赵建文[1]2003年在《结核杆菌的培养特性及快速检测研究》文中研究指明近年来，压电石英传感器发展迅速，出现了许多种类的压电石英晶体生物传感器，已广泛应用于生物医学、环境监测、工业生产以及食品卫生监督等领域，压电生物阻抗传感器检测微生物具有灵敏度高、特异性强、方便、快捷、灵敏、操作简单等优点，而目前检测结核杆菌的方法均存在一些缺点，因此利用压电生物阻抗传感器检测结核杆菌具有广阔的发展前景。基于此，我们利用BACTEC MGIT 960系统和数字电桥选择最优的培养基，并用压电生物阻抗传感器对结核杆菌进行了一些研究。本论文开展了以下几方面的工作： 1．利用压电体声波阻抗生物传感器成功地检测减毒结核杆菌——H_(37)R_a，并讨论了培养基的背景电导和池常数对灵敏度的影响；结核杆菌的浓度与检测时间的关系；结核杆菌的响应曲线与其他微生物的响应曲线的差异；与其他几种检测结核杆菌的方法进行了比较，并讨论了在检测过程中其他微生物对结核杆菌检测的影响及消除方法。 2．当检测有毒结核杆菌——H_(37)R_v和从病人痰液中新分离的结核杆菌(NIM.TB)时，发现先前的培养基不适合检测H_(37)R_v和NIM.TB，因此利用BACTEC MGIT 960系统和试管培养对培养基进行重新选择，并用数字电桥检测了它们培养前后的电导变化情况，最后找到了一种较理想的培养基。另外从理论上讨论了葡萄糖、脂肪酸及其衍生物对结核杆菌生长的影响。 3．运用体声波生物传感器检测结核杆菌(H_(37)R_v)。尽管许多文献报道不锈钢是很理想的电极材料，但是在我们的实验中由于检测时间比较长，不锈钢并不十分稳定，因此对两种类型的不锈钢进行了钝化处理，并做了极化曲线，发现铬酐钝化效果最好。通过上面的选择后，应用压电体声波阻抗生物传感器得到了H_(37)R_v的典型响应曲线。
秦迪岚[2]2008年在《荧光纳米标记与编码技术用于几种重要病原菌检测的研究》文中进行了进一步梳理病原菌检测涉及到食品安全检验、疾病诊断、环境监测以及反生物恐怖等领域,与人类健康、社会安定和国家安全息息相关。传统的病原菌检测方法灵敏度低、费时耗力。各种建立在现代分子生物学、免疫学技术和现代分析仪器基础上的病原菌快速检测方法,为提高检测的灵敏度和可靠性做出了重要贡献,然而这些方法仍然存在各种局限性。功能化纳米材料具有许多普通材料无可比拟的优良特性,在病原菌的快速、灵敏检测上显示出广阔的应用前景。其中,硅壳荧光纳米材料是荧光最强的纳米材料之一,基于硅壳荧光纳米材料建立的荧光纳米标记技术比传统荧光标记技术具有更高的灵敏度和更好的光稳定性,为样品中少量病原菌的超灵敏检测提供了新的契机。本论文瞄准病原菌检测这一研究方向,在对各种病原菌检测方法进行简要综述的基础上,以荧光纳米标记与编码技术用于结核杆菌、大肠杆菌O157:H7等重要病原菌的快速、灵敏和多元检测为主线,主要开展了以下几个方面的研究工作:一、基于硅壳荧光纳米颗粒的间接免疫荧光显微镜法(FNP-IIFM)用于结核杆菌快速检测的研究。将荧光纳米标记技术与免疫荧光分析法相结合,发展了一种新型的基于硅壳荧光纳米颗粒的间接免疫荧光显微镜法用于结核杆菌的快速检测。通过采用兔抗结核杆菌抗体对目标结核杆菌进行特异性识别后,以修饰了葡萄球菌蛋白A的联吡啶钌(RuBpy)硅壳荧光纳米颗粒作为信号指示,利用葡萄球菌蛋白A与抗体之间的特异性结合,实现对结核杆菌的间接标记,通过荧光显微镜对标记的结核杆菌进行荧光成像检测。结果表明,该方法可以成功应用于对缓冲液体系、混合细菌样品和掺杂痰液样品中结核杆菌的检测,整个检测步骤包括样品预处理可在4h内完成;并且,采用硅壳荧光纳米颗粒作为荧光标记物用于结核杆菌的检测比传统荧光染料具有更高的信号强度与更好的光稳定性,有望应用于临床痰液标本中结核杆菌的快速检测。二、基于硅壳荧光纳米颗粒和SYBR Green I的双色流式细胞术(FSiNP@SG-FCM)用于结核杆菌检测的研究。将基于硅壳荧光纳米颗粒的免疫荧光分析法与流式细胞术相结合,发展了一种新型的基于功能化RuBpy硅壳荧光纳米颗粒和SYBR Green I的改良双色流式细胞术用于结核杆菌的检测。采用RuBpy硅壳纳米颗粒标记的抗体对样品中目标结核杆菌进行免疫荧光染色后,以核酸染料SYBR Green I对样品中细菌的核酸进行染色,从而将细菌与样品中的碎片杂质区分,通过多参数流式细胞术对样品中双染色的结核杆菌进行测定与分析。将该方法用于对缓冲液体系和掺杂尿液样品中的结核杆菌进行检测。结果表明,该方法显着地减小了由纳米颗粒团聚以及纳米颗粒对杂质碎片的非特异性吸附所引起的假阳性信号,对缓冲液体系和掺杂尿液样品的检测下限分别为3.5×10~3和3.0×10~4 cells/ml结核杆菌,并且比基于FITC标记的传统流式细胞术具有更高的灵敏度,整个检测步骤包括样品预处理可在2h内完成,有望应用于临床尿液标本中结核杆菌的快速检测。