梁红雁[1]1998年在《关于表型基因治疗的探索》文中研究表明心钠素(atrial natriuretic peptide, ANP)是一种主要由心房分泌的活性多肽，具有强大的利尿利钠、舒张血管、降低血压的作用，并参与机体水盐代谢平衡的调节，在临床上对于防治原发性高血压、心功能不全、肾功能衰竭等疾病具有积极的意义。目前临床研究上使用的心钠素多为肽类化学法合成的，价格昂贵；加上心钠素的半衰期非常短(2.5分钟)，临床使用必须连续滴注，使得心钠素的应用受到很大的局限。我们采用的心钠素表型基因治疗方法能够克服这些缺陷，产生降压利尿的效应。 所谓表型基因治疗指的是在不必完全了解疾病的遗传背景的情况下，直接针对疾病的表型(症状)而进行的基因治疗，将编码某种或几种具有消除病征、恢复正常生理表型的多肽的基因导入患者体内，并在其中持续稳定地表达，从而实现治疗或治愈患者个体疾病的目的。这就象是在患者体内建立了一座“微型药厂”，连续不断地为患者提供药物分子。表型基因治疗是一种用药方式的改变：把多肽药物改为相应的基因药物。它将在体内合成相应的多肽药物以应治病之需求。 我们选取ANP作为功能基因来治疗高血压和肾病综合征。所用动物模型是自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和阿霉素诱导的肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)大鼠。 首先将大鼠ANP(rANP)cDNA克隆进逆转录病毒载体pLXSN，获得两个重组体pLHY2和pLHY4。采用脂质体介导法把pLHY2和pLHY4分别转染进PA317包装细胞系，筛选抗G418的细胞克隆，病毒上清感染靶细胞—SHR皮肤成纤维细胞(SHRFT)，筛选抗性克隆，RIA法检测rANP的表达水平，选取表达水平较高的细胞克隆(SHRFT／pLHY2)，大量扩增细胞，用胶原和胶囊两种方法将细胞回植到6周龄SHR体内，产生明显的降压效应，时间长达7周，有一定的利尿作用。胶囊移植法使得基因治疗有望成为可逆过程。 将裸露的pLHY2 DNA经尾静脉导入具有少尿症状的NS大鼠(用5mg/kg体重剂量的阿霉素诱导成功)体内，获得明显的利尿作用，持续两周时间。 为使ANP表型基因治疗早日进入临床试验，用人ANP(hANP)cDNA取代rANP cDNA进行实验研究。将hANP cDNA克隆进逆转录病毒载体pLXSN和pLNCX，插入或不插入兔β-珠蛋白基因的第二内含子，获得两个重组体pLHY14和pLHY19(本组李涛博士构建了另外两个重组体pLT15和pLT16)。根据本组心钠素基因工程的研究，对hANP进行了定点突变：第8位氨基酸Phe→Ser，第12位氨基酸Met→Ile，获得突变的hANP基因(mhANP)。将mhANP cDNA克隆进pLXSN和pLNCX，插入或不插入内含子，获得三个重组体pLHY22、pLHY24和pLHY25。采用脂质体介导法把pLHY14、pLHY19、pLT15、pLT16、pLHY22、pLHY24、pLHY25和pYB3(编码hBNP染色
张姣[2]2015年在《去势抵抗性前列腺癌内分泌治疗获得性耐药的分子表型研究》文中认为目的前列腺癌(prostate cancer,PCa)是老年男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。国内大多数PCa患者在诊断时已经处于中晚期或存在转移,失去了外科手术的机会,这些患者均需要接受手术去势或药物去势联合抗雄激素治疗。虽然治疗初期大多数PCa患者有效,但几乎所有患者最终均发展成为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC),也即产生了内分泌治疗(hormone therapy,HT)获得性耐药。不同CRPC患者给予同样的治疗方案其疗效差异巨大,这一现象产生的根本原因在于每个患者之间的分子分型存在很大的差异。因此,通过分子诊断来确诊患者实时的肿瘤分子表型,进而根据这种分子表型制定CRPC科学、规范、个体化的综合方案,争取最大的治疗获益。本文通过对二次活检的肿瘤组织标本的免疫(免疫组织化学染色)和分子表型(48个癌相关基因外显子组测序)的检测,探索PCa内分泌治疗获得性耐药的机制,并基于免疫及基因分子表型特征指导个体化治疗,以此探索个体化治疗模式。方法1.收集多中心临床试验(编号:NCT02208583)纳入的40例CRPC患者的临床病理资料及耐药后二次活检的组织病理标本;2.检测PCa耐药后的二次活检组织的免疫表型特征,包括与上述耐药机制密切相关的标志物的免疫组织化学染色,包括雄激素受体(androgen receptor,AR),上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志物E-cadherin和Vimentin,神经内分泌分化(Neuroendocrine differentiation,NED)相关标志物CD56和Syn,P53,AURKA,N-myc以及Ki-67;3.检测PCa耐药后的二次活检组织的基因分子表型特征(基因表达和/或基因突变谱);4.根据免疫及基因分子表型特征给予个体化治疗,并对其临床病理资料进行整理,通过对个体化治疗后CRPC患者的无进展生存时间(Progression-freesurvival,PFS)进行统计以观察个体化治疗的效果。结果1.所有的CRPC患者的二次活检病灶均出现了免疫表型转化,其转化的免疫表型分别为:AR阳性表达、更低程度的分化、NED转化、EMT转化和小细胞前列腺癌(small cell prostate cancer,SCPC)。其中AR阳性表达见于50%的晚期CRPC患者、更低程度分化见于34%的CRPC患者、NED转化见于8%的CRPC患者、EMT转化见于4%的CRPC患者、SCPC见于4%的CRPC患者。其中AURKA阳性更常见于p53突变蛋白表达者。2.所有的CRPC患者的二次活检病灶均出现了基因突变,突变的基因包括:KDR,TP53,NRAS,KRAS,CTNNB1,ERBB4,RB,KIT,PIK3CA,VHL,FBXW7,APC,ALK,PDGFRA,EGFR,BRAF,PTEN,SMAD4,STK11,SMARCB1,GNA11,NPM1等。其中TP53基因突变见于31.6%的CRPC患者、KDR突变见于19.3%的CRPC患者、MET、PIK3CA突变分别见于8.8%的CRPC患者、KIT、PTEN、RB、APC突变分别见于7%的CRPC患者、EGFR突变见于3.5%的CRPC患者。其中TP53是CRPC中最常见的突变基因,且大多数TP53突变与其它基因突变同时出现。3.根据本组CRPC患者免疫及基因分子表型特征,针对不同靶标给予5例患者个体化治疗,其中2例接受阿比特龙治疗,1例接受EP方案治疗,1例接受EP方案联合阿比特龙治疗,1例接受EP方案联合贝伐单抗治疗,其PFS分别为4个月、8个月、10个月、6个月和12个月。结论1.CRPC是一组高度异质性的晚期恶性肿瘤,涉及PCa内分泌治疗获得性耐药的机制多样。2.前列腺癌内分泌治疗的免疫耐药机制包括:AR高表达,更低程度分化,NED,EMT转化以及SCPC。AURKA阳性更常见于p53突变蛋白表达者。3.前列腺癌内分泌治疗的分子耐药机制包括:TP53、KDR、MET、PIK3CA、KIT、PTEN、RB、APC以及EGFR突变。其中TP53是CRPC中最常见的突变基因,且大多数TP53突变与其它基因突变同时出现。4.根据不同的免疫表型转化及基因突变谱特征,给予本组患者个体化治疗方案取得了显著疗效,毒副作用小。5.CRPC是一类分子水平上高度异质性疾病,分子分型可以反映疾病本身的免疫及基因类型,可为治疗策略的选择提供依据,并提供重要的预后信息。在前列腺癌的不同阶段,应严密评估不同个体的体能状态和基因组学特征,对于复杂CRPC患者进行二次活检是有必要的。
