孔涵楚[1]2017年在《新型β-N-乙酰己糖胺酶抑制剂糖基噻唑啉分子设计、合成及生物活性研究》文中指出几丁质主要存在于真菌细胞壁和节肢动物的外骨骼当中,而在植物、人及其他高等生物中没有分布,因此,几丁质相关代谢酶作为新型绿色农药靶标成为近年来的学科热点,对其相关抑制剂的设计合成具有很好的研究意义。自然界中,几丁质通过18家族的几丁质酶水解为几丁寡糖,再由20家族的β-N-乙酰己糖胺酶进一步水解为最小单元乙酰氨基葡萄糖,其中,β-N-乙酰己糖胺酶由于催化机理明确被广泛研究,在过去数十年中,已经发现多种针对β-N-乙酰己糖胺酶的小分子抑制剂,而糖基噻唑啉抑制剂NAG-thiazoline是目前唯一被证明为过渡态模拟抑制剂分子,并表现出极高的酶抑制活性,本论文将基于这一特殊结构进行新型抑制剂分子的设计、合成以及生物活性研究。(一)葡萄糖基噻唑啉类抑制剂的设计、合成。1.以氨基葡萄糖盐酸盐为原料对NAG-thiazoline(NGT)分子进行合成方法研究,并对糖环3,6-位羟基进行修饰方法的探索,考察化合物与酶+1亚位的结合;2.在NAG-thiazoline分子与酶-1亚位结合的关键结构噻唑啉环外引入取代芳香基团,得到8个新型酶抑制剂,目标化合物2与16个未知中间体均通过1HNMR、13CNMR和HRMS的确证。3.在噻唑啉环外引入迭氮基团,再与相应炔烃通过点击反应得到系列叁唑类化合物,共经过九步反应得到6个叁唑类抑制剂分子,目标化合物3与6个未知中间体均通过1HNMR、13CNMR和HRMS的确证。4.尝试对反式NAG-thiazoline分子进行设计合成,并得到关环反应前体化合物。(二)甘露糖基噻唑啉类抑制剂的设计、合成。1.以乙酰氨基甘露糖为原料,在保持糖基噻唑啉特殊结构基础上,将噻唑啉环翻转,首次合成了甘露糖基噻唑啉骨架结构的NAM-thiazoline分子化合物4。2.在噻唑啉环末端引入取代氨基,合成了19个NNMT系列衍生物,目标化合物5与38个未知中间体均通过1H NMR、13C NMR和HRMS的确证。并通过考察链长及芳香性对化合物酶抑制活性的影响,探究这一类新型抑制剂结构与活性的关系。(叁)生物活性的测定1.酶抑制活性的测定:对两个家族多种生物体内的β-N-乙酰己糖胺酶进行抑制活性测定,结果表明,所有化合物对20家族酶的抑制活性较差,但是部分化合物对84家族酶表现出较高的抑制活性,实现了家族间的选择性。其中,取代芳基系列NGT-B-1(IC50=12.6μM,hOGA)和NGT-B-5(IC50=12.5μM,OfOGA)活性较好,表明化合物活性与芳环取代基结构有关;化合物6-位吲哚乙酰基NGT分子在25uM、5uM浓度下对ofOGA酶抑制率分别达到93%,82%,接近NGT的抑制活性,表明在该位置引入较大基团对活性影响较小,引入的基团可能进入了酶活性口袋之外的+1亚位结合区域,适合进一步的衍生工作;甘露糖基噻唑啉系列衍生物对84家族酶hOGA表现出明显的活性规律,噻唑啉环外为小于四个碳原子的直链取代基时化合物活性较高,而当环外为大于四个碳原子或者支链取代基时几乎不表现出抑制活性。化合物结构与活性的关系表明,该类化合物与NGT作用方式相似,抑制剂与酶结合强弱程度与分子大小相关,分子对接实验验证了该类抑制剂的噻唑啉环同样进入了酶的-1亚位而导致无法容纳过大的取代基团,同时由于不同家族活性口袋的大小具有差异而导致家族间选择性的产生。2.首次对目标酶抑制剂进行活体杀虫活性测定,其中化合物NGT-B-1、NGT-B-2、NNMT-4、NNMT-12和NNMT-15在600 mg/L的测定浓度下,对小菜蛾具有较高的杀虫活性,且多数化合物对其生长发育具有明显抑制作用。3.首次对目标酶抑制剂进行农药抑菌活性测定,部分化合物在50μg/mL浓度下对棉花立枯病原菌,油菜菌核病原菌及番茄晚疫病原菌具有较好的抑菌活性。