叁、多色光学编码硅壳荧光纳米材料的制备研究。基于荧光共振能量转移(FRET)与反相微乳液法硅壳荧光纳米材料制备技术,发展了一种简易的多色光学编码硅壳荧光纳米材料的制备新方法。采用两种FRET供受体荧光染料按不同的比例与载体材料人免疫球蛋白(或多聚赖氨酸)作用制备荧光编码的载体材料,以荧光编码的载体材料为内核材料,利用氨水催化硅烷化试剂在反相微乳液中水解包裹内核材料制备成一系列多色光学编码硅壳纳米材料。对两类光学编码硅壳纳米材料的形貌和荧光性质进行考察,结果表明,以人免疫球蛋白为载体材料制备的光学编码硅壳纳米材料为球形,而以多聚赖氨酸作为载体材料制备的光学编码硅壳纳米材料为棒状,通过改变供受体染料的标记比,可以获得一系列具有不同荧光发射光谱性质的纳米球或纳米棒,由于荧光共振能量转移效应,这些材料能以同一波长的光激发出不同颜色的荧光,而且荧光强、性质稳定、制备方法简便易行,在病原菌多元检测、多基因表达分析、蛋白质多元分析、多通道生物学测定、医学诊断学等方面都有广阔的应用前景。四、多色光学编码硅壳荧光纳米棒用于病原菌DNA片断多元检测的研究。基于多色光学编码硅壳荧光纳米棒建立多元荧光标记技术并与叁明治固相核酸杂交检测技术相结合,发展了一种可用于对大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生性李斯特菌和金黄色葡萄球菌叁种常见食源性病原菌DNA片断同时检测的多元分析方法。针对叁种目标菌编码特异性毒素的基因序列合成目标DNA片断以及特异性的捕获探针和信号探针,在微珠上分别修饰叁种捕获探针,对叁种细菌目标DNA片断进行杂交捕获后,以分别修饰了叁种信号探针的叁种不同颜色的光学编码硅壳纳米棒作为信号指示对目标DNA进行杂交检测。利用该方法对单一目标细菌DNA片断检测性能的考察表明,方法的检测下限为0.3 nM DNA、线性范围为0.3-1.9 nM DNA、可在2 h内完成分析;在此基础上进一步利用叁种不同颜色的光学编码硅壳纳米棒作为信号指示与叁明治核酸杂交相结合成功地实现了对大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生性李斯特菌和金黄色葡萄球菌叁种食源性病原菌DNA片断的同时检测,极大地提高了检测的效率。该方法可望用于病原菌基因的多元分析中。
苏峰[3]2013年在《HBD3抗结核能力鉴定及抗结核转基因牛生产》文中研究说明牛的结核病是一种动物的慢性传染病，临床上以在肺和其他器官上形成肉芽肿为主要病理特点。这种疾病能够传染奶牛和其他家畜，同时也能感染野生动物。牛的结核杆菌分布于世界各个角落，每年都会引起巨大的经济损失，其中对奶牛的产业化生产影响更为严重。因此发现一种合适的方法降低这种损失变得尤为紧迫和重要。前期的文献证明人的防御素（HBDs）在结核的发展过程中对结核杆菌有一定的抑制作用。因此在本实验中首先纯化了HBD3蛋白并通过大肠杆菌和葡萄球菌测定了其生物学活性，而后验证了HBD3蛋白对结核杆菌的抑制作用。而后构建HBD3真核表达载体，利用体细胞核移植技术获得了转HBD3基因的转基因牛。（1）本文首先纯化了GST-HBD3蛋白，通过Xa酶切后获得纯化的rHBD3蛋白，对其生物学活性鉴定表明其对大肠杆菌无明显的抑制作用，而对金黄色葡萄球菌有显着的抑制作用。（2）使用纯化的rHBD3蛋白对结核杆菌做抗菌性分析，结果表明纯化的HBD3蛋白对结核杆菌最小抑菌浓度为20μg.ml-1，同时结核杆菌对靶细胞侵染时，靶细胞会释放HBD3。（3） Muc1蛋白在牛上的分布表明可以将muc1启动子应用于抗结核研究中，同时Muc1启动子的活性分析表明muc1启动子能够启动绿色荧光蛋白表达,但其表达强度弱于CMV启动子。（4）牛靶细胞细胞系AECs II的建立，通过转入Htert基因获得了转基因的AECsII永生化细胞系，此细胞系与结核杆菌的相互作用表明其可以作为抗结核研究的靶细胞材料。（5）构建了HBD3真核表达载体，将其转入靶细胞中分析细胞中HBD3的表达情况及其抗菌性验证，结果表明，转基因细胞分泌的HBD3蛋白在结核杆菌侵染时极显着升高（P<0.01）。抗菌性实验表明，分泌的HBD3蛋白能够显着地抑制结核杆菌的生长(P<0.05)。同时转基因细胞的荷菌数及凋亡率分析表明其对结核杆菌的易感性降低。（6）比较了转基因胚胎和非转基因胚胎的发育状况，结果表明转基因胚胎的卵裂率和囊胚率与非转基因的胚胎卵裂率和囊胚率无明显差异。生产并鉴定了转基因牛，其抗菌性分析表明转基因牛对结核杆菌有一定的抗性，其肺泡上皮细胞中分泌的HBD3能够抑杀结核杆菌。肺泡上皮细胞的荷菌数表明转基因牛能够显着降低其对结核杆菌易感性。