严伟明[3]2018年在《动物视网膜色素变性及氢分子对其干预效果的研究》文中进行了进一步梳理视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一类遗传性视网膜退行性病变,光感受器细胞的死亡或功能丧失是其导致失明或低视力的根本原因。RP可分非综合征型和综合征型两种类型。非综合征型RP只在眼部有阳性表型,而综合征型RP除了有眼部表型外,还累及眼外组织器官,其中最常见的类型是伴有听力下降的Usher综合征。RP致病基因具有高度异质性,具体发病机制目前尚未完全研究清楚,临床上缺乏有效的防治措施。建立合适的动物疾病模型是开展RP发病机制、防治方式等研究的必要条件。RP动物模型主要有遗传型和诱导型两种。我们实验室前期发现两种疑似自发性遗传型RP小鼠模型。一种表现为遗传性视网膜电图(electroretinogram,ERG)无波形,与非综合征型RP相似;另一种除了存在遗传性视网膜电图无波形外,还存在听觉脑干诱发电位(auditory brainstem response,ABR)阈值明显升高,与综合征型RP里的Usher综合征类似。然而此两种小鼠的表型与基因型关系尚未完全明确。RP的发病机制与氧化应激有关。抗氧化治疗是被寄以厚望的干预RP的重要途径,然而临床上针对RP的抗氧化效果并未能得到充分肯定。氢分子(H2)是近年来发现的一种新型抗氧化剂,其通过选择性抗氧化、抗炎、抗凋亡等方式对多种疾病的防治有一定的积极作用。关于H2发挥作用的具体分子机制目前尚未有定论。有研究提示SIRT1(Sirtuin type 1)可能是介导H2发挥生物学效应的一个重要靶点。本实验室前期发现H2对N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea,MNU)诱导型RP大鼠模型中视网膜形态及功能的恶化有减轻作用,但H2发挥此作用的具体机制尚未阐明。此外,目前未有明确报道H2对遗传型RP是否有相似减轻效果。本研究对实验室前期发现的两种疑似遗传型RP小鼠模型进行鉴定,明确其表型与基因型关系,为后续研究提供动物模型;同时结合小动物眼科影像设备,对MNU诱导型RP大鼠模型的特点进行观察,重点关注该模型中SIRT1表达水平变化情况,为阐释H2减轻MNU诱导型RP大鼠模型的干预效果提供指标;之后运用SIRT1的激动剂白藜芦醇(Resveratrol,REV)就H2减轻MNU诱导型大鼠RP模型的机制进行初步探索,并就H2干预已鉴定的遗传型RP小鼠模型进行效果观察,以期探索RP新的干预措施及阐释H2发挥作用的分子机制。材料与方法实验一:遗传型非综合征型视网膜色素变性小鼠模型的鉴定选取实验室前期发现的疑似遗传型非综合征型RP小鼠(为同源近交系小鼠,分别命名为KM/rd和B6/rd小鼠),以相同种属背景的野生型小鼠为对照[Kunming(KM)和C57BL/6J小鼠]。运用ERG、眼底照相、荧光素钠眼底血管造影(Fluorecein fundus angiography,FFA)、视网膜光学相干断层扫描(Optical coherence tomography,OCT)、视网膜病理组织石蜡切片苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色等实验技术对KM/rd和B6/rd小鼠进行眼部表型观察;运用实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)、以及基因外显子测序对KM/rd和B6/rd小鼠进行基因型鉴定。此外,对B6/rd小鼠进行视网膜小胶质细胞标记物Ionized calcium-binding adapter molecule 1(Iba1)免疫荧光染色及SIRT1蛋白Western blot检测。实验二:遗传型综合征型视网膜色素变性小鼠模型的鉴定选取实验室前期发现的疑似遗传型综合征型RP(Usher综合征)小鼠(命名为KMush/ush小鼠),将雄性KMush/ush小鼠与雌性CBA/Ca J小鼠杂交得到F1代,再将F1代近交得F2代。每一代鼠在出生后21天(P21)时进行ERG、ABR检测。将F2代中ERG、ABR表型相同的小鼠筛选出来近交,保留表型与各自母代相同的后代鼠,继续近交传代,分别命名为CBA-1ush/ush小鼠(ERG幅值下降、ABR阈值低于50 d B);CBA-2ush/ush小鼠(ERG幅值正常、ABR阈值高于50 d B);CBA-3ush/ush小鼠(ERG幅值下降、ABR阈值高于50 d B);以及CBA小鼠(ERG幅值正常、ABR阈值低于50 d B)。对以上三种异常表型的小鼠(CBA-1ush/ush、CBA-2ush/ush、CBA-3ush/ush小鼠)分别采用眼底照相、OCT、FFA、视网膜病理组织石蜡切片HE染色等方法进行眼部表型鉴定;采用耳蜗病理组织石蜡切片及扫描电子显微镜观察CBA-2ush/ush、CBA-3ush/ush小鼠耳蜗表型。运用单基因外显子测序、全基因组外显子测序、Western blot、q RT-PCR鉴定相应品系小鼠的基因型。实验三:MNU诱导型视网膜色素变性大鼠模型的特点健康Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为正常组(N)、MNU低剂量组(L)和MNU高剂量组(H)。L、H组大鼠分别给予MNU 40,60 mg/kg腹腔注射,N组不作处理。造模后1天(D1)、D3、D7分别进行体重检测、ERG、眼底结构观察,同时取眼球标本进行视网膜病理组织学检查、Terminal deoxyuridine triphosphate nick-end labeling(TUNEL)凋亡染色、Iba1免疫荧光染色、SIRT1蛋白Western blot检测。实验四:H2减轻MNU诱导型视网膜色素变性大鼠模型的机制探索健康SD大鼠随机分为正常组(N)、模型组(M)和氢饱和生理盐水组(H2)。M和H2组大鼠在MNU注射诱导RP模型前14天(d),以及之后3 d内每天给予生理盐水和氢饱和生理盐水(hydrogen-richsaline,HRS)腹腔注射。在MNU注射后D1、D3,运用ERG和视网膜病理组织石蜡切片染色验证H2对MNU诱导型RP大鼠视网膜功能和结构的保护作用;之后进行视网膜小胶质细胞标记物Iba1免疫荧光染色,采用q RT-PCR检测各组大鼠视网膜内Iba1基因的m RNA水平;运用Western blot以及q RT-PCR检测视网膜内Sirt1基因的蛋白及m RNA表达水平。实验五:白藜芦醇对MNU诱导型视网膜色素变性大鼠模型的影响健康SD大鼠随机分为正常组(N)、模型组(M)和白藜芦醇(Resveratrol,REV)组(R)。M和R组大鼠在MNU注射诱导RP前、后分别给予相同剂量的REV溶剂或REV溶液灌胃。REV的灌胃剂量为造模后1天(D1)、D3每次200 mg/kg(治疗模式,为M1和R1组),或造模前5 d以及造模后3 d内每天50 mg/kg(预防+治疗模式,为M2和R2组)。在D1、D3,各组大鼠进行ERG、眼底照相、FFA、OCT,以及视网膜病理组织学检测。此外,采用视网膜Iba1免疫荧光染色,进行视网膜组织SIRT1蛋白Western blot检测,观察REV对MNU诱导型RP大鼠模型中的小胶质细胞活化以及SIRT1蛋白表达的影响。实验六:H2对遗传型视网膜色素变性模型rd1小鼠的干预效果研究选取实验一鉴定的遗传型非综合征型RP小鼠模型B6/rd小鼠(C57BL/6J小鼠背景),随机分成空白组和H2干预组。空白组小鼠不做任何干预,H2干预组小鼠分三种处理:从出生后7天(P7)至P21,每天一次给予氢饱和生理盐水腹腔注射10 mg/kg(为HRS组);或置于密封的容器中从出生开始到P21给予每天一次吸入高浓度氢气(44%)4小时(hour,h)(为hydrogen gas 1,HG1组);或置于密封的容器中从出生开始到P21,每天吸入高浓度氢气24 h(为HG2组)。分别在P14,P21检测各组小鼠多项指标,包括ERG、眼底照相、OCT、视网膜病理组织石蜡切片染色、视网膜Iba1免疫荧光染色及SIRT1蛋白Western blot检测,以评估H2对B6/rd小鼠的干预效果。结果1.眼底照相及FFA结果显示KM/rd和B6/rd小鼠眼底色素紊乱缺失、紊乱,视网膜血管萎缩。视网膜病理组织学分析显示KM/rd和B6/rd小鼠在P14视网膜外核层(Outer nuclear layer,ONL)细胞层数明显减少,到P21基本消失,ONL厚度与野生型小鼠间差异均有显著统计学意义(P<0.01)。ERG检测显示KM/rd和B6/rd小鼠在P14、P21未见明显波形。视网膜组织q RT-PCR结果显示,KM/rd和B6/rd小鼠在P21时Pde6b基因的m RNA表达量显著低于野生型小鼠(P<0.01)。Western blot结果显示,KM/rd和B6/rd小鼠在P21时视网膜内PDE6B蛋白不表达。外显子测序提示KM/rd和B6/rd小鼠Pde6b基因的第7外显子中存在无义突变(使第347个密码子TAC转变为终止密码子TAA)。B6/rd小鼠视网膜内SIRT1蛋白水平较野生型小鼠下降(P<0.05);其视网膜内Iba1阳性细胞数与野生型小鼠间差异有统计学意义(P<0.05)。2.KMush/ush与CBA/Ca J小鼠杂交得到的F1代小鼠具有正常的ERG和ABR反应,而F1代近交后得到的F2代小鼠出现RP和听力丧失两种表型的分离。CBA-1ush/ush小鼠具有RP表型,表现为ERG波形熄灭型、视网膜ONL消失,其Pde6b基因存在无义突变,导致相应蛋白翻译终止。