关婉怡[2]2011年在《N-乙酰氨基葡萄糖/半乳糖核苷酸及类似物的酶法合成与应用研究》文中研究表明糖类(包括单糖、寡糖和多糖)及糖缀合物广泛存在于从低等的细菌到高等的动植物等所有生物体中,不仅是重要的结构组分,而且作为信息分子在许多关键的生物过程中发挥着不可替代的作用。糖链结构的特定改变与特定的病理状态(如炎症和肿瘤)密切相关,表明糖链在临床诊断中的应用潜力和作为药物研发靶标的可能性。N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)两种N-乙酰氨基己糖是常见的单糖,它们是细菌细胞壁骨架和糖胺聚糖的重要组分,也存在于糖蛋白、糖脂糖链的核心结构中,还影响着分子间(如可通过蛋白的O-GlcNAc糖基化修饰调控信号转导途径)或细胞间(如GalNAc存在的糖脂影响细胞相互作用、细胞分化等过程)的相互作用。研究含有这两种单糖的寡糖、多糖及糖缀合物,可以辅助人们了解生理、病理过程和研发药物。细菌表面包被有结构复杂的多糖,其中脂多糖(LPS)和荚膜多糖(CPS)均为共价连接于细胞表面,都由多个重复单元组成,都具有高度的结构多样性,也都是细菌致病的重要的毒力因子。一些细菌的CPS还具有与人类自身的多糖相同或相似的结构。研究这两种细菌表面多糖及它们的生物合成过程,既有助于开发细菌感染性疾病的预防和治疗方法,又有助于用低成本的方法生产无致病病毒污染的多糖。研究糖链的生物功能,就要获得结构均一且明确的含糖化合物。由于从生物来源分离的糖或糖缀合物的糖链结构具有微不均一性,化学合成操作复杂、收率比较低,而生物体内糖链合成途径中的糖基转移酶可以高效合成区位特异性和立体特异性的糖苷键,所以用糖基转移酶(主要是Leloir型糖基转移酶)合成结构均一的糖链已成为有机化学合成糖链的有效替代途径。不过,有机化学合成在合成非天然糖方面具有优势,可以为天然化合物提供结构多样的衍生物,为药物开发提供更多可能的靶标；非天然糖也可能带有易于进一步标记的基团,可以促进对糖类代谢的研究。将化学合成的灵活性与酶法合成的高效高特异性结合(即化学酶法合成),就有可能实现糖的结构类似物的高效合成,是近年来广泛应用于糖生物学研究领域的重要手段。糖核苷酸是单糖的异头碳与核苷二磷酸或核苷一磷酸连接形成的衍生物,是单糖的活化形式。糖核苷酸作为糖基转移酶催化的转糖基反应的糖基供体,是生物体合成糖链和糖缀合物必需的前体；天然糖核苷酸的结构类似物还可能作为酶的抑制剂或作为研究分析糖缀合物生物合成途径的工具,因此,高效地制备天然和非天然的糖核苷酸对生物化学及药物化学研究意义重大。生物体内糖核苷酸的补救合成途径步骤少,操作简单,是酶法合成糖核苷酸常用的合成路线。UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc分别是GlcNAc和GalNAc的糖基供体,在生物体内,它们都可通过几种途径合成,也包括补救途径。在补救途径中,GalNAc可以在GalNAc1-位激酶和UDP-GalNAc焦磷酸化酶的先后作用下被转化为UDP-GalNAc,以往的报道所用的酶都是来源于哺乳动物的。而GlcNAc要经过GlcNAc激酶.GlcNAc磷酸变位酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶叁个酶依次作用,才被转化为UDP-GlcNAc。缺少GlcNAc1-位激酶导致很难用酶法合成GlcNAc-1-P这一合成UDP-GlcNAc的关键中间体,也导致GlcNAc-1-P价格昂贵,还限制了GlcNAc-1-P结构类似物的酶法合成,制约了以GlcNAc-1-P及其类似物为实验材料的研究工作的开展。糖核苷酸也是价格昂贵的实验材料,对研究有重要意义的糖核苷酸结构类似物还无法从商业途径获得,因此,大量合成糖核苷酸及其结构类似物也是糖生物学领域的一个研究热点。本论文的目标之一是解决酶法合成GlcNAc/GalNAc-1-P及其结构类似物的问题,并进而实现UDP-GlcNAc/GalNAc及其结构类似物的酶法合成。来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的N-乙酰氨基己糖1-位激酶(NahK)是文献中报道的第一个GlcNAc1-位激酶,可以将GlcNAc一步磷酸化成GlcNAc-1-P;它对GlcNAc和GalNAc具有相近的反应速率,也可以看作GalNAc1-位激酶,是第一个来源于细菌的具有该活性的酶；它对ManNAc也有一定活性,说明这个酶对底物结构的要求比较宽松。论文第二章克隆了NahK,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中以C端带有His6标签的融合蛋白形式过量表达,经过Ni柱和分子筛层析纯化后,重组NahK纯度可达到95%以上。我们综合考虑了糖的侧链基团的空间位阻、羟基的键型、脱氧,以及便于进一步反应等因素,设计了C2-,C3-,C4-和C6-位有结构变化的GlcNAc/GalNAc结构类似物,试验NahK对它们的活性。包括GlcNAc和GalNAc在内,一共试验了25种糖,其中的19种被NahK转化成相应的1-磷酸糖并用硅胶柱层析分离得到产物,收率达到60%以上的有14种。