刘素芹[4]2004年在《压电体声波微生物传感器的研制及其应用研究》文中研究表明压电生物传感器具有响应谱广、灵敏度高、结构简单和易实现数字化等独特优点，其应用已涉及到分析化学、生命化学、环境监测和表面科学等众多领域。由于传统的微生物检测方法操作烦琐而且费时，因此压电微生物传感器的利用具有广阔的发展前景。基于此，我们充分利用两种新型的快速而简单的压电微生物检测方法：单脱开电极压电传感器和串联式电极压电传感器，对绿脓杆菌和结核杆菌进行了一些初步研究。在本研究室压电微生物传感前期工作的基础上，本论文开展了以下几个方面的工作： 1．利用单脱开电极压电DNA生物传感器成功地检测绿脓杆菌。其中，用溶胶-凝胶方法合成两种纳米膜：纳米TiO_2膜和纳米TiO_2-聚乙二醇杂化膜，并对膜的性质进行了讨论。抽提绿脓杆菌DNA制作探针，固定到两种敏感膜上，并根据液相杂交的原理检测绿脓杆菌。纳米技术和杂化膜的应用显着地提高了响应灵敏度，大大地缩短了检测时间。所构建的传感器具有可回复性，能用于医院污水的监测，结果令人满意。 2．提出了一种新的利用压电体声波阻抗微生物传感器快速检测减毒结核杆菌—H_(37)R_a的方法。这种方法与其他方法相比，具有响应快、灵敏度高、造价便宜的优点。该传感器可以实时、自动地定量检测结核杆菌。其响应机理是：培养池中的结核杆菌在生长过程中释放出CO_2，而CO_2与Ba(OH)_2发生反应而导致Ba(OH)_2的电导变化，该变化被所构建的BAWIB传感器监测，并以频移响应曲线表征。FDT与样品中存在的结核杆菌的浓度的对数之间存在线性关系。本实验完成了菌液浓度为3×10~2cells／ml至10~7cells／ml的检测，得出最低检测限为10~2cells／ml。其中讨论了池常数和接受液种类及浓度对CO_2响应曲线的影响，加与不加NaHCO_3引起的变化情况的差异。文章末尾还对用数据处理方法迅速得到FDT值作了概述，并给予评价。 3．利用压电体声波阻抗微生物传感器成功地检测从病人痰液中新分离的结核杆菌(NIM．TB)。借鉴本实验室前期工作，利用Bactec MGIT 960系统筛选出的叁种理想培养基，进行NIM．TB的临床检验，以期得到定性判断。为避免由杂菌污染造成的假阳性结果，在培养液中分别加注射用青霉素和注射用头孢拉定实验。结果证明当使用注射用头孢拉定时，效果比注射用青霉素好。目前，杂菌污染已控制，且结核杆菌生长良好，电信号变化明显。临床检测已有一定进展，但在检测池设计、实验操作等方面还有待于进一步优化。
夏玮[5]2010年在《纳米金电化学生物传感技术研究》文中研究表明生物传感器利用生物分子间可相互特异识别并结合的特性,可对被测物质实现高特异性分析,制备电化学生物传感器对满足生物医学研究和环境监测快速分析都具有十分重要的意义。纳米材料具有独特的物理和化学特性,具有促进电子传递和有助于保持生物分子活性的优点,因此,将纳米材料应用于生物传感技术检测方法的研究是一个很有前景的研究领域。本论文利用纳米金颗粒作为修饰材料,分别构建了叁种新型电化学生物传感器。首先,利用雌激素能与雌激素受体特异结合的特性,把雌激素受体固定到纳米金修饰的双层类脂膜中构建了用于检测雌激素类物质的传感器,并能对环境实际样品的总雌二醇当量实现快速灵敏的检测。其次,将纳米金、壳聚糖凝胶和酶标二抗混合溶液修饰电极,在电极表面形成了纳米敏感膜,成功构建了用于检测结核杆菌的酶免疫传感器。最后,利用带有氨基的纳米金在电极表面自动分散成膜,再固定ds-DNA于电极上,制成了用于检测环境遗传毒性污染物的生物传感器。第一部分纳米金-双层类脂膜雌激素传感器检测环境样品中的雌激素类物质目的：建立一种新型的基于纳米金修饰双层类脂膜雌激素生物传感器,可实现对环境样品中雌激素类物质的快速检测。方法：本方法基于雌激素与雌激素受体(ER)特异结合的特点,利用纳米金修饰双层类脂膜(s-BLM)后固定雌激素受体,建立一种新型的对雌激素类物质雌二醇当量进行快速检测的方法。以17β-雌二醇为检测对象,首先将双层类脂膜修饰铂盘电极,接着将纳米金用电沉积修饰到双层类脂膜中,再将雌激素受体(ER)固定在纳米金修饰的双层类脂膜(Au/s-BLM/Pt)中,制备成纳米金修饰双层类脂膜的雌激素生物传感器ER/Au/s-BLM/Pt,利用雌激素与敏感膜上雌激素受体结合前后电化学阻抗的改变来定量检测雌激素。电极的不同修饰状态分别用循环伏安法和交流阻抗法进行了表征。并利用该方法检测了双酚A和壬基酚等的类雌激素物质。将该传感器用于检测环境水样中的雌二醇当量(EEQ),结果与MCF-7细胞增殖实验相比较。结果：(Ⅰ)循环伏安法和交流阻抗法表征电极,验证了电极修饰状态良好；(Ⅱ)确定将ER固定在双层类脂膜上的最佳浓度为0.3 nmol/L及与17β-雌二醇的最佳结合反应时间为20min；(Ⅲ)定量研究获得该传感器对17β-雌二醇的剂量-反应关系曲线,以交流阻抗法测得17p-雌二醇与传感器反应后阻抗的改变与浓度在5～150 ng/L范围内呈良好线性关系,相关系数r=0.996,最低检出限为1 ng/L。