该品系小鼠ABR阈值与野生型CBA/Ca J小鼠差异无统计学意义(P>0.05)。CBA-2ush/ush小鼠具有正常的视网膜功能和结构,其ABR阈值较野生型小鼠显著升高(P<0.05),与其耳蜗外毛细胞的静纤毛束大量缺失相应。全基因组外显子测序和单基因外显子测序提示CBA-2ush/ush小鼠Adgrv1基因第31外显子中一个碱基对缺失,导致终止密码子形成,使编码蛋白提前终止。CBA-2ush/ush小鼠视网膜内Adgrv1基因的m RNA表达量相对CBA/Ca J小鼠的下降(P<0.05)。CBA-3ush/ush小鼠具有RP表型、ABR阈值升高和耳蜗的外毛细胞静纤毛束缺失的表型,分别与Pde6b和Adgrv1基因无义突变相关。3.MNU注射后1周内,L、H组大鼠体重、ERG幅值逐渐下降,与N组间差异均均有统计学意义(P<0.05)。眼底照相见L、H组大鼠视盘轮廓增宽、脉络膜血管影略减少,于D7时较明显;FFA未见视网膜血管结构有明显改变。OCT及视网膜病理组织学检测可见L、H组ONL逐渐变薄,D7时H组ONL消失。MNU使大鼠视网膜内凋亡细胞数量增加,Iba1阳性细胞逐渐增多,呈一定的剂量效应关系。SIRT1蛋白Western blot结果可见,D1、D3、D7时H组大鼠视网膜内SIRT1蛋白表达水平显著下降(P<0.05);而L组SIRT1蛋白在D1时下降明显(P<0.05),在D3、D7表达量有下降趋势,但与N组差异无统计学意义(P>0.05)。4.在D1和D3时,H2组大鼠ERG幅值及ONL厚度均较M组的高,两组间差异均有统计学意义(P<0.05)。在D1时,H2组大鼠视网膜内Iba1阳性细胞数较M组略多(呈一定趋势),而在D3时H2组大鼠视网膜内Iba1阳性细胞数显著少于M组(P<0.05)。Iba1基因m RNA的q RT-PCR结果与免疫荧光染色结果一致,即D1时H2组Iba1基因m RNA表达量高于M组(P<0.05),而在D3时低于M组(P<0.05)。在D1和D3,M组大鼠视网膜内Sirt1基因的m RNA和蛋白表达量均较N组的下降(P<0.05);H2组Sirt1基因的m RNA和蛋白水平在两个时间点均较M组的高(P<0.05)。5.ERG结果显示,在D1、D3时,R组大鼠ERG幅值与M组间差异均无统计学意义(P>0.05)。OCT及视网膜病理组织学检查结果显示,R组大鼠视网膜ONL的厚度(细胞层数)与M组间差异无统计学意义(P>0.05)。在D3时,R组视网膜内凋亡细胞数目、Iba1阳性细胞数与模型组间差异均无统计学意义(P>0.05)。MNU给药后M组视网膜内SIRT1蛋白水平下降,而R1组在D1和D3时,以及R2组在D1时视网膜内SIRT1蛋白表达量与相应时间M组间差异均无统计学意义(P>0.05);R2组在D3时SIRT1蛋白表达量高于M2组D3时的SIRT1蛋白表达量,差异有统计学意义(P<0.05)。6.H2干预组(HRS、HG1、HG2)的rd1小鼠与空白对照组的rd1小鼠于P14、P21时ERG均未见有明显波形,二者ERG幅值间差异无统计学意义(P>0.05)。H2干预组小鼠于P14、P21时RP表型(视网膜血管硬化、色素紊乱)程度与空白组rd1小鼠相似,二者视网膜内RPE到OPL距离间差异未见统计学意义(P>0.05)。空白组小鼠视网膜内PDE6B蛋白不表达,SIRT1水平下降;H2干预组小鼠视网膜PDE6B也未检测到表达,其SIRT1表达量与空白对照组小鼠间差异无统计学意义(P>0.05)。H2干预组小鼠在P14、P21时在视网膜内Iba1阳性细胞数与空白对照组小鼠间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论1.KM/rd和B6/rd小鼠眼部表型和基因型与RP经典动物模型rd1小鼠一致,表明KM/rd和B6/rd小鼠可作为遗传型非综合征型RP小鼠模型。2.KMush/ush小鼠视网膜变性是由Pde6b基因突变引起的,而其听力受损是由Adgrv1基因突变引起的。CBA-1ush/ush小鼠可作为CBA/Ca J背景的RP模式小鼠。CBA-2ush/ush小鼠含Adgrv1基因突变,可在一定程度上模拟自发性遗传性USH2C模式小鼠。3.MNU使大鼠视网膜形态、功能渐进性恶化,与光感受器细胞凋亡相关。该诱导型RP模型中存在视网膜内小胶质细胞活化,Sirt1的m RNA、蛋白水平表达下降。4.H2能延缓MNU诱导型RP大鼠视网膜形态与功能的恶化。H2对该RP模型中小胶质细胞活化有一定调控作用,同时能上调该模型中Sirt1的m RNA和蛋白的表达水平。SIRT1可能是H2延缓MNU诱导型RP进展的一个分子靶点。5.SIRT1的激动剂REV无法减轻MNU诱导型RP大鼠模型中的光感受器细胞变性,可能与MNU消耗大量Nicotinamide Adenine Dinucleotide(NAD+)、阻碍SIRT1去乙酰化作用及其相应的保护性效应有关。H2对MNU诱导型RP的保护作用可能与其对NAD+代谢的调控有关。6.不同形式的H2(氢饱和生理盐水和氢气)对遗传型非综合征型RP模型rd1小鼠视网膜变性的病程无明显干预效果。遗传型RP模式小鼠中光感受器细胞凋亡的具体机制可能与诱导型RP模型中的不同。不同类型的RP可能需采用不同的药物进行干预。
张东锋[4]2015年在《WD临床表现—临床分型关系，基因型—表型关系和基因突变类型—青霉胺疗效关系的研究》文中研究指明课题背景肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration,HLD)是一种难治性的常染色体隐性遗传病,该病伴随典型的铜离子代谢障碍。1912年,由Wilson首次报告该病,因此肝豆状核变性又被称之为Wilson病(Wilson disease,WD),但目前导致该病出现铜代谢异常的分子机制仍不明确。肝豆状核变性因基础代谢障碍导致胆汁排铜明显减少,肝脏中铜不能通过和α2球蛋白结合生成铜蓝蛋白,导致血清中铜蓝蛋白减少,多余的血清铜与组织中蛋白结合沉积在相应的组织器官,进而导致出现多种功能障碍。铜在肝脏、脑组织、肾脏、胰腺、皮肤、关节、心脏、角膜等器官均可沉积,造成相应的组织器官损伤,其临床表现多以肝脏损害和神经系统损伤症状为主。研究表明,早期肝豆状核变性患者是可以治疗的,但是晚期患者常因出现多器官不可逆损伤导致治疗效果不理想。因此早期明确诊断,尽早治疗就极其重要。但是由于该病常累及多器官多系统,因此临床表现多种多样,目前尚无特异性诊断标准,误诊率较高,因此总结肝豆状核变性的临床特点,探讨疾病的发生发展规律,将为该病的诊断提供重要的参考。根据中华医学会神经病学分会制定的肝豆状核变性的诊断与治疗指南(2008年),按照临床表现对肝豆状核变性进行临床分型,将肝豆状核变性分为1.肝型;2.脑型;3.其它类型;4.混合型。按照临床分型对该病进行探讨,可以更好的总结临床病例,根据临床表现实验室检查结果对疾病的发生发展进行总结,有助于该病的诊断和治疗。13q14–21号染色体上的P型ATP酶功能(Copper–transport Ing P–type ATPase,ATP7B)发生基因突变,是肝豆状核变性的根本机制。A T P 7 B是转运铜的一类特殊的功能蛋白,如果编码A T P 7 B的基因发生突变,导致翻译的A T P 7 B蛋白质结构异常,进而出现结合铜离子障碍,即铜蓝蛋白合成减少,铜不能通过ATP7B跨膜转运出体外。体内多余的铜在诸如肝脏、脑组织、肾脏、胰腺、皮肤、关节等相应的器官组织积聚,出现多种临床表现。伴随着医疗技术检验手段和分子生物学的发展,基因的诊断方法也越来越多的应用于多种遗传病的诊断中,并且通过基因检测可以发现多种疾病的致病基因。在临床症状表现不典型患者、儿童及老年患者的诊断中,基因诊断技术就显得尤为重要,基因诊断是肝豆状核变性早期确诊的最有效方法。通过探讨,对研究肝豆状核变性的发病机制、疾病进展、临床治疗以及预后转归有着及其重要的参考意义。近年来,关于肝豆状核变性基因突变和临床表型关系的研究国内外学者已进行较多研究,但因肝豆状核变性患者基因型多样,临床表现复杂多变,并且不同地域不同种族其临床表现和基因突变类型均存在较大差异,因此目前尚无统一认识。目前肝豆状核变性的治疗仍以药物治疗为主,青霉胺作为铜离子螯合剂,具有疗效肯定、药源充足、廉价、使用方便等优点,因此是我国目前治疗肝豆状核变性的主要药物之一。根据基因突变的研究结果,观察不同基因突变类型患者使用青霉胺治疗的效果,可以为肝豆状核变性个体化治疗奠定基础。实验目的1.根据肝豆状核变性患者的临床特点,按照临床分型进行回顾性分析,提高对肝豆状核变性的诊断意识,发现疾病进展的规律,对不同临床症状的肝豆状核变性患者尽早明确诊断。2.发现我国肝豆状核变性患者高频突变位点和新的基因突变位点,为建立有效地基因筛查及早期诊断提供参考依据。