岳阳市二人民医院检验科 湖南岳阳 414000
【摘 要】目的 评估血浆中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）和血清胱抑素C（cystatin C，CysC）对于心脏外科手术后发生急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的早期诊断与预测价值。方法 77例心脏外科术后患者纳入到本研究中。对于18例术后发生了AKI与59例术后没有发生AKI的患者，术前、术后3h、术后6h、术后12h、术后24h以及术后48h检测其血浆NGAL、血清CysC以及血清肌酐（serum creatinine，SCr）的含量。绘制受试者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲线，评估以上标志物预测AKI发生的能力。结果 和非AKI组相比，AKI组在术后3h血浆NGAL开始明显升高，到术后48h则缓慢下降到正常水平。与非AKI组相比，AKI组的血清CysC在术后6h出现升高。术前术后的SCr值没有变化。通过分析ROC曲线发现，术后3h血浆NGAL的曲线下面积（area under curve，AUC）为0.897（95%置信区间：0.806～0.988，P<0.05），敏感性为88.9%，特异性为93.2%。术后6h血浆NGAL 的AUC为0.926（95%置信区间：0.862～0.989，P<0.05），特异性降为88.1%；血清CysC的AUC为0826（95%置信区间：0.696～0.956，P<0.05），敏感性为72.2%，特异性为89.8%。NGAL和CysC都是预测心脏外科手术后发生AKI的非常灵敏的标志物。但与CysC相比，血浆NGAL被认为是预测心脏外科手术后发生AKI更优良的标志物。结论 与血清CysC和SCr相比，在预测心脏外科手术后AKI早期阶段的肾损伤方面血浆NGAL具有更高的临床价值。
【关键词】中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；胱抑素C；急性肾损伤
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是一种由各种因素引起的临床综合征，临床表现多种多样，从轻微的肾损伤到严重的肾功能衰竭都属于AKI [1]。AKI较易发生在体外循环与其他心脏外科手术后，与患病率、死亡率以及住院时间的延长密切相关。之前存在肾损伤或是同时患有多种疾病的患者在心脏外科术后并发AKI的情况更多见[2]。然而，多数AKI无明显临床症状，其早期阶段肾功能还没有出现改变，但肾脏的微观形态学已经发生改变，现有的一些检测指标如血清肌酐（serum creatinine，SCr）都是主要反映肾功能改变的指标[1]。同时，SCr水平可受年龄，性别，种族，肌肉量，饮食等非肾性因素的影响[1，3]。当下降25-50%的肾功能后SCr才出现改变，不能很好的反映急性损伤，从而延误AKI的诊断[4]。所以需要一种优于肌酐（creatinine，Cr）的能够反映早期肾损伤的标志物，让临床医生及早治疗心脏外科手术后发生的AKI并避免进一步的肾脏损害。
最近，新的标志物比如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）和胱抑素C（cystatin C，CysC）有望提供肾损伤的早期诊断，发展为肾损伤的风险预后评估指标，成为研究热点。
NGAL属于脂质运载蛋白家族成员，是从人中性粒细胞继发颗粒中分离出来的新型蛋白分子，并可共价结合于中性粒细胞的明胶酶，相对分子质量为25000 [1，5，6]。NGAL在正常人的多种组织中低表达，包括肾脏、气管、胃、结肠等[6，7]。蛋白质组学分析显示当存在肾脏缺血或是毒性损伤时，NGAL是最早并大量表达的蛋白之一。有横向研究通过western blotting发现患有AKI的成年人其尿液与血清当中NGAL含量明显高于正常对照组。许多研究都显示NGAL是检测人类AKI的较为敏感的指标[1，8-9]。CysC是一种13 kDa大小的非糖基化蛋白，属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂，可由所有有核细胞产生，血清中CysC的水平不受肌量的影响。CysC通过肾小球过滤，然后被肾小管重吸收以及代谢，当尿中出现CsyC水平的升高说明肾小管出现了损害[3，10]。最近有研究报道，在危重患者中血清CysC要早于SCr检测出AKI的发生，是潜在的优于SCr与肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）的预测肾功能受损的标志物[10，11]。本研究通过观测心脏外科手术后血浆NGAL与血清CysC水平的动态变化，探讨NGAL与CysC是否是预测心脏外科手术后AKI发生的早期标志物。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2014年7月至2016年1月在本院接受心脏外科手术的患者192例，手术方式包括下冠状动脉旁路移植术、心脏瓣膜置换手术、主动脉弓置换术，先天性心脏病修补术。样本收集过程中排除以下情况：①年龄＜18岁和＞85岁的患者②患有慢性感染③恶性肿瘤④有糖尿病及高血压病史⑤入院前已出现肾功能不全⑥术前或术后3天内存在泌尿系感染的患者。并剔除了资料不完整的病例以及术中或术后48小时死亡的病例。最后，纳入到研究中的患者为77例，其中男性患者42例，女性患者35例，平均年龄为58.38±12.74岁。