(Ⅳ)利用该方法检测了其他的雌激素类物质双酚A和壬基酚,也在一定浓度范围内呈良好的线性关系。(V)将该法和无纳米金修饰的电极ER/s-BLM/Pt对17β-雌二醇的响应信号进行比较,纳米金起到了提高灵敏度和稳定性的作用；该传感器的重复性、选择性也较好。(Ⅵ)纳米金-双层类脂膜雌激素传感器对环境样本的检测结果与MCF-7细胞增殖实验结果基本一致,两个方法的回收率也良好。结论：该法对雌激素的检测,操作快速,选择性好,且纳米金增加了传感器的灵敏度和稳定性。结合有效的前处理过程,该法可以用于环境样品的定性与定量快速检测,可反映样品的总雌激素效应的雌二醇当量,与经典的生物检测方法MCF-7细胞增殖实验检测结果相当。第二部分基于壳聚糖和纳米金的酶免疫传感器检测牛奶中结核杆菌目的：本部分旨在建立一种基于壳聚糖和纳米金的酶免疫传感器能对结核杆菌进行定量检测的生物传感器,可作为快速检测牛奶样本中的结核杆菌的手段。方法：本方法利用结核分支杆菌细胞壁的单克隆抗体能特异的结合结核杆菌这一特性,纳米金促进电子传递的特性将纳米金和壳聚糖混合作为承载反应原件的基质,建立一种新型的能对牛奶中的结核杆菌快速检测的方法。以牛分支结核杆菌卡介苗为检测对象,将壳聚糖凝胶、纳米金溶液和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体混合溶液经电化学沉积法来修饰玻碳电极表面,再利用抗原抗体特异性反应将结核杆菌单克隆鼠抗体固定在碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极表面,制备用于检测结核杆菌的纳米结构的酶免疫传感器。通过差分脉冲伏安法测定传感器与结核杆菌反应前后引起的电流改变可定量分析。电极的不同修饰状态分别用循环伏安法和交流阻抗法进行表征。并将该法用于简单前处理牛奶样品的检测。结果：(Ⅰ)循环伏安法和交流阻抗法表征电极,验证了电极修饰状态良好；(Ⅱ)条件优化确定传感器与结核杆菌孵育的最佳时间为30 min,测试溶液最佳的pH值为8；(Ⅲ)以磷酸缓冲液配制不同浓度的结核杆菌,以差分脉冲伏安法测得传感器与结核杆菌结合反应后电流的改变与结核杆菌的浓度在104～106 cfu/mL范围内呈良好线性关系,相关系数r=0.994,最低检出限为3.5×103 cfu/mL。(Ⅳ)并证实了该传感器具有较好的重复性、选择性和稳定性。(Ⅴ)对灭菌后的牛奶加结核杆菌的样品前处理后进行检测,结果与磷酸缓冲液配制的结核杆菌样品基本一致。结论：该传感器制备方法简单,具有灵敏度高、检测时间短,操作简单等优点,是一种可快速检测结核杆菌的方法。第叁部分纳米金-DNA的电化学生物传感器检测环境水样的遗传毒性目的：本部分旨建立一种基于纳米金-DNA的电化学生物传感器,可作为快速检测环境水样的遗传毒性的手段。方法：本方法利用油胺还原氯化金合成了表面带有氨基基团的纳米金颗粒,能在电极表面自动分散成膜,纳米金再吸附ds-DNA固定于电极表面,建立一种新型的能快速检测环境遗传毒性污染物的生物传感器。用紫外-可见光光谱和透射电镜表征纳米金结构和性质；以2-氨基蒽为标准品,利用方波伏安法测定传感器与样品反应后DNA鸟嘌呤峰电流高度发生的改变,可对2-氨基蒽进行定量检测。并将该传感器用于环境水样的检测,以鸟嘌呤的峰高改变来判断待测样品中是否具有遗传毒性,检测结果与单细胞凝胶电泳相比较。结果：(Ⅰ)紫外-可见光光谱和透射电镜表征纳米金,验证了纳米金状态稳定、均匀分散；(Ⅱ)定量研究获得该传感器对2-氨基蒽的剂量-反应关系曲线,以方波伏安法测得传感器与2-氨基蒽反应后鸟嘌呤峰电流的改变(S%)与2-氨基蒽的浓度在50 nM～1.25×103nM范围内呈良好线性关系,相关系数r=0.966,最低检出限为10 nM。(Ⅲ)用该传感器对前处理后的环境水样进行检测,结果与单细胞凝胶电泳相比较具有一定的相关性。结论：该传感器制备方法简单,具有灵敏度高、检测时间短,操作简单等优点,是一种可快速检测环境水样是否具有遗传毒性的方法。