3.研究我国肝豆状核变性患者主要基因突变位点的基因型与临床表型的相关性,探讨肝豆状核变性的发病机制,为肝豆状核变性的预防、诊断、治疗提供参。4.探讨肝豆状核变性不同基因突变类型对应用青霉胺治疗的差别,分析临床治疗效果是否与基因突变类型有相关性,为肝豆状核变性个体化治疗提供指导。实验方法本课题共包括四部分内容:第一章肝豆状核变性513例流行病学研究收集我院确诊为肝豆状核变性患者的基本临床资料,并收集整理统计相关检验、检查结果。根据临床表现将肝豆状核变性进行临床分型,将肝豆状核变性分为肝型、脑型、其它类型、混合型。按照临床分型对该病的首发症状、性别、血清铜、血清铜蓝蛋白、24h尿铜、血谷丙转氨酶(alan Ine am Inotra nsferase,ALT)、透明质酸(hyaluronic acid,HA)、Ⅲ型前胶原(precollagen typeⅢ,PCⅢ)、层黏蛋白(laminin,LN)、Ⅳ型胶原(collagenⅣ,CⅣ)的变化水平进行探讨。第二章WD基因突变位点的检测与分析收集我院2013年5月—2015年5月神经内科就诊治疗的患者52例,均确诊为肝豆状核变性,选取50例无亲缘关系的健康个体作为对照者,经检验24小时尿铜量、肝功能、血清铜蓝蛋白浓度、K-F环检查、腹部彩超等无异常,临床排除肝豆状核变性以及其他重大疾病。提取基因组DNA并进行P CR扩增,将PCR产物经Qiaquick Spin柱(德国Qiagen公司)纯化后,进行双向测序,对ATP7B基因的21个外显子及其启动子序列进行检查,查找所检样品中ATP7B基因中所存在的多态性位点。第三章肝豆状核变性患者基因型和临床表型关系的研究选取基因测序的52例WD患者为研究对象,收集上述患者的临床资料,以该研究中突变频率较高的第8外显子Arg778Leu突变、第13号外显子上Pro992Leu突变及突变类型作为基因型,将临床分型、性别、年龄、首发症状、K-F环、血清铜和铜蓝蛋白、24小时尿铜、ALT、肝纤维化血清学结果作为临床表型进行比较。探讨中国人WD患者高频基因突变位点的基因型与临床表型的相关性。第四章肝豆状核变性不同基因突变类型青霉胺治疗分析入组病例包括40例首诊的肝豆状核变性患者,将患者分为Arg778Leu突变组和非Arg778Leu突变组,均使用青霉胺进行驱铜治疗,定期于治疗后1、3、6、12月检测:血清铜、血清铜蓝蛋白、24小时尿铜、ALT、HA、PCIII、LN和IV-C,探讨不同基因突变类型的治疗效果。实验结果第一章肝豆状核变性513例流行病学研究1.入组病例包括肝型245例(47.8%),脑型180例(35.1%),其他类型35例(6.8%),混合型53例(10.3%)。以肝症状为首发症状者为271例(52.8%),以神经系统首发症状为201例(39.2%),以其他症状为首发症状者为41例(8%)。2.该研究发现,肝型、脑型与其他类型相比血清铜蓝蛋白水平存在显著差异;肝型、脑型、其他类型与混合型相比,血清铜蓝蛋白的改变具有统计学意义。混合型血清铜蓝蛋白降低更为明显。3.和脑型与混合型相比,肝型患者中血清ALT平均值显著升高(P<0.05)。4.HA、PCⅢ、LN、CⅣ在各临床分型间均在显著差异。其他类型的血清HA值与肝型、脑型和混合型存在显著差异;血清PCⅢ检测发现,其他类型与肝型、脑型和混合型相比差异具有统计学意义。血清LN检测发现,脑型、其他类型、混合型和肝型相比,脑型与混合型相比差异具有统计学意义;血清CⅣ检测,肝型、脑型与混合型相比差异具有统计学意义。5.肝纤维化或肝硬化各临床分型相比差异具有统计学意义。肝型患者中82%的患者超声检查显示肝纤维化或肝硬化,脑型、其他类型和混合型肝纤维化或肝硬化所占比例分别为:66%、43%、68%。因此肝型患者出现肝纤维化或肝硬化的比例远远高于其他类型的肝豆状核变性患者。第二章WD基因突变位点的检测与分析1.发现62个ATP7B变异位点,其中23个为已知的致病突变位点,6个为首次发现的错义、插入和缺失突变。2.第8、11、12和13外显子为高频率突变热点,并且碱基替换较其他突变类型更为常见,提示我们在WD患者人群中碱基替换是主要的突变类型。其中,位于第8外显子2333G>T检出频率最高(即Arg778Leu),达到47%。13号外显子2975C→T位点突变频率达22%。第三章肝豆状核变性患者基因型和临床表型关系的研究1.52例肝豆状核变性患者中Arg778Leu突变患者与非Arg778Leu突变患者之间临床分型、性别、年龄、首发症状、K-F环、血清铜和铜蓝蛋白、ALT、肝纤维化指标的差异无统计学意义(P>0.05)。2.52例肝豆状核变性患者中Pro992Leu突变与非Pro992Leu突变患者之间临床分型、性别、年龄、首发症状、K-F环、24小时尿铜、血清铜和铜蓝蛋白、肝纤维化指标的差异均无统计学意义(P>0.05)。3.52例肝豆状核变性患者中Arg778Leu突变24小时尿铜水平低于非Arg778Leu突变患者(P<0.05)。4.52例肝豆状核变性患者中Pro992Leu突变患者其ALT水平低于非Pro992Leu突变组(P<0.05)。第四章肝豆状核变性不同基因突变类型青霉胺治疗分析1.青霉胺治疗12个月后,Arg778Leu携带者24小时尿铜下降水平的更为明显(P<0.05)。2.青霉胺治疗12个月后,Arg778Leu突变组的IV-C的下降更为明显(P<0.05)。3.青霉胺治疗后Arg778Leu与血清铜、血清铜蓝蛋白、ALT、HA、PCIII和LN均未见明显相关性。结论1.各临床分型相比ALT、HA、PCⅢ、LN、CⅣ的差异具有统计学意义,肝纤维化或肝硬化与临床分型显著相关。2.发现有62个ATP7B变异位点,其中23个为已知的致病突变位点,6个为首次发现的错义、插入和缺失突变。3.第8、12和13外显子为我国人群高频率突变位点。4.52例Arg778Leu突变24小时尿铜水平低于非Arg778Leu突变患者;Pro992Leu突变患者其ALT水平低于非Pro992Leu突变组。5.52例Arg778Leu突变患者与非Arg778Leu突变患者之间临床分型、性别、年龄、首发症状、K-F环、血清铜和铜蓝蛋白、ALT、肝纤维化指标之间无显著性差异。6.52例P ro992Leu突变与非Pro992Leu突变患者之间临床分型、性别、年龄、首发症状、K-F环、24小时尿铜、血清铜和铜蓝蛋白、肝纤维化指标之间无显著性差异。7.青霉胺治疗后12个月Arg778Leu突变组较非Arg778Leu突变组24小时尿铜下降的更为明显;青霉胺治疗后12个月Arg778Leu突变组较非Arg778Leu突变组IV-C的下降更为明显。8.青霉胺治疗后Arg778Leu突变组较非Arg778Leu突变组血清铜、血清铜蓝蛋白、ALT、HA、PCIII和LN的改变未见明显差异。
李雪峰[5]2012年在《转染LMP-1基因人脂肪间充质干细胞与退变髓核细胞体外双层细胞微球三维条件下共培养的实验研究》文中提出目的：探讨人退变髓核细胞的体外分离、培养扩增及鉴定方法，并观察细胞微球三维培养对其生物学特性的影响。方法：收集25例人退变椎间盘手术髓核标本组织，体外采用0.025%的Ⅱ型胶原酶消化法将原代髓核细胞分离并连续培养扩增传代。利用倒置相差显微镜观察髓核细胞形态变化，通过Ⅱ型胶原及aggrecan免疫荧光化学染色法鉴定髓核细胞类软骨表型分子的表达。分别采用常规单层培养和细胞微球三维培养退变髓核细胞，共设3个观察时间点（7、14、21天）。通过RT-PCR方法检测两组细胞aggrecan、Ⅱ型胶原及SOX-9等基因的表达变化。结果：应用0.025%的Ⅱ型胶原酶37℃消化4小时即可分离出一定数量的原代人退变髓核细胞；体外培养观察发现其平均8天贴壁，细胞呈梭形、类圆形或多角性，细胞达到80%融合平均约需4周。免疫荧光化学及甲苯胺蓝染色法检测发现分离培养的髓核细胞可表达Ⅱ型胶原及aggrecan蛋白。RT-PCR检测结果显示细胞微球三维培养组髓核细胞aggrecan、Ⅱ型胶原蛋白及SOX-9基因的表达显著高于单层培养组（P<0.05）。结论：采用0.025%的Ⅱ型胶原酶消化法可从退变椎间盘手术标本中分离出一定数量退变髓核细胞。该细胞呈类软骨表型（表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原）。与常规单层培养相比，细胞微球三维培养可较好地保持其类软骨表型。目的：体外分离、培养扩增人脂肪组织来源的间充质干细胞，并通过流式细胞仪及多向诱导分化对其干细胞特性进行鉴定。方法：取10例剖腹产手术皮下脂肪标本，采用0.075%的Ⅰ型胶原酶消化法结合反复贴壁法分离培养并纯化人脂肪间充质干细胞；倒置显微镜下观察细胞形态变化，流式细胞仪检测干细胞表型分子。