发现8个蛋白点在盐胁迫后表达丰度下降，22个蛋白点在盐胁迫后表达丰度升高。使用质谱分析技术对这些差异蛋白点进行鉴定，最终从中苜一号和Jamalong A-17根蛋白中分别成功鉴定出60和26个蛋白点。蛋白功能分析结果表明从中苜一号和Jamalong A-17根中鉴定出的许多差异蛋白参与植物逆境应激调控过程，这些蛋白的功能主要包括离子转运、酶催化、DNA和RNA绑定等。植物具备在转录水平和转录后水平进行逆境应激调控的机制。21-24nt的小分子RNA特别是miRNA是近年来发现的一种重要的转录后调控分子。为研究小RNA在苜蓿盐胁迫下的调控作用，本研究构建了紫花苜蓿“中苜一号”和蒺藜苜蓿“Jamalong A-17”根在盐胁迫0h和10h后的小RNA文库，并使用高通量测序技术对这些小RNA进行测序分析。从紫花苜蓿文库中测序获得659个已知miRNA，在蒺藜苜蓿文库中测序获得677个已知miRNA，这些miRNA属于250个已知miRNA家族。另外还在紫花苜蓿和蒺藜苜蓿文库中分别预测出189和218个新miRNA。对这些文库中miRNA的读数进行分析，结果表明中苜一号和JamalongA-17根中多数miRNA在盐胁迫前后表达量没有显着变化，但也有许多miRNA的表达量在盐胁迫前后差异显着。分析表明这些差异表达miRNA的靶标基因功能分布较广，其中许多靶标基因可能参与盐胁迫应激调控作用，这为植物特别是苜蓿的转录后水平耐盐调控机理提供了新的证据和研究方向。为进一步研究苜蓿的耐盐机理，本研究从紫花苜蓿中一个盐诱导基因的EST序列基础上克隆得到一个与酵母PMP3（plasma membrane protein3）和拟南芥AtRCI2A同源的基因MsRCI2A。在蒺藜苜蓿基因组数据库中进行序列比对分析得到五个与MsRCI2A同源的基因（MtRCI2A-E），这些基因都编码疏水性较强的小分子蛋白，都含有两个跨膜区域。亚细胞定位分析结果表明MsRCI2A和MtRCI2A-E编码蛋白基本都定位于细胞膜上。转录表达水平分析结果表明MsRCI2A和MtRCI2A-D在盐胁迫下表达量明显升高，MtRCI2E的表达量无明显变化。MsRCI2A和MtRCI2A-C能使酵母PMP3基因缺失突变体的功能得到恢复。转基因研究结果表明在拟南芥中过量表达MsRCI2A后能够使其耐盐性得到明显增强。目前已在植物中发现多种参与逆境应激反应的甘氨酸富集蛋白（glycine richprotein，GRP），但其中许多甘氨酸富集蛋白的具体作用机理还未知。本研究从紫花苜蓿中分离克隆到一个受盐诱导的甘氨酸富集蛋白（MsGRP），对其编码蛋白序列分析结果表明MsGRP中不含有RRM结构域（常见的甘氨酸富集型RNA绑定蛋白所特有的结构域）。亚细胞定位分析表明MsGRP定位于细胞膜附近。转录表达分析结果显示MsGRP受盐、ABA和模拟干旱胁迫诱导。转基因研究结果表明过量表达MsGRP基因的拟南芥在种子萌发期和幼苗期都表现出比野生型拟南芥对盐和ABA更敏感。这些结果表明MsGRP可能通过ABA信号途径参与苜蓿的盐胁迫应激调控，且可能在盐胁迫等非生物胁迫下起到负调控作用。
谢丽华[10]2013年在《曲霉耐盐突变体耐盐相关基因的发掘研究》文中提出曲霉耐盐突变体CCHA（Aspergillus glaucus CCHA）菌株是由吉林大学张世宏实验室从晒盐场盐池周边分离筛选的1株极端耐盐真菌，前期研究证明该菌具有较强的耐盐性，为了挖掘其耐盐相关基因，探索其耐盐的分子机制，本研究在对其进行全基因组测序的基础上，利用大肠杆菌表达系统构建盐胁迫后曲霉突变体的cDNA文库，并进行耐盐基因的筛选，对筛选得到的高耐盐克隆进行了测序、生物信息学分析及初步的耐盐性鉴定。本研究为阐明曲霉突变体的耐盐机制、挖掘耐盐相关基因及林木耐盐转基因育种提供物质（基因）基础和理论依据。Solaxa高通量全基因组测序结果表明，曲霉耐盐突变体基因组大小约为28.9Mb，有效长度大于1kb的contigs有313个，有效长度大于1kb的scaffolds有105个，通过生物信息学方法预测得到10066个unigenes。曲霉耐盐突变体CCHA在含有170g·L-1NaCl的培养基上培养一周后提取RNA，构建盐胁迫后曲霉耐盐突变体的cDNA文库。原始文库滴度为4.8×106pfu·mL-1，重组率约为90%，插入片段集中在500-1500bp范围内，平均长度大于750bp。对随机挑选的130个单克隆进行测序，获得了100条有效序列，利用NCBI的blastx进行比对结果表明82条序列有相应的同源序列和相关注释信息，它们分别与信号转导、渗透物合成、转录调控相关。提取文库的混合质粒DNA，电激转化E.coli BL21Star (DE3)，文库滴度为1.6×104pfu·mL-1，在含有不同浓度的NaCl培养基中进行耐盐克隆筛选，共得到60个耐盐克隆可以耐受0.7mol·L-1NaCl，其中有5个可以耐受1M NaCl，针对这5个高耐盐克隆插入序列进行了测序和blastx分析，其中CCHA-2229属于COGO428基因家族成员（质膜低锌离子转运蛋白），CCHA-2247属于60s核糖体蛋白L27e基因家族成员。通过点板试验和生长反应曲线测定试验发现，在1mol·L-1NaCl盐胁迫条件下含有这5个插入片段的转基因大肠杆菌生长情况均好于仅转化空载的大肠杆菌，可以初步确定外源基因提高了大肠杆菌的耐盐性，不同盐胁迫处理时间下5个基因的转录水平的变化进一步说明这些基因与曲霉耐盐突变体CCHA的耐盐性密切相关。另外选择了其中两个耐盐新基因，将其插入片段构建到改造过的植物超表达载体pBI121G中，通过浸花法转化拟南芥中，分析盐胁迫条件下的拟南芥表型试验可以观察到，当十天大小的幼苗转移至150mM NaCl的1/2MS培养基后，野生型拟南芥几乎全部萎蔫，而转基因拟南芥只有部分萎蔫。胁迫前后耐盐生理指标分析表明：胁迫条件下转基因拟南芥的SOD活性、叶绿素含量均显着高于对照，而MDA含量低于对照，这些结果进一步说明，CCHA-2142和CCHA-2114的超表达可以提高拟南芥的耐盐性。
参考文献：
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[6]. 耐盐相关基因HAL1在烟草、小麦上的遗传转化研究[D]. 孔娜. 西北农林科技大学. 2008
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