王洪生[6]2005年在《皮肤分支杆菌感染一式多元化快速分子诊断方法的研究及其在临床中的应用》文中研究表明随着艾滋病和其他免疫缺陷患者的增多，分支杆菌感染的发病率也逐渐上升。分支杆菌既可以引起系统性感染，也可以引起皮肤感染。皮肤分支杆菌感染的临床表现和组织病理都缺乏特异性，诊断主要依靠检测到分支杆菌。本实验室已经针对常见的几种可以引起皮肤感染的分支杆菌，初步建立了应用PCR检测和鉴定这几种分支杆菌感染的方法。在此基础上，本次课题对PCR直接用于临床皮肤分支杆菌感染的检测之问题进行探讨，研究其关键点---解决临床标本的前处理这一难点问题；同时，对PCR检测和鉴定皮肤分支杆菌感染的方法进行评价，并与培养的方法做比较；完善和补充皮肤分支杆菌感染一式多元化快速诊断方法；并将传统方法和新近构建的分子生物学方法相结合检测临床皮肤分支杆菌感染标本。 第一章：对PCR直接用于临床皮肤分支杆菌感染的检测之问题进行探讨，解决混有皮肤组织的标本使PCR敏感性降低的问题。我们采用向组织匀浆中加入菌悬液的方法来模拟临床皮肤感染标本，结果表明PCR检测的敏感性比纯菌悬液时PCR检测的敏感性降低了100倍；模拟临床感染标本经水洗和高速离心后PCR检测的敏感性为1×10~3个菌细胞／mL，比对纯菌悬液进行PCR检测的敏感性降低了10倍，比模拟临床皮肤分支杆菌感染标本不经任何处理的PCR检测的敏感陛提高了10倍；对模拟临床标本用SDS和高速离心法处理后检测PCR敏感性，结果发现PCR敏感性比对纯菌悬液进行PCR检测的敏感性降低了1000倍，比模拟临床皮肤分支杆菌感染标本不经任何处理的PCR检测的敏感性还降低了10倍；我们用含蛋白酶K的消化液加高速离心法处理模拟临床皮肤分支杆菌感染标本，结果发现PCR检测的敏感性比对纯菌悬液进行PCR检测的敏感性降低了1-10倍，比模拟临床皮肤分支杆菌感染标本不经任何处理的PCR检测的敏感性提高了10～100倍；证实了水洗和高速离心法、蛋白酶K的消化液加高速离心法可提高模拟临床皮肤分支杆菌感染标本PCR检测的敏感性，减少组织抑制物的干扰。 第二章：对PCR检测和鉴定皮肤分支杆菌感染的方法从叁个层面进行评价，并与培养的方法做比较。1、分支杆菌纯菌悬液的PCR检测方法及培养方法比较。结果表明PCR方法和培养方法敏感性皆为1×10~2个菌细胞／mL，为PCR法替代培养法检测临床皮肤标本提供了依据，为临床标本的前处理工作提供了努力方向；PCR检测方法可替代生化鉴定方法对分支杆菌培养物鉴定到种、亚型，且很大程度地缩短了鉴定时间。2、模拟临床皮肤分支杆菌感染标本前处理后PCR检测方法及培养方法比较。研究发现模拟临床标本在经过前处理后在浓度为1×10~2个菌细胞／mL的数量级上PCR检测方法阳性检出率为60％，而未经过前
刘鹏[7]2008年在《噬菌体裂解法快速检测结核分枝杆菌应用的研究》文中提出目前,全球大约有1/3的人口感染结核分枝杆菌,平均每一秒钟就有一人受结核杆菌感染,每年约有300万人死于结核,是单一病菌致死最多的传染病。目前对其尚缺乏特异、敏感、快速的实验室诊断方法。以噬菌体为基础的结核分支杆菌裂解试验,可以利用噬菌体生长快、特异性高的特性,快速准确地检测结核分支杆菌,近年来在结核病诊断的研究中备受关注,尤其是对结核菌浓度相对较低的胸水中的结核菌检出率相对较高。本研究采用噬菌体裂解法对结核病患者的痰、胸水、腹水中的结核杆菌进行检测为其临床应用提供依据。本实验的目的是探讨噬菌体裂解法快速检测结核分枝杆菌的临床应用价值。分别应用噬菌体裂解法和涂片法、L-J培养法对58例临床确诊结核病患者的标本(包括:痰/肺泡灌洗液、胸水、腹水)进行结核杆菌的检测。结果显示噬菌体裂解法阳性率79.3%(46/58),与涂片法3.4%(2/58)相比有显着差异(P<0.05),与L-J培养法74.1%(43/58)相比无显着差异(P>0.05)。得出结论噬菌体裂解法检测结核分支杆菌具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、安全等优点,并且检测出的是活菌。
徐贤坤[8]2009年在《水牛γ-干扰素单克隆抗体制备及水牛结核病夹心ELISA检测方法的初步建立》文中认为牛结核病(tuberculosis,TB)是由牛结核分枝杆菌引起的慢性消耗性疾病,呈世界性分布。牛结核病的诊断方法主要有病原鉴定和皮内变态反应。细菌学检查需要5～8周时间,检出率低,且常有假阴性结果出现而不适合于流行病学调查和日常监测;结核菌素(PPD)皮内变态反应(TST)是国际贸易指定试验,该法技术简单,价格低廉,但其非特异性强,不是理想的牛结核病诊断方法;而且该检测方法只是针对牛属结核病检测设定,不适用于水牛属、羊等家畜及其他的野生动物结核病诊断。抗原特异性γ-干扰素试验是一种新型体外T细胞免疫检测试验,由于新的结核杆菌特异性抗原CFP10,ESAT6等的发现,提高了检测的敏感性和特异性,其应用于牛结核病的诊断受到广大研究者的关注。然而,目前该法的研究对象主要集中在牛属动物,而未见水牛属结核病检测方法的报道。针对近年来我国南方水牛规模不断扩大,养殖密度不断增加,水牛结核病感染率和发病率急剧攀升却无适合的方法开展检疫的现状,本研究拟利用抗原特异性γ-干扰素原理,建立一种适用于水牛结核病检测的方法,为水牛结核病诊断提供一种新的手段,为检疫和控制水牛结核病提供技术支持。