张成岗[1]2000年在《基于本地和WEB的生物信息学综合分析体系的建立及部分新基因的初步实验研究》文中提出理论上,处于造血系统迁入/迁出转换时期的4～6月孕龄人胎肝可能存在大量与细胞植入、定居、转移相关的基因。本室采用cDNA大规模测序策略对该时期人胎肝cDNA文库进行大规模测序,获得了16,000余条EST序列和511条插入片段全长cDNA序列。为了对这些数据进行有效分析以发现重要新基因,我们建立了“基于本地化和WEB的生物信息学分析体系”,对这些数据进行了分析,并对2条新基因进行了实验研究。初步得到以下结果: 1、建立了一整套基于生物信息学的EST分析体系:基于高性能PC机和Linux操作系统,利用Phred/Phrap/Consed软件和Blast软件,构建了核酸序列大规模自动分析系统。该系统可自动完成从测序峰图向核酸序列的转化、载体序列去除、序列自动拼接、重复序列鉴定以及序列的相似性分析,可加速对大规模测序数据的分析和利用。同时,在对已有网络资源进行综合分析的基础上,按照核酸序列和蛋白质序列分析的常规路线对已有网络资源进行了有机集成,并配合自行设计的程序构建了基于WEB的生物信息学分析体系; 2、发现了ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白家族(ADP-ribosylation factor GTPase activating protein,ARF GAP)中第一个人类成员ARFGAPI:该基因的全长cDNA序列为2768bp,编码516个氨基酸,其中含有ARFGAP家族的特征结构,即在该因子氨基端第6～126位含有典型的ARFGAP结构域,该结构域可能对其所具有的ARFGAP催化活性起决定作用,催化的核心部位是一个保守的锌指结构(CX_2CX_(16)CX_2C)。ARFGAPI的羧基端含有一个重复序列“SISSX_3FG”,该特点同时存在于ARFGAP家族其它成员中,此特征序列可能和各ARFGAP向特定细胞内膜结构的定向作用有关。该基因定位于人染色体
顾朝辉[2]2010年在《生物信息挖掘新基因预测平台的建立与TSEG-3的克隆和功能初步研究》文中进行了进一步梳理第一部分：生物信息数据挖掘新基因预测平台的建立摘要目的：依据最新生物信息学数据库和数据挖掘技术,充分挖掘现有生物数据库内蕴含信息,建立基于生物信息和数据挖掘技术的新基因克隆和功能预测平台。方法：首先,通过检索词从dbEST数据库检索,下载研究相关目标序列,将所选序列进行Blast分析,比对出相应的Unigene同源簇,下载上述同源簇或通过数字差异显示工具NCBI_DDD检索组织特异性Unigene同源簇；其次,通过Biolign软件进行EST clusters的拼接、延伸和组装,应用Blast检索程序进行EST clusters拼接的contigs序列基因组相似性分析,校正contigs组装产生的误差；第三,应用Genscan程序分析基因组同源序列的编码区(CDS)；第四,DNAssist预测上述CDS序列的开放阅读框(open reading frame, ORF);最后,Premier 5.0设计针对每个ORF的对应引物。结果：通过数字差异显示工具分析RIKEN full-length enriched mouse cDNA library和Epididymis cDNA library间的表达序列标签的差异序列,得到一个在RIKEN full-length enriched mouse cDNA library高丰度表达的同源簇Mm.5168,下载其对应的同源簇为UGID:258077;进行后续EST组装、延伸和contigs序列校对,同时预测基因组同源性编码区和开放阅读框,并设计相应的引物。结论：生物信息数据挖掘新基因克隆和功能预测平台能有效的发现组织特异性Unigene同源簇,为未知新基因的克隆和功能预测提供了很好的方向。第二部分：小鼠睾丸特异表达基因TSEG-3的克隆、组织定位及表达谱分析目的：应用生物信息数据挖掘新基因克隆和功能预测平台,预测可能参与睾丸精子发生和男性不育相关睾丸基因,并通过实验验证预测的准确性。