随后分别在单层和细胞微球三维环境下诱导人脂肪间充质干细胞定向成脂、成骨及成软骨分化，并采用油红O染色、Alizareen染色、Safranin’O染色、甲苯胺蓝染色、aggrecan及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色法检测。此外，应用RT-PCR方法检测单层诱导和细胞微球三维诱导环境下，人脂肪干细胞成软骨分化后的基因表达。结果：应用0.075%的Ⅰ型胶原酶37℃消化约1小时即可分离出较多的人脂肪间充质干细胞。原代人脂肪干细胞平均3天贴壁，达到80%融合约需9天；传至3代后，转变成均一的长梭形，并呈漩涡状排列。流式细胞仪检测分析发现人脂肪间充质干细胞高表达CD29、CD90、CD105分子，低表达CD34、CD45分子及HLA-DR。单层环境下多向诱导21天后，油红O染色、Alizareen染色、Safranin’O染色均呈阳性。细胞微球三维环境下成软骨诱导21天后，细胞团呈明显的软骨样形态，切片HE染色可见清晰的软骨特征样的细胞和细胞外基质分层排列。甲苯胺蓝、Masson三色染色、及II型胶原、aggrecan免疫组化染色均呈阳性。RT-PCR结果显示细胞微球三维环境下诱导的人脂肪干细胞软骨样表型基因（aggrecan、Ⅱ型胶原及SOX-9）高于单层诱导组（P<0.05）。结论：通过Ⅰ型胶原酶消化结合反复贴壁法可获得大量纯化的人脂肪间充质干细胞，该细胞体外具有多向分化潜能，并且细胞微球三维诱导环境更适合其成软骨分化。目的：构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体并对其进行鉴定，以获得高滴度的携带LMP-1基因慢病毒载体用于脂肪干细胞的转染。观察LMP-1基因对细胞微球三维诱导环境下人脂肪间充质干细胞成软骨分化效应的影响。方法：根据人LMP-1基因（GeneBank序号：NM_005451）mRNA，设计并合成全基因的引物。从购买的cDNA文库中，利用PCR方法钓取目的基因。将目的基因与酶切线性化的载体进行定向交换，其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。最后将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提得到较高滴度、可表达LMP-1-GFP基因及GFP基因的慢病毒载体。并分别用于转染脂肪干细胞得到表达LMP-1-GFP基因或GFP基因的人脂肪干细胞。将转染LMP-1-GFP基因和GFP基因的人脂肪干细胞分别置于细胞微球三维环境中进行成软骨诱导分化。其中，转染LMP-1-GFP基因的脂肪干细胞分别采用含TGF-β3的成软骨诱导基和不含TGF-β3的成软骨基础诱导基进行成软骨诱导，同时用含TGF-β3的软骨诱导基对单纯表达GFP基因的脂肪干细胞进行成软骨诱导并设为对照组。诱导21天后，采用RT-PCR方法检测各组诱导细胞软骨表型基因的表达，观察LMP-1基因能否诱导细胞微球三维环境下人脂肪干细胞成软骨分化及其与TGF-β3诱导效应之间是否存在差异。结果：通过上述方法获得了高滴度(2x109TU/ml)的携带LMP-1基因的慢病毒。成软骨诱导对比实验表明TGF-β3诱导的转染LMP-1基因的人脂肪干细胞成软骨分化效应最强，其次为采用不含TGF-β3的成软骨基础诱导基诱导的转染LMP-1基因的脂肪干细胞，而采用含TGF-β3的成软骨诱导基诱导的转染GFP基因的人脂肪干细胞分化效应相对较弱，各组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论：慢病毒是一种良好的基因转导载体工具，可有效地转染人脂肪干细胞并获得相关基因大量表达。与BMP-2、-7成软骨效应类似，LMP-1基因也可诱导细胞微球三维诱导环境下人脂肪干细胞成软骨分化，并且该效应高于传统的诱导因子TGF-β3。此外，两者之间存在协同效应。目的：观察并检测LMP-1基因对人脂肪间充质干细胞与退变髓核细胞在双层微球微球共培养环境下相互效应的影响，并分析相关机制。方法：采用携带LMP-1-GFP或GFP基因的慢病毒载体转染人脂肪间充质干细胞，获得表达LMP-1-GFP或GFP基因的人脂肪干细胞。将其与退变髓核细胞在双层细胞微球三维环境下共培养，同时设立混合细胞微球三维共培养及单独细胞微球三维培养组作为对照。共设立7个细胞培养组，分别为转染GFP基因脂肪干细胞三维细胞微球单独培养组，转染GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞混合细胞微球三维共培养组、转染GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞双层细胞微球三维共培养组、转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞三维细胞微球单独培养组、转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞混合细胞微球三维共培养组、转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞双层细胞微球三维共培养组及髓核细胞三维细胞微球单独培养组。设立3个观察时间点：7、14、21天，采用阿利新蓝法检测各自蛋白聚糖含量，并通过流式细胞分选方法将表达GFP基因的脂肪干细胞与GFP表达阴性髓核细胞分离开来，采用RT-PCR方法检测共培养脂肪干细胞和退变髓核细胞各自aggrecan、Ⅰ、Ⅱ型胶原及SOX-9基因表达变化，并与单独培养组相比较。此外，我们还采用Western-blot蛋白免疫电泳法对各培养组脂肪干细胞上述基因变化在蛋白水平的表达进行了检测。结果：自培养的第14天起，双层细胞微球三维共培养组蛋白多糖合成高于其余各细胞培养组（P<0.05）,此外，转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞与髓核细胞共培养组蛋白多糖合成量显著高于转染GFP基因脂肪干细胞与髓核细胞共培养组（P<0.05）。RT-PCR检测显示，自培养第7天起，细胞微球三维共培养组髓核细胞Ⅱ型胶原、SOX-9及Aggrecan等基因表达均高于单独髓核细胞三维微球培养组(P<0.05)。但双层细胞微球三维共培养组髓核细胞上述基因表达与混合细胞微球三维共培养组髓核细胞表达无显著性差异(P>0.05)。此外，与转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞共培养髓核细胞Ⅱ型胶原、SOX-9及Aggrecan基因表达高于与转染GFP基因脂肪干细胞共培养髓核细胞（P<0.05）。此外，所有细胞微球三维培养组髓核细胞Ⅰ型胶原基因表达均随时间增长逐渐降低（P<0.05）。除I型胶原外，脂肪干细胞三维细胞微球单独培养组未见上述基因表达。双层细胞微球三维共培养组脂肪干细胞上述基因表达高于混合细胞微球三维共培养组（P<0.05）。此外，转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞上述基因表达高于转染GFP基因脂肪干细胞（P<0.05）。三维细胞微球单独培养组脂肪干细胞Ⅰ型胶原基因表达逐渐增高，但细胞微球三维共培养组脂肪干细胞Ⅰ型胶原基因表达呈逐渐下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。此外，除I型胶原外，双层细胞微球三维共培养组转染GFP基因脂肪干细胞上述基因表达高于混合细胞微球三维共培养组转染LMP-1基因脂肪干细胞（P<0.05）。结论：双层细胞微球三维共培养较混合细胞微球三维共培养更有利于髓核细胞对脂肪干细胞的类软骨诱导效应，同时，LMP-1基因可增强此效应，但双层共培养方式占主导作用。此外，脂肪干细胞对髓核细胞具有一定的营养效应，LMP-1基因也可增强此效应，而细胞微球三维共培养方式（双层或混合）对该效应无明显影响（P>0.05）。