主要的研究工作和成果如下:1、提取经刀豆素(ConA)诱导培养的水牛外周血淋巴细胞培养物总RNA,通过RT-PCR扩增出水牛IFN-γ(WBIFN-γ)前体的eDNA序列,然后将其定向克隆入PMD18-T质粒中,构建重组质粒PMD18-T-WBIFN-γ,并进行测序。序列分析结果表明,克隆获得的IFN-γ基因全长为544个碱基,水牛IFN-γ基因开放阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸,基因登录号为EF567075。与GenBank上已发表的水牛、牛的IFN-γ基因进行同源性比较,其核苷酸同源性均高于97%,推导氨基酸同源性高于96%。通过亚克隆从重组质粒PMD18-T-WBIFN-γ中扩增出WBIFN-γ的成熟肽段序列,并将其定向插入原核表达载体pGEX-6P-1和PET-32a,经DNA测序确认后,分别转化至BL21(DE3)重组菌,经IPTG诱导表达后,pGEX-WBIFN-γ/BL21与PET-WBIFN-γ/BL21重组菌各自表达出相对分子量分别为43Ku和37.4Ku左右的融合蛋白rGST-WBIFN-γ和rHIS-WBIFN-γ,融合蛋白的相对表达量最高可分别达到菌体总蛋白的约30%和45%,并分别用GST FF蛋白纯化柱和HIS FF蛋白纯化柱对融合蛋白rGST-WBIFN-γ和rHIS-WBIFN-γ进行纯化。将重组菌pGEX-WBIFN-γ/BL21与PET-WBIFN-γ/BL21及其纯化蛋白进行Western-blotting和ELISA试验,检测结果表明两种重组蛋白均能与牛IFN-γ单抗发生特异性反应,均具有良好的免疫活性。2、将pGEX-WBIFN-γ/BL21重组菌经诱导表达后取菌体进行SDS-PAGE电泳,切取rGST-WBIFN-γ目的条带及可溶性纯化蛋白分别免疫Balb/c小鼠,均能使免疫小鼠产生高效价的多克隆抗体。以可溶性重组蛋白rGST-WBIFN-γ和rHIS-WBIFN-γ作为双重筛选抗原建立间接ELISA方法,应用淋巴细胞杂交瘤技术,选取血清效价高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经过3轮亚克隆筛选出2株能稳定分泌抗rWBIFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1E4,4A11;免疫球蛋白亚类鉴定其重链均为IgG1型,轻链为κ链,间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清效价均为1:3200,腹水效价均为1:819200;Western-blotting和Dot-ELISA分析显示,2株单抗均能特异性结合rGST-WBIFN-γ和rHIS-WBIFN-γ,而不与BL21(DE3)菌体裂解上清及其他重组蛋白反应,表明2株单抗均为针对水牛IFN-γ的特异性单抗。3、以罗氏培养法培养牛结核分枝杆菌标准株AN5并提取DNA模板,采用重组PCR方法从牛结核分枝杆菌AN5基因组中扩增CFP10-Linker-ESAT6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体PET-32a,构建原核表达质粒PET-CFP10/ESAT6。重组子经酶切及测序鉴定后转化BL21(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳鉴定,其在相对分子量为42Ku表达带有6×HIS蛋白标签的rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的40%,并用HIS FF蛋白纯化柱纯化该蛋白。Western blotting分析显示:该融合蛋白能与牛结核阳性血清发生特异性反应。将重组的该融合蛋白用于刺激单次皮内变态反应阳性牛全血,可以产生高水平的IFN-γ。用Bovigam~(TM)牛型结核ELISA试剂盒检测结果与皮内变态反应反应对比显示,PPD抗原敏感性为85.71%,特异性为69.23%,符合率为75%:rHIS-CFP10/ESAT6抗原的敏感性为77.78%,特异性为72.27%,符合率为75%。研究结果显示,应用牛和禽PPD比较反应检测牛结核阳性牛IFN-γ释放反应的准确度较低,混合感染牛可能被误判为结核阴性牛,而基于rHIS-CFP10/ESAT6的IFN-γ释放反应不受环境分枝杆菌的影响,检测具有良好的特异性。4、利用筛选得到的两株抗水牛γ-干扰素的单克隆抗体,对其中的一株纯化单抗进行HRP标记作为检测抗体,另一株纯化单抗作为捕获抗体,建立检测水牛结核病的γ-干扰素双单克隆抗体夹心ELISA。