根据术后是否发展成AKI将患者分为AKI组与非AKI组。AKI组共18例，平均年龄为57.06±13.99岁，其中男性患者10例，女性患者8例；非AKI组共59例，平均年龄为58.78±12.43岁，包括男性患者32例，女性患者27例。AKI组与非AKI组年龄、性别之间无统计学差异。AKI的诊断标准根据2012年KDIGO的标准，其基于RIFLE/AKIN定义，即SCr在48小时内增加 ≥26.5μmol/L，或SCr值较基线值增加 ≥50% [12]。基线Cr值的确立采用患者1～2年前的最低SCr值，对于没有SCr值记录的患者采用入院时的SCr值（如果Cr在正常参考值范围内）作为基线Cr值。
1.2 方法 收集患者术前以及术后3h、6h、12h、24h、48h的空腹血液标本，标本采集后15分钟内2000g离心10分钟，取上层血清-70℃保存。检测SCr、血浆NGAL、血清CysC的含量。SCr检测采用肌氨酸氧化酶法，试剂购自新健康成公司，仪器为BECKMAN COULTER AU5800生化仪。血浆NGAL采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测，试剂为美国R&D公司生产，按照试剂盒说明书操作。血清CysC检测采用免疫比浊法，试剂购自湖南永和阳光公司，检测仪器为BECKMAN COULTER AU5800生化仪。
1.3 统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。符合正态分布的数据资料以均数±标准差（± s）表示。组间数据比较采用两独立样本t检验方法，不同时间点检测指标间的比较采用方差分析。不符合正态分布和方差齐性时，组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。绘制受试者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲线并计算曲线下面积（area under curve，AUC）。以P＜0.05为具有统计学意义。
2 结果
2.1AKI组与非AKI组术前术后SCr、血浆NGAL、血清CysC的动态变化
2.1.1 AKI组与非AKI组在术前、术后SCr的动态变化
从表1中可以发现，对于AKI组，心脏外科手术完成48h后SCr的水平才出现明显升高。
2.1.3AKI组与非AKI组在术前、术后血清CysC的动态变化
结果见表3，在心脏外科手术后6h，AKI组患者血清CysC的含量出现上升，且高于非AKI组血清CysC水平。随着时间延长，术后12h、24h、48h的血清CysC水平仍然高于术前以及非AKI组水平。
注：与手术前结果相比，a P<0.05；与非AKI组比较，b P<0.05。
2.2 血浆NGAL与血清CysC在心脏外科术后发生AKI早期诊断中的意义。
主要观测在术后早期即3h与6h血浆NGAL与血清CysC预测AKI的诊断价值。术后3h，血浆NGAL用于诊断心脏外科手术后AKI发生的ROC曲线如图1所示，AUC为0.897（P <0.05），95%的置信区间为0.806～0.988。血浆NGAL的cut-off值设为75.4 ng/mL时，血浆NGAL诊断AKI的敏感性为88.9%，特异性达到93.2%；对于血清CysC，由于术后3h血清CysC无明显变化，故在此不做讨论。术后6h，血浆NGAL与血清CysC用于诊断心脏外科手术后AKI发生的ROC曲线如图2所示，血浆NGAL的AUC为0.926（P <0.05），95%的置信区间为0.862～0.989；血清CysC的AUC为0.826（P <0.05），95%的置信区间为0.696～ 0.956；而SCr的AUC只有0.499（P>0.05）。取同样的cut-off值血浆NGAL诊断AKI的敏感性为88.9%，特异性降为88.1%；对于血清CysC，cut-off值设为1.06 mg/L时，血清CysC诊断AKI中的敏感性为72.2%，特异性为89.8%。
3 讨论
AKI较易发生在体外循环术以及其他心脏外科手术后，与死亡率以及住院时间的延长密切相关。临床上之前存在肾损伤或是同时患有多种疾病的患者在心脏外科术后并发AKI更加多见。然而多数AKI无明显临床症状，在发生AKI的早期阶段肾脏主要是结构上的改变，在此阶段现有的检测指标SCr往往并不会出现改变。待肾脏出现滤过功能性改变时SCr才出现升高[1]。大量研究表明丢失25-50%的肾功能后，SCr才出现改变。通常在受损24-48小时后才出现上升[4，。本研究中，AKI组在心脏外科手术后48小时SCr才出现明显升高。同时，SCr水平易受年龄、性别、种族、肌肉量、肌肉代谢、药物、饮食、营养等非肾性因素的影响[1，3]，因此SCr不能及时预测AKI的发生，错过了临床上AKI的最佳干预治疗时间。临床上迫切需要相对于传统诊断标志物的能够早期预测AKI的检测标志物。