杨淑涵[6]2017年在《孤独症谱系障碍患儿的催产素、催产素受体与γ-氨基丁酸A型受体基因多态性及其康复效果的研究》文中研究指明目的孤独症谱系障碍(ASD)是一种以社会沟通和社会互动障碍及局限的、重复的行为、兴趣或活动为特征的复杂的神经发育障碍,男女比例约为4~5:1。近40年来,全球ASD的患病率呈持续上升的趋势,但其确切病因及有效治疗的方法至今尚未明确。本研究的目的包括3个方面:(1)探索血清催产素(OT)水平、催产素受体(OXTR)基因的单核苷酸多态性(SNP)片断rs2254298位点的基因多态性与ASD的病因、ASD儿童和青少年的症状表型及早期行为发育表型的关系,为ASD的发病机制及不同催产素能系统异常ASD患儿的康复及治疗重点提供理论依据;(2)探索γ-氨基丁酸A型受体(GABAA)的GABRB3 SNP rs2081648、GABRB3 SNP rs1426217、GABRA5 SNP rs35586628及GABRG3 SNP rs208129位点的基因多态性与ASD的病因、ASD儿童和青少年的症状表型及早期行为发育表型的关系,为ASD的发病机制及不同GABRB3、GABRA5和GABRG3基因型ASD患儿的康复及治疗重点提供理论依据;(3)对社区康复项目中已完成3次专业评估的学龄前ASD儿童的康复效果进行评价,了解可能影响其康复效果的相关因素,为有效改善ASD患儿的相关缺陷提供理论依据。综上所述,本研究意在通过对ASD患儿的病因及康复方面的探讨揭示可能影响其发病、症状、早期行为及康复效果的因素,从而为ASD患儿的诊断、康复与治疗重点提供指导性思路。方法1.采用流行病学调查的方法,依照《儿童早期行为发育调查表》收集ASD患儿的早期行为发育情况。依照《孤独症谱系障碍儿童康复干预状况家长调查表》收集社区康复项目中学龄前ASD儿童的疑似症状、诊断及干预等情况。2.采用儿童孤独症行为量表(ABC)和儿童孤独症评定量表(CARS)对所有ASD患儿的症状表型进行评估。针对社区康复项目中学龄前ASD儿童,又添加了克氏孤独症行为量表(CABS)、发展及行为量表(PEP-R)以及皮博迪图片词汇测试(PPVT)的评估。3.采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定55名ASD及110名正常发育(TD)儿童和青少年的血清OT水平,进行组间血清OT水平的比较和血清OT水平与ASD儿童和青少年症状表型的相关分析。4.采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)检测100名ASD与232名TD儿童和青少年OXTR SNP rs2254298位点的基因多态性,比较两组间基因型和等位基因频率的分布情况以及该位点基因型与ASD儿童和青少年的血清OT水平、症状表型及早期行为发育表型的关系。采用同样的方法检测社区康复项目中已完成3次专业评估的16名学龄前ASD儿童相同位点的基因多态性并分析各基因型与其康复效果的关系。5.采用TaqMan探针实时荧光定量PCR法检测99名ASD与231名TD儿童和青少年的GABRB3 SNPs rs2081648和rs1426217、GABRA5 SNP rs35586628及GABRG3 SNP rs208129位点的基因多态性,比较两组间各基因型和等位基因频率的分布情况以及各位点与ASD儿童和青少年的症状表型和早期行为发育表型的关系。采用同样的方法检测社区康复项目中已完成3次专业评估的16名学龄前ASD儿童4个相同位点的基因多态性并分析各基因型与其康复效果的关系。6.采用Haploview4.2进行Hardy-Weinberg平衡检验;采用SPSS17.0和SAS9.3.2软件包,根据资料特征分别采用χ2检验、有序Logistic回归分析(控制协变量)、独立样本t检验、秩和检验、协方差分析(ANCOVA)(控制协变量)、Pearson相关和Spearman偏相关(控制协变量)分析以及重复测量方差分析等方法对数据进行统计学处理。多组间的两两比较均采用Bonferroni校正。检验水准α=0.05。结果1.ASD组的血清OT水平高于TD组(P<0.05)且ASD组的血清OT水平与CARS的“环境适应”得分及CARS总分均呈正相关关系(P<0.05)。2.OXTR SNP rs2254298位点在ASD组与TD组的基因型和等位基因频率分布的差异均无统计学意义且ASD组的基因型与早期行为发育表型无关(P>0.05)。但ASD组的基因型与血清OT水平、ABC的“躯体运动”得分及CARS的“环境适应”得分均存在关联(P<0.05)。3.GABRB3 SNPs rs2081648和rs1426217、GABRA5 SNP rs35586628及GABRG3 SNP rs208129位点在ASD组与TD组的基因型和等位基因频率分布的差异均无统计学意义(P>0.05)。但在ASD组,GABRB3 SNP rs2081648位点的基因型与CARS的“视觉反应”得分、早期行为发育表型的“向母亲微笑”及“自己抓东西”的时间早晚有关(P<0.05);GABRA5 SNP rs35586628位点的基因型与CARS的“语言交流”得分有关(P<0.05);GABRG3 SNP rs208129位点的基因型与CARS的“模仿”和“活动水平”得分及早期行为发育表型的“开始控制大小便”的时间早晚有关(P<0.05)。4.社区康复项目中已完成3次专业评估的学龄前ASD儿童的第1次与第2次评估的时间间隔为8.05±0.84月,第2次与第3次评估的时间间隔为7.05±0.70月。3次评估时所有领域P的月龄(实际的发展月龄)均小于E的月龄(可能提升到的月龄)及实际月龄,且P的月龄与实际月龄间的差异均有统计学意义(P<0.05)。5.社区康复项中学龄前ASD儿童的“发育康复效果”在“认知理解”方面改善最好。患儿的“症状康复效果”改善则更明显,在3次评估间,ABC的“社会交往”得分、“语言”得分及总分均呈下降趋势,且第1次与第2次及第3次的差异均有统计学意义(P<0.05)。CARS总分与PEP-R行为部分的“游戏及对物件的兴趣”得分也呈下降趋势且第1次与第3次的差异有统计学意义(P<0.05)。智商则呈上升的趋势且第1次与第3次的差异有统计学意义(P<0.05)。6.“发育康复效果”不同领域间存在正相关(P<0.05)、且与“最早干预月龄”、“第1次评估时月龄”、“CABS总分”、PEP-R行为部分的“语言”得分及“总分”呈负相关(P<0.05)。除OXTR SNP rs2254298位点的基因型与“发育康复效果”无关外,GABRB3 SNP rs2081648位点的基因型与“模仿”、“知觉”及“认知理解”领域的“发育康复效果”有关;GABRB3 SNP rs1426217位点的基因型与“手眼协调”领域的“发育康复效果”有关;GABRA5 SNP rs35586628位点的基因型与“知觉”及“认知表达”领域的“发育康复效果”有关;GABRG3SNP rs208129位点的基因型与“知觉”、“小肌肉”及“认知表达”领域的“发育康复效果”有关(P均<0.05)。7.“症状康复效果”不同领域间存在正相关(P<0.05)、且与“最早干预月龄”、第1次评估时ABC的“躯体运动”与“感觉”得分及CARS总分呈负相关(P<0.05)。但与5个位点均无关联(P>0.05)。结论1.ASD儿童和青少年存在OT的代谢紊乱,这种异常可能是受OXTR基因表达改变、外界环境刺激以及症状严重程度的影响。2.未发现OXTR SNP rs225429位点的基因多态性与ASD患儿的发病、早期行为发育表型及康复效果有关,但发现其与ASD儿童和青少年的症状表型有关。提示在ASD患儿的康复工作中应重视该位点在症状方面的特殊作用并制定个性化的干预方案。3.未发现GABAA受体4个位点的基因多态性与ASD患儿的发病有关。但在ASD儿童和青少年中,GABRB3 SNP rs2081648、GABRA5 SNP rs35586628及GABRG3 SNP rs208129位点的基因型与其症状表型有关;GABRB3 SNP rs2081648和GABRG3 SNP rs208129位点的基因型与其早期行为发育表型有关。在社区康复项目的学龄前ASD儿童中,4个位点基因型均与其“发育康复效果”有关。提示在ASD患儿的康复工作中应重视GABAA受体4个位点基因型的特殊作用并制定个性化的干预方案。4.社区康复项目中学龄前ASD儿童存在发育迟缓,其“发育康复效果”不如“症状康复效果”明显,这可能是受自身发育、基因、康复干预强度与重点、早期干预与评估时间以及症状严重程度的影响。
佚名[7]2010年在《基础免疫》文中研究指明脂筏在tmTNF-α反向信号传递中的作用陈克清刘涛于敏胡雪娜冯玮姜小丹王晶李卓娅华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉430030背景及目的:脂筏是位于细胞膜上的富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域,目前认为脂筏作为信号转导的平台发挥重要的生物学功能。前期工作证明跨膜TNF-α(tmTNF-α)不仅可以传递正向信号,也能作为受体向自身胞内传递信号,即反向信号。tmTNF-α的反向信号表现为NF-κB持续性活化。有