通过对封闭液、稀释液等条件进行优化,经过方阵滴定实验确定捕获抗体的最佳浓度为625ng/mL,检测抗体的工作效价为1:100,确定样本经rHIS-CFP10/ESAT6抗原刺激血浆OD值减去阴性OD值大于0.3判定为阳性,检测灵敏度为25ng/mL,批内变异系数为0.52%～6.86%,批间变异系数为5.6%～7.07%,稳定性良好。采集60头单次皮内变态反应水牛肝素抗凝全血,利用牛结核分枝杆菌特异性抗原rHIS-CFP10/ESAT6体外刺激水牛外周血淋巴细胞释放IFN-｜。用所建立的夹心ELISA检测所有样本,与皮内变态反应试验比较结果显示,自制夹心ELISA方法检测水牛结核病的敏感性为81.81%,特异性为71.05%,符合率为75%。该法的初步建立可作为皮内变态反应的辅助方法应用于水牛结核病的检测,为将来摸清广西水牛结核病流行情况,制定相应的防控措施提供技术支持。
张峻山[9]2014年在《载叁联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料体外抗结核性能研究》文中指出目的评价复合叁联抗痨药HRZ硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料的体外抗结核性能。方法将制作的载叁联抗结核药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料及非载药缓释材料浸泡于浸模拟体液中，分别于第4周、第8周、第12周取得两者的浸提液，采用高效液相色谱法对其浸提液浓度进行检测。实验分为叁组：实验组（A组）为复合叁联抗痨药HRZ硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料4W、8W、12W的浸提液组，分为A4W、A8W、A12W叁个亚组，每个亚组20个样本；实验对照组（B组）为未复合叁联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料4W、8W、12W的浸提液组，分为B4W、B8W、B12W叁个亚组，每个亚组20个样本；空白对照组（C组），培养瓶中为蒸馏水，分为C4W、C8W、C12W叁个亚组，每个亚组20个样本。将进行增殖后的标准结核分枝杆菌H37Rv与叁组样本分别加入BacT/ALERT3D培养系统与罗氏培养基中共同培养。观察其阳性率并统计学分析培养结果。结果（1）采用HPLC法对载叁联抗结核药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料的浸提液浓度检测结果（μg/ml）：异烟肼在第4、8、12周时的浓度分别为：142.65±2.23，47.83±2.91，0.68±0.17；利福平在第4、8周时的浓度分别为：70.69±7.16，39.95±3.98，第12周时其浓度已测不到；吡嗪酰胺在第4、8、12周时的浓度分别为：893.56±7.09；229.87±9.56，6.36±0.57。（2）经BacT/ALERT3D系统培养后，4W、8W、12W时A、 B、 C叁组样本浸提液的结核分枝杆菌阳性率分别为：A4W组15%、A8W组25%、A12W组55%，B4W组80%、B8W组85%、B12W组80%，C4W组90%、C8W组95%、C12W组90%。A组各样本与B组对应样本比较有统计学差异（P<0.05）。B组各样本与C组之间比较无统计学差异（P>0.05）。（3）经过罗氏培养基培养后，4W、8W、12W时A、B、C叁组样本浸提液的结核分枝杆菌阳性率分别为：A4W组15%、A8W组35%、A12W组25%，B4W组80%、B8W组80%、B12W组85%，C4W组85%、C8W组90%、C12W组95%。A组各样本与B组对应样本比较有统计学差异（P<0.05）。 B组各样本与C组之间比较无统计学差异（P>0.05）。结论（1）本研究表明载叁联抗痨药HRZ硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料在体外具有抗结核作用，其作用直到第84天仍然存在。（2）载叁联抗痨药HRZ硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料的抗结核作用随着叁药在体外缓释时间的延长而有所降低。（3）BacT/ALERT3D全自动结核分枝杆菌快培系统结合改良罗氏培养基检测结核分枝杆菌可以提高检测的准确性，为实验室检测提供了良好的方法。