NGAL在正常肾组织、气管、胃、结肠等部位低表达，因此在健康正常个体的全身循环中只能检测到低水平的NGAL。当肾脏出现缺血性损伤或是其他肾损伤全身系统性诱导NGAL的表达增加，而免疫细胞应答一定程度上也诱导了NGAL的表达。国内外许多研究发现血液、尿液NGAL是临床上诊断与预测各种疾病AKI发生的非常有潜力的新型标志物，研究对象加起来超过7000例。心脏外科手术后容易发生AKI，因此NGAL的随访非常有利于早期诊断。本研究发现，术后3小时AKI组的血浆NGAL水平上升为94.28±12.45 ng/L，术后6小时达到112.9±18.44 ng/L，与术前以及非AKI组相比血浆NGAL水平明显升高。此时，血清CysC与SCr的水平均没有出现变化。我们的研究结果与Tuladhar等人的研究结果一致[15]。还有研究显示，在体外循环术后，发展成AKI的患儿其血、尿NGAL在术后2h就有明显升高。全身循环中的NGAL主要来源于肾外的组织器官如肝和肺，小部分来源于中性粒细胞、巨噬细胞以及其他免疫细胞。血循环NGAL升高的原因有许多，AKI导致远隔器官NGAL的 mRNA表达增加尤其在肝脏和肺，过度表达的NGAL蛋白释放到血循环中的循环池，而作为急性时相反应蛋白，来源于中性粒细胞、巨噬细胞以及其他免疫细胞的NGAL也进入循环池，引起血循环的NGAL升高。除了以上肾外产生的NGAL，AKI患者GFR的降低导致肾脏对NGAL清除减少也促成了血循环中NGAL的增加。
CysC是一个13 KDa大小的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，编码CysC的基因属于管家基因。几乎所有的有核细胞都能够以恒定的速率产生CysC，能够自由滤过肾小球并完全重吸收，，并且不受年龄、性别、种族、肌量的影响，被认为是较理想的评估GFR的标志物[3，10，16]。CysC水平的升高与肾损伤相关，与GFR的减少具有相关性，CysC是潜在的优于SCr与GFR的预测肾损伤的指标。我们发现AKI组血清CysC含量在心脏外科术后6小时开始出现升高，达到1.22±0.26 mg/L，此结果与Tuladhar以及Krawczeski等人的结果相符[14，15]。本研究数据显示，AKI组心脏外科手术后24小时内血浆NGAL与血清CysC水平都有明显升高，而SCr水平直到术后48小时才出现升高，可见NGAL和CysC都是预测心脏外科手术后发生AKI的非常灵敏的标志物。
通过对ROC曲线的分析发现，术后3小时血浆NGAL AUC为 0.897，明显高于血清CysC与SCr的AUC，当血浆NGAL的cut-off值设为75.4 ng/mL时，血浆NGAL诊断AKI的敏感性为88.9%，特异性达到93.2%。术后6小时，血浆NGAL的AUC为0.926（P <0.05），血清CysC的AUC为0.826（P <0.05），而SCr的AUC只有0.499（P>0.05）。在术后6h阶段，血浆NGAL取同样的cut-off值时其诊断AKI的敏感性为88.9%，特异性降为88.1%；设置血清CysC的cut-off值1.06 mg/L，其诊断AKI中的敏感性为72.2%，特异性为89.8%。可以看出，血清CysC诊断AKI的AUC稍低于血浆NGAL，敏感性也低于血浆NGAL。
本研究表明血浆NGAL这种新型的肾损伤标志物在心脏外科手术后发生AKI的患者中明显升高；另外一种新型肾功能检测指标血清CysC在心脏外科手术后发生AKI患者中也显示出一定的升高。NGAL在数小时内就能升高而预示肾损伤的出现，而SCr水平一直都很稳定直到24-48小时才出现升高。血浆NGAL与血清CysC在诊断心脏外科手术后发生AKI要早于传统指标24小时以上，都是优于SCr的早期诊断急性肾损伤的指标。与CysC相比，在预测心脏外科手术后AKI早期阶段的肾损伤方面血浆NGAL具有更高的临床价值。让临床医生能及早诊断与治疗AKI，避免进一步的肾损伤。
本研究也存在一些缺陷。首先，我们诊断AKI是采用SCr作为金标准，SCr反映肾损伤灵敏度不高，只有在肾功能出现明显的丢失时SCr才有变化。因此SCr正常而NGAL升高的患者会被误归于非AKI组而影响我们对血浆NGAL诊断价值的判断。样本量的不足以及单一的研究单位也使得研究受限。
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第一作者简介：
王锴佳（1984-），女，主管检验师，硕士，主要从事临床生化检验。
论文作者:王锴佳,唐露萍
论文发表刊物:《航空军医》2016年第10期
论文发表时间:2016/7/19
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