曾雅畅[8]2014年在《慢病毒介导RNA干扰联合人β-珠蛋白基因导入对翻译突变型β-地中海贫血基因治疗的基础研究》文中研究说明研究背景β-地中海贫血是一种对人类健康危害严重的遗传性溶血性贫血病，是因β-珠蛋白基因及其调控序列的点突变或缺失致使β-珠蛋白肽链合成减少或完全停止。β-地中海贫血的发病机制中有一类属于翻译缺陷型：突变或减少的编码序列引起的终止密码子，使得β-珠蛋白基因信使RNA合成中断，导致β-珠蛋白肽链无法正常合成，而发生β0地中海贫血，如移码突变CD41-42（-CTTT）突变和CD27/28(+C)。这不仅使患者血红蛋白水平降低，而且使原来在数量上与之持平的α-珠蛋白肽链相对过剩，这些相对过剩的游离α-珠蛋白肽链并不能形成稳定的四聚体，它们沉积在红细胞中导致了大量无效红细胞生成和红细胞膜破坏而导致红细胞寿命缩短，而β-珠蛋白根本无法表达而引起了严重的溶血性贫血。近年来，新型病毒载体HIV慢病毒载体已经成功的运用到了β-地中海贫血的基因治疗中，尤其是剪接缺陷型β-地中海贫血，这类地中海贫血可以通过慢病毒介导RNA干扰可以使得例如内含子1（如IVS-I-110,IVS1-6,IVS1-5）或者内含子2的异常剪接（如IVS-II-654，IVS-II-745）的前体mRNA的剪接位点的异常表达的反义序列恢复，从而恢复正确的拼接序列，最终恢复血红蛋白的合成[1-7]。但是针对翻译缺陷型地中海贫血类型基因治疗的研究较少，这类型地中海贫血因为缺失片段大，现阶段无法通过RNA修复及干扰技术将其恢复正常碱基表达和肽链结构从而改善血红蛋白表达。所以只能通过导入正常人β蛋白基因补充或降低α-珠蛋白基因表达来调整α/β珠蛋白比例，但是α-珠蛋白基因干扰的有效率，β-珠蛋白基因及其调控片段的稳定表达的有效性，及α/β比例控制及协调的长期稳定性一直没有得到有效的印证。同时此类型的β重型地中海贫血基因敲除小鼠子代（th3/th3）常常死于妊娠后期，而使得该小鼠模型的研究一直受阻。本课题在人红白血病细胞株K562细胞研究的基础上针对了广西最常见β-地中海贫血CD41-42突变型等翻译缺陷型地中海贫血类型，设计将2个慢病毒载体，即全长人β-珠蛋白基因慢病毒载体及α-珠蛋白基因干扰片段慢病毒载体，同时将2个慢病毒载体导入K562细胞以实现升高β-珠蛋白和降低α-珠蛋白表达来调整α/β珠蛋白比例的构想，为不同类型地中海贫血基因治疗提供更有效的证据及策略。同时对翻译突变型CD41-42型基因载体的设计及细胞模型的构建为进一步地中海贫血基因敲除小鼠模型及体内基因治疗的实施做好基础研究的准备。研究目标1.PCR扩增全长人β-珠蛋白基因，将目的基因片段和慢病毒载体连接，筛选获得慢病毒表达载体LV-β-globin（GFP），并进行测序验证。包装病毒，测定病毒浓度。2.验证K562细胞上α-珠蛋白基因的mRNA表达情况，模拟β0地中海贫血的细胞模型。3.设计及合成4个针对α-珠蛋白基因的RNAi慢病毒载体（RFP）。将4个载体稳定转染K562细胞，realtimePCR检测α-珠蛋白mRNA表达及干扰效率，筛选最有效的1个干扰片段用于后续实验。4.将构建好的全长人β-珠蛋白基因慢病毒及α-珠蛋白基因RNAi慢病毒稳定转染K562细胞。检测α-珠蛋白及β-珠蛋白基因mRNA及蛋白表达，观察基因添加及干扰效果，以验证α/β珠蛋白比例调节使得β0型地中海贫血症状得到缓解的研究目的。方法1.提取人β-珠蛋白表达正常者的DNA，PCR扩增全长2100bp人β-珠蛋白基因片段，加上SphI和NotI两个酶切位点进行T载体克隆，获得重组质粒pUC57-β-globin。用限制性内切酶，将目的基因片段和慢病毒载体pLVEF1a/GFP+Puro连接，筛选获得慢病毒表达载体LV-β-globin，并进行测序验证。验证后将慢病毒载体转染293T细胞，包装病毒，测定病毒滴度。2.将人慢性髓原白血病细胞K562细胞培养至对数增长期，选取人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87作为对照组，进行α-珠蛋白基因（Hbα2）RNA检测，检测Hbα2含量。设计目的基因及内参基因GAPDH引物，real-timePCR检测α-珠蛋白基因mRNA（Hbα2）含量。3.针对目的基因序列，利用RNA干扰序列设计原则，根据设计经验和设计软件评估，选择4个最佳的动力学参数RNA干扰靶点序列。分别命名为Hbα2-RNAi(1)，Hbα2-RNAi(2)，Hbα2-RNAi(3)，Hbα2-RNAi(4)。合成含干扰序列的单链DNAoligo，退火配对产生双链，再通过其两端所含酶切位点AgeI和EcoRI直接连入酶切后的慢病毒载体骨架PGCSIL-017上；将连接产物转入制备好的感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子后，送测序验证。4.将人β-珠蛋白基因慢病毒LV-β-globin加入生长状态良好的K562细胞。感染3天后，观察感染效率及细胞荧光表达情况。在已经稳定转染了LV-β-globin的K562细胞接种到适宜密度后加入高MOI值筛选后的α-globin-RNAi慢病毒，感染3天后，观察感染效率及细胞荧光情况，运用流式细胞仪检测荧光效率。稳定转染后的K562细胞株，提取细胞总RNA，运用real-timePCR检测K562细胞中α-珠蛋白基因（Hbα2）及β-珠蛋白基因（HBB）mRNA表达情况。再运用westernblotting检测α-珠蛋白及β-珠蛋白的蛋白表达情况。结果1.通过PCR获得长度为2128bp带有SphI和NotI序列的全长人β-珠蛋白基因。pUC57载体和慢病毒表达载体LV连接，慢病毒表达载体LV-β-globin构建成功，序列正确。提示成功构建包装含人正常β-珠蛋白基因的慢病毒载体。2.结果显示Hbα2在K562中的表达丰度为高，在MCF-7，HEPG2中的表达丰度为中，在U87中的表达丰度为低。验证实验结果提示人慢性髓原白血病细胞K562细胞含有红系特性，高量表达α-珠蛋白基因（Hbα2）适宜作为本实验模型细胞，模拟β0表现的翻译缺陷型地中海贫血血液细胞。3.显示连接入vshRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为342bp，没有连接入vshRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为307bp。测序结果经比对确认为正确的克隆。PCR验证结果及测序结果一致，对选择的4个慢病毒载体转染293T进行包装。4个α-globin-RNAi干扰载体的包装滴度分别为LV-Hbα2-RNAi(1)3×108TU/ml、LV-Hbα2-RNAi(2)2×108TU/ml，LV-Hbα2-RNAi(3)2×108TU/ml、LV-Hbα2-RNAi(4)3×108TU/ml。调整好K562细胞状态，将4个慢病毒颗粒分别对K562细胞进行感染，感染3天后荧光显微镜下观察RFPRFP表达情况，荧光率达80％以上，收集细胞抽提RNA，反转录为cDNA，real-timePCR检测目的基因α-珠蛋白基因Hbα2的mRNA表达水平。从定量PCR结果可以看出，K562细胞中，相对于NC阴性对照组，KD2（LV-Hbα2-RNAi/2)组Hbα2基因敲减效率达到76.5%（P<0.05），认为是α-珠蛋白基因Hbα2的有效靶点。对有效靶点进行大量的慢病毒包装，包装后观察荧光表达，浓缩病毒最后滴度为6×108TU/ml。4.人β-珠蛋白基因慢病毒LV-β-globin转染K562细胞72h后，细胞发出GFP，且显示有大量荧光表达，流式细胞检测荧光效率94.8%，而空白组K562细胞中无荧光表达。α-globin-RNAi慢病毒转染已经稳定表达人β-珠蛋白基因的K562细胞，感染72h后，红色滤片下观察细胞发出RFP，同时用GFP滤片观察，同样细胞表达GFP，流式细胞检测双色荧光感染效率为91.3%，显示2个慢病毒均在细胞中稳定转染及表达，而空白组K562细胞中只有GFP表达，无RFP表达。用RT-PCR检测β-珠蛋白基因扩增得到227bp的特异性条带，α-珠蛋白表达得到85bp的特异性条带,realtimePCR检测β-珠蛋白基因mRNA2-ΔΔCt值4.080±0.078，α-珠蛋白mRNA2-ΔΔCt值0.274±0.023，提示2个慢病毒转染后β-珠蛋白基因mRNA水平高表达于对照组4.08倍（P<0.05），α-珠蛋白基因mRNA抑制率达到了72.3%（P<0.05）。运用人类α-及β-珠蛋白单克隆抗体进行了westernblotting检测，发现在稳定转染后的K562细胞中人β-珠蛋白的合成明显高于空白组和阴性对照组，而α-珠蛋白的合成则明显低于空白组和阴性对照组。westernblotting检测发现β-珠蛋白蛋白灰度值值为1.063±0.082，表达较基础值增高3.6倍（P<0.05），而α-珠蛋白蛋白灰度值值为0.327±0.042，表达明显减弱，蛋白水平干扰率达68.3%（P<0.05），差异均有统计学意义。