王永祥[10]2017年在《叁种结核DosR蛋白的生理效应及其免疫特性研究》文中研究表明结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTB)引起的传染性疾病,具有较高的发病率和死亡率。据估计全球有1/3人群携带结核杆菌却无明显的临床症状,处于结核感染潜伏期。潜伏期结核杆菌存在于一种叫肉芽肿组织的微环境中,结核杆菌在此低氧、营养物质缺乏以及NO升高的微环境中,通过上调一组含有48个基因的结核休眠生存调节子(DosR)的表达,调节结核杆菌的生理活动,使之进入休眠期,并在肉芽肿组织环境中存活下来。本研究选取的叁种结核DosR蛋白Rv2626c(hrp1)、Rv2029c(pfkB)和Rv2032(acg),均可以在人体中产生强烈免疫应答。目的:1.探索DosR蛋白在结核潜伏期的生物学作用;2.探讨潜伏期表达的DosR蛋白作为抗原能否引起巨噬细胞产生免疫应答,以及产生免疫作用的具体机制;3.探索结核DosR蛋白能否作为新型的结核保护性疫苗。方法:1.通过文献检索和生物信息学分析的方法,选取DosR叁种基因Rv2626c(hrp1)、Rv2029c(pfkB)、Rv2032(acg)。2.采用基因工程技术,将叁种基因扩增纯化并与载体pET30A进行连接,构建重组质粒,并成功导入工程菌中。在IPTG的诱导下,表达叁种蛋白,并利用镍亲和层析的方法对蛋白进行纯化,对于表达在包涵体中的蛋白,采用透析的方法进行复性,最终获取纯度较高的蛋白Rv2626c、Rv2029c、Rv2032.。3.利用大肠杆菌平台期模拟肉芽肿微环境,将重组质粒Rv2029c导入工程菌BL21中,观察DosR蛋白Rv2029c对大肠杆菌生长的影响,分析蛋白Rv2029c在潜伏期结核杆菌肉芽肿环境中可能的生物学作用。4.THP-1细胞系通过佛波酯(PMA)诱导分化为巨噬细胞,并用DosR蛋白对巨噬细胞进行刺激,模拟天然免疫过程,观察DosR蛋白对巨噬细胞天然免疫的影响,揭示DosR蛋白引起天然免疫的机制5.建立小鼠体内呼吸道感染模型,将DosR蛋白接种到小鼠体内,之后进行BCG感染,观察DosR蛋白能否引起小鼠产生免疫应答,评价DosR蛋白作为新型的保护性疫苗的可能性。结果:1.成功构建重组质粒pET30A-Rv2626c、pET30A-Rv2029c、pET30A-Rv2032,诱导表达出叁种蛋白:Rv2626c、Rv2029c和Rv2032,蛋白电泳获得条带单一,表明蛋白纯度较高。2.DosR蛋白Rv2029c能够显着提高大肠杆菌增殖量,使其突破其生长界限,延长对数期,增强大肠杆菌在低氧应激状态下的生存能力;3.体内实验结果表明:与对照组(pbs组)相比,DosR蛋白Rv2626c可能诱导小鼠Th2型免疫反应,TGF-β表达量显著增加,导致结核杆菌产生免疫逃逸;4.体外实验结果表明:DosR蛋白Rv2029c和Rv2032均能通过识别并上调TLR2的表达,使NF-κB磷酸化水平升高并进入细胞核,刺激巨噬细胞产生促炎因子(TNF-α,IL-1β,IL-6等),产生免疫保护作用。结论:1.蛋白Rv2626c可能通过诱导Th2型免疫反应,增加TGF-β的表达,使结核菌产生免疫逃避:2.蛋白Rv2029c可能在潜伏期肉芽肿环境中增强结核杆菌在低氧应激状态下的生存能力,从而使结核菌转入休眠期:3.Rv2029c和Rv2032通过TLR2途径活化巨噬细胞,刺激促炎因子释放,发挥免疫保护作用。4.结核DosR蛋白Rv2032可以引起机体产生免疫保护,可以作为候选的保护性疫苗,值得进一步开发。
参考文献：
[1]. 结核杆菌的培养特性及快速检测研究[D]. 赵建文. 湖南大学. 2003
[2]. 荧光纳米标记与编码技术用于几种重要病原菌检测的研究[D]. 秦迪岚. 湖南大学. 2008
[3]. HBD3抗结核能力鉴定及抗结核转基因牛生产[D]. 苏峰. 西北农林科技大学. 2013
[4]. 压电体声波微生物传感器的研制及其应用研究[D]. 刘素芹. 湖南大学. 2004
[5]. 纳米金电化学生物传感技术研究[D]. 夏玮. 华中科技大学. 2010
[6]. 皮肤分支杆菌感染一式多元化快速分子诊断方法的研究及其在临床中的应用[D]. 王洪生. 中国协和医科大学. 2005
[7]. 噬菌体裂解法快速检测结核分枝杆菌应用的研究[D]. 刘鹏. 吉林大学. 2008
[8]. 水牛γ-干扰素单克隆抗体制备及水牛结核病夹心ELISA检测方法的初步建立[D]. 徐贤坤. 四川农业大学. 2009
[9]. 载叁联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料体外抗结核性能研究[D]. 张峻山. 宁夏医科大学. 2014
[10]. 叁种结核DosR蛋白的生理效应及其免疫特性研究[D]. 王永祥. 兰州大学. 2017
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