方法：首先,利用数字差异显示工具Digital Differential Display检索与EST片段BY706707.1的同源簇,按前文提出的生物信息数据挖掘新基因克隆和功能预测流程,预测出一个新的编码区序列；其次,通过RT-PCR验证,证实其确实存在于成年小鼠睾丸；第三,通过T／A克隆,进行测序分析其与设计序列的一致性和同源性,验证了新基因预测平台的可靠程度；通过原位杂交分析分析TSEG.3表达的细胞类型,同时以用Northern blotting分析转录本大小和RT-PCR分析TSEG-3多器官和不同发育阶段表达谱序列。结果：成功从小鼠睾丸组织中扩增出TSEG-3,测序结果与预测结果一致,将基因序列提交Genbank数据库,获得Genbank登录号：EU477370(GI：186892498),命名为睾丸特异表达基因3(TSEG-3)。原位杂交结果显示TSEG-3表达于精原细胞、少量精母细胞和精子细胞等,Northern Blotting印迹证实转录长度为1023bp左右,小鼠TSEG-3多组织表达谱分析显示TSEG-3特异地表达于睾丸组织,在出生后2月龄时达到表达峰值。结论：TSEG-3是睾丸特异性表达基因,具有发育阶段特异性特征,可能参与小鼠生精过程,深入研究TSEG-3的功能有助于阐明精子发生机制和男性不育机制。第三部分：小鼠睾丸特异表达基因TSEG-3生物信息学分析及TSEG-3多克隆抗体制备与鉴定目的：应用生物信息数据挖掘工具,进行TSEG-3蛋白生物信息学分析,为进一步研究TSEG-3蛋白的功能提供必要方向。方法：应用序列信息挖掘软件,分析TSEG-3蛋白质物理特性、疏水区域和亲水区、跨膜区、蛋白质二级结构、蛋白质三级结构、拓朴树分析、特异性磷酸化位点、抗原位点及肽段、亚细胞定位及TSEG-3蛋白功能注释；设计TSEG-3抗原多肽并合成多肽,制备抗TSEG-3蛋白血清,Western Blotting鉴定TSEG-3蛋白分子量大小。结果：通过序列分析显示TSEG-3位于第17号染色体17A3.3区,有六个外显子组成。TSEG-3属于DFU634家族基因,在TSEG-3的5’侧翼区域有六个启动子序列；miRNA检索发现16个可能相关miRNA;并在TSEG.3第277AA.285AA预测出一个非稳定区段(disordered regions)序列为：QSLHEALFG；TSEG-3属于非跨膜蛋白,47.8%可能胞质的：21.7%定位于细胞核；理论等电点为7.15.吸光系数为23680；具有10个丝氨酸(Serine)位点,3个酪氨酸(Tyrosine)位点,在第211到221间存在一个PKC位点,第28氨基酸残基处为信号肽区,第65个氨基酸为一个精氨酸／赖氨酸前肽切割位点(Arg(R)／Lys(K))等；TSEG-3蛋白预测理论分子量为38,52976KD和Western Blotting检测结果一致；功能预测提示TSEG-3可能参与生殖细胞的分化和凋亡。结论：生物信息数据挖掘工具为新基因TSEG-3功能研究提供了丰富的研究内容,极大减少了TSEG-3功能研究的盲目性,加快了基因功能鉴定的速度。第四部分：过表达TSEG-3基因对小鼠精母细胞系GC-2 spd增殖、凋亡的影响目的：探讨TSEG-3过表达对小鼠精母细胞系GC-2 spd(ts)的增殖和凋亡的影响。方法：通过构建pEGFP-TSEG-3载体和体外培养小鼠精母细胞系GC-2 spd(ts),观察融合蛋白EGFP-TSEG-3的亚细胞定位；采用MTT法检测TSEG-3过表达对GC-2spd(ts)细胞增殖的影响；应用流式细胞仪分析TSEG-3过表达对GC-2 spd(ts)细胞周期的作用；AO/EB双重染色法、Hoechst 33258/PI双染、Annexin V/PI双染法和JC-1染色分析TSEG-3过表达对GC-2 spd(ts)细胞凋亡率的影响；Real-Time RT-PCR分析TSEG-3过表达对凋亡相关蛋白的影响。结果：融合蛋白EGFP-TSEG-3定位于细胞核,MTT法结果提示TSEG-3过表达抑制GC-2 spd(ts)细胞增殖；TSEG-3过表达诱导GC-2 spd(ts)细胞出现G1和G2／M期捕获。