结论本研究首次成功将构建好的人β-珠蛋白基因及α-珠蛋白基因siRNA两种慢病毒载体高效、稳定转染进K562细胞。研究中2种慢病毒转染后β-珠蛋白基因mRNA水平高于对照组4.08倍，蛋白水平高表达于对照组3.6倍，α-珠蛋白基因mRNA水平抑制率达到72.3%，蛋白水平抑制率达68.3%，明显高于国内外既往研究。实现以调整了α/β珠蛋白的表达的基因治疗理念，为使β0型地中海贫血症状得到缓解奠定了治疗基础，为β0型基因敲除小鼠模型的基因治疗实施做好细胞基础研究的准备。目的：构建β-地中海贫血CD41-42突变基因和含基因调控区HS2、HS3全基因片段的真核表达重组载体，为β-地中海贫血CD41-42突变基因治疗的细胞模型奠定。方法：设计合成β-地中海贫血CD41-42突变纯合子患者的DNA的特异性引物，扩增LCR基因座控制区和CD41-42突变基因，插入载体pcDNA3.1-中，筛选阳性重组体，通过酶切分析及PCR进行鉴定。结果：扩增出2.1kbCD41-42突变基因及基因座控制区5.5kbLCR片段，酶切及测序结果证明成功构建的重组载体成功，测序结果和引入方向正确。结论：成功构建了含人β-地中海贫血CD41-42基因的重组载体。目的：构建β-地中海贫血CD41-42突变型重组载体pEGFP-C2-CD41-42和K562CD41-42细胞，为β-地中海贫血CD41-42型细胞、小鼠模型建立及进一步基因治疗提供依据。方法：应用β-地中海贫血CD41-42突变的纯合子患者外周血中提取DNA,PCR扩增含有βCD41-42的β-珠蛋白基因片段。将PCR产物βCD41-42珠蛋白基因克隆到pEGFP-C2载体中,用脂质体2000将pEGFP-C2-βCD41-42质粒转染K562细胞,观察转染后βCD41-42在K562荧光表达情况。RT-PCR技术检测βCD41-42在K562细胞中的表达。结果:重组质粒pEGFP-C2-βCD41-42转染K562细胞显示24h后细胞发出GFP，G418筛选后，显示有大量荧光表达。RT-PCR扩增得到227bp的特异性条带,而稳定转染pEGFP-C2空质粒的K562细胞中特异性条带不表达。结论:成功构建βCD41-42真核表达K562CD41-42细胞,为β-地中海贫血的基因治疗的体外干扰治疗和β-地中海贫血CD41-42型突变的小鼠模型的构建奠定了工作基础。目的：构建介导人β-地中海贫血CD41-42突变基因为目的基因的慢病毒载体，为该病基因治疗的细胞模型和转基因小鼠的建立提供基础。方法：抽提β-地中海贫血CD41-42突变纯合子患者的DNA，设计合成相应特异性引物，PCR扩增CD41-42突变基因，加上SphI和NotI两个酶切位点进行T载体克隆，通过筛选获得重组质粒。用限制性内切酶，将目的基因片段和LV慢病毒载体连接，转入感受态细胞，筛选获得慢病毒表达载体LV-βCD41-42，并进行测序。将慢病毒载体转染293T细胞，包装病毒，测定病毒浓度。结果：通过PCR获得长度为2100bp带有SphI和NotI序列的目的基因。pUC57载体和慢病毒表达载体LV连接，慢病毒表达载体LV-βCD41-42构建成功，序列正确。结论：成功构建并包装含β-地中海贫血CD41-42突变基因的人慢病毒。
李涛[9]1997年在《高血压和肾病综合征基因治疗的实验研究》文中进行了进一步梳理为探讨多基因疾病基因治疗的可行性，我们在体细胞基因治疗的基础上提出了开展多基因疾病表型基因治疗的设想，即主要针对疾病的症状而忽视其遗传基础的基因治疗方法。就象在体内建立一座微型药厂，它可以源源不断地为患者提供基因药物。这对于基因产品，尤其是半寿期极短的小分子物质尤为有用。如果该方法可行，将大大提高基因治疗的适应性和灵活性。 为检验这种设想是否合理、可行，我们以具有利尿、利纳和降低血压作用等广泛作用的心钠素(atrial natriuretic peptide，ANP)作为功能基因，以具有相关症状的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)和肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)动物模型作为研究的初始对象，用基因治疗的原理和方法首次对经体细胞转移后的ANP的生理作用进行了研究。最后在SHR大鼠体内观察到了明显的降压和利尿作用，在NS大鼠体内观察到了明显的利尿作用。在此项工作的过程中，首次发现了一种特殊的人体细胞(HEFT)。该细胞不仅在体外培养时可以高水平地表达、分泌人的ANP(hANP)，而且在用胶原法对SHR大鼠进行异种移植后，同样观察到了明显的降压作用。本工作的主要内容和结果如下： 1、rANP逆转录病毒表达重组体的构建 为筛选rANP高水平表达的重组体，利用DNA重组技术对rANP基因与逆转录病毒载体的内部启动子5’LTR、巨细胞病毒启动子CMVp以及血管紧张素原的启动子ATp进行了重组，获得了四种rANP表达重组体，分别是pLT61、pLT62、pLT8和pLT9。 2、PA317包装细胞系的转染 为了给基因治疗提供能持续分泌携带有rANP基因的重组缺陷型逆转录病毒颗粒的产毒细胞系，采用脂质体介导法把重组体pLT61、pLT62、pLT8和pLT9分别转染进PA317包装细胞，用G418筛选抗性细胞克隆，扩增并测定病毒滴度，用放射免疫学方法(RIA)检测rANP的表达、分泌情况，保存表达水平较高的克隆PA317／pLT61和PA317／pLT8。
庞全海[10]2005年在《山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究》文中研究说明骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来自于骨髓的两种干细胞之一,在人、小鼠、大鼠、兔、猪等许多物种的研究证明了该类干细胞具有体外分化为多种细胞表型的能力,有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的主要种子细胞之一。但是,迄今未见关于山羊,特别是成年山羊骨髓间充质干细胞分离、培养、分化等方面的系统研究报道。本研究目的在于阐明山羊骨髓间充质干细胞的生物学性能及其分化潜能,以便未来利用该类细胞作为疾病细胞/基因治疗的模型,以及利用该类细胞作为细胞生物反应器体外生产生物活性物质,进而建立山羊骨髓间充质干细胞细胞系。为此,本试验利用成年关中奶山羊为对象,较为系统全面地研究了其骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增、形态学、生长特性、细胞表面标志,以及体外诱导分化能力。结果如下:1. 本试验应用贴壁分离法或密度梯度离心法成功分离获得关中奶山羊髂骨骨髓间充质干细胞,体外培养到第21 代,仍然保持其干细胞的特性,并已扩增到2.8×108细胞。2. 本试验所分离的关中奶山羊骨髓间充质干细胞呈多角形、三角形或长梭形,类似于人和其他物种的间充质干细胞。3. 扫描电镜下,山羊骨髓间充质干细胞表面较为粗糙,有多个突起,并有较多微棘和丝突,当多个细胞同时存在时,这些丝突相互搭接成网状。透射电镜下,山羊骨髓间充质干细胞的结构与其他物种基本相似,即表现为细胞内有大量扩张的粗面内质网、线粒体,分泌功能旺盛,具有该类细胞的典型特征:细胞核质比大、胞浆中细胞器少、核仁明显处于功能静息期。4. 免疫细胞化学分析表明,山羊骨髓间充质干细胞能够表达间充质干细胞的表面标志CD29、CD44、CD105、CD106 以及CD166(阳性),而不表达造血干细胞的标志CD14、CD34、CD45、c-kit (阴性),和其他物种的骨髓间充质干细胞相似。这些标志的检测有助于鉴定间充质干细胞。但本试验还发现,山羊骨髓间充质干细胞也表达TGF-α,其意义需要进一步阐明。5. 山羊骨髓间充质干细胞可以在体外用5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞表型,能够表达α-actin 抗原,呈PAS 染色阳性,并分泌糖原,从而为未来利用这种细胞进行心脏疾病细胞/基因治疗的模型研究提供了科学依据。同时,这也是和骨髓造血干细胞的区别之一。6. 用HGF 和尼克酰胺向胰岛β-细胞诱导后,山羊骨髓间充质干细胞能够变为较典
参考文献：
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[10]. 山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究[D]. 庞全海. 西北农林科技大学. 2005
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