除了试验NahK对GlcNAc/GalNAc结构类似物的活性,γ位带S原子的ATP也被用于NahK的反应,且产物收率和ATP为磷酸供体时的收率相当,说明这个S原子没有对NahK的反应产生太大影响。利用NahK的反应和硅胶层析法,GlcNAc-1-P的合成成本大大降低；而NahK表现出的广泛的底物特异性又使它可以用于GlcNAc/GalNAc-1-P结构类似物的制备,为UDP-GlcNAc/GalNAc结构类似物的酶法合成奠定了基础。第叁章在第二章制备的1-磷酸糖的基础上,克隆了来源于大肠杆菌的GlmU (UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)和来源于人的AGX1 (UDP-GalNAc焦磷酸化酶),分别用大肠杆菌重组表达为N端带His6标签的融合蛋白。用Ni柱和分子筛层析纯化后,两种酶均有活性,但它们表现出不同的底物特异性。天然底物为GlcNAc-1-P的GlmU对试验中用到的大部分GlcNAc构型的糖-1-P衍生物具有活性,即使C2-位没有酰胺基,在延长反应时间时,也以中等收率合成出糖核苷酸。但它对GalNAc构型的糖-1-P衍生物的活性有限,只对C4-和C6-位修饰的衍生物表现出一些活性。而对GalNAc-1-P的活性高于对GlcNAc-1-P的AGX1对实验用到的大多数GlcNAc/GalNAc-1-P结构类似物表现出较高的活性。另外,含s原子的糖-1-P被GlmU转化为相应的糖核苷酸,产物可以用于糖基转移酶性质的研究。利用离子交换和分子筛层析法,我们分离得到了UDP-GlcNAc/GalNAc及其结构类似物,它们可以用于糖基转移酶等酶的性质研究和糖链结构类似物的制备,而且我们建立了一种比较简便的制备非天然糖核苷酸的方法。研究糖基转移酶的性质,传统的方法需要对待测分子进行放射性或荧光标记,还需要将分子分离出来才能检测。在本论文第四章,我们建立了一种新的分析糖基转移酶性质的方法(SAMDI MS)。这种方法将自组装单分子层(SAMs)和MALDI-TOF MS结合起来,不需要标记待测分子,用较短时间、仅消耗微量样品,即可通过反应液的质谱结果定性、定量地分析糖基转移酶催化的反应。以来源于脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的β1,3-GlcNAc转移酶LgtA为例,我们用SAMDI MS法分析了该酶的底物特异性,并测定了供体底物的动力学参数,展示了该方法在糖基转移酶性质研究中的应用前景。GlcNAc/GalNAc存在于许多具有重要生理功能的糖结构(如糖蛋白、肽聚糖和糖胺聚糖)中,越来越多的研究关注于利用化学修饰的非天然糖取代多糖中的GlcNAc/GalNAc残基和调节这些糖苷的功能。论文第五章向大肠杆菌培养基中添加了2-ketoGlc (GlcNAc结构类似物),用可发生化学选择性反应的试剂在菌体表面和细菌LPS核心寡糖中检测到了含有酮基的糖,证明2-ketoGlc可以通过体内整合到大肠杆菌的表面多糖中,从概念上证明了除了岩藻糖衍生物,其他特定的单糖衍生物也可以被整合入细菌表面的多糖。但由于2-ketoGlc有多种可能的代谢途径,尚没有精确地确定出核心寡糖中被修饰的残基。透明质酸(HA)在美容、医药等领域广泛应用,对它的改造往往通过化学修饰进行。A型巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)的CPS具有透明质酸的结构,我们尝试用A型巴斯德氏菌的透明质酸合酶(PmHAS)的可溶段为工具酶,以带有生物正交基团的非天然糖核苷酸(UDP-2-ketoGlc)直接合成HA的衍生物。可能由于检测方法灵敏度不高,或者UDP-2-ketoGlc无法被PmHAS(T)利用,在产物HA中没有检测到酮基。进一步的研究仍在进行中。总之,本论文应用两种来源于细菌的酶和一种来源于人的酶,建立了一种酶法合成、层析法分离制备UDP-GlcNAc/GalNAc及其结构类似物的方法,获得了糖核苷酸类似物,并用它们研究了来源于细菌的GlcNAc糖基转移酶的性质和细菌多糖的合成。分析糖基转移酶性质时,还建立了一种不需要标记和分离目标分子的新方法。
范文静[3]2018年在《3位碳分枝的Kdo类似物的合成研究》文中研究指明3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(Kdo)是3-脱氧-