TSEG-3过表达诱导GC-2 spd(ts)细胞凋亡,Real-Time RT-PCR显示TSEG-3过表达诱导Fas上调,同时Bcl-2/Bax比率下调,说明Fas-Fas通路和Bcl-2/Bax均参与TSEG-3过表达诱导GC-2 spd(ts)细胞凋亡。结论：TSEG-3过表达抑制GC-2 spd(ts)细胞增殖,诱导GC-2 spd(ts)细胞凋亡,Fas/Fas通路和Bcl-2/Bax均参与TSEG-3过表达诱导GC-2 spd(ts)细胞凋亡途径。第五部分：TSEG-3过表达诱导小鼠睾丸精原细胞凋亡及其睾丸疾病模型表达谱分析目的：整体水平探讨TSEG-3过表达对小鼠睾丸精原细胞的影响,并分析其在睾丸疾病模型表达谱。方法：制备in vivo-jetPEITM-pEGFP-TSEG-3聚合物：构建TSEG-3过表达模型,HE染色和Tunel分析TSEG-3过表达对小鼠生殖细胞的影响；同时构建手术隐睾模型,分析TSEG-3转录水平与细胞凋亡率的关系,分析温度对TSEG-3转录水平的影响；复制17β雌二醇诱导隐睾模型,检测17β雌二醇诱导隐睾模型中TSEG-3转录水平,明确17β雌二醇对TSEG-3转录的影响。结果：荧光显微镜观察提示In Vivo JetPEITM是一种高效、可靠安全的DNA转染试剂,能有效的携带外源DNA入生殖细胞。TSEG-3过表达使睾丸组织生精小管官腔内细胞密度减少,生精小管官腔变薄,大量精原细胞及精母细胞缺失,未发现成熟精子。Tunel结果提示TSEG-3过表达可能诱导生精细胞的凋亡。手术隐睾模型结果显示：TSEG-3的转录激活与手术组小鼠睾丸内生精细胞凋亡率增加呈正相关关系,进一步提示TSEG-3可能参与睾丸组织生精过程中细胞凋亡过程。17β-雌二醇诱导隐睾模型原位杂交结果提示17β-雌二醇可能参与抑制不同阶段生殖细胞中TSEG-3的转录。结论：TSEG-3过表达诱导小鼠睾丸生殖细胞凋亡,温度可能诱导TSEG-3的转录,17β-雌二醇可能参与抑制不同阶段生殖细胞中TSEG-3的转录。
王翊[3]2005年在《CEM15基因的生物信息学分析》文中研究指明最近,对Vif 的研究揭示了自然免疫的新成员—APOBEC3G(CEM15),它是胞苷脱氨酶,作为反转录元件起致死性突变反转录病毒的作用。APOBEC3G 属于APOBEC 家族成员,以DNA 编辑的方式抑制反转录病毒复制,如HIV-1。APOBEC3G 是广谱的抗病毒蛋白,对HBV 也有强烈的抑制作用,但是作用机制有所不同。APOBEC3G(CEM15)是一种抑制HIV-1 感染的细胞内蛋白,在病毒复制晚期被整合进子代病毒粒子,继而引发反转录病毒cDNA 负链大量的dC-dU突变。Vif 是HIV-1 自身编码的附属蛋白,在HIV-1 复制过程中起重要作用。Vif 的表达对产生病毒的细胞是必需的,若没有Vif,下一个靶细胞的感染就会因固有抗病毒机制的作用而结束。Vif 蛋白有两个结构域,其中一个结合到APOBEC3G,另一个负责分解APOBEC3G,称为SLQ(Y/F)LA 基序。Vif 利用泛素-蛋白酶体降解途径使APOBEC3G 迅速降解。CEM15 基因的发现具有重要意义,它开辟了治疗AIDS 的新途径。但人们对它的了解并不多,所以有必要对其进行详细的分析。本文运用生物信息学方法对该基因的电子表达谱、染色体定位、相应蛋白的物理化学性质进行了分析,并进行了结构和功能预测。全文的内容有如下几点:1)对CEM15(APOBEC3G)的发现和功能,以及其作用机制进行了详细的概述。2)运用INTERNET 上的生物信息学资源,从基因水平分析CEM15的各种特性。3)分析CEM15 基因表达蛋白APOBEC3G。4)对各物种CEM15(APOBEC3G)进行序列比较,并构建了系统发育树。5)利用GenBank 数据库中的EST 序列,电子克隆了与小鼠CEM15基因同源的牛的CEM15 基因。
参考文献：
[1]. 基于本地和WEB的生物信息学综合分析体系的建立及部分新基因的初步实验研究[D]. 张成岗. 中国人民解放军军事医学科学院. 2000
[2]. 生物信息挖掘新基因预测平台的建立与TSEG-3的克隆和功能初步研究[D]. 顾朝辉. 华中科技大学. 2010
[3]. CEM15基因的生物信息学分析[D]. 王翊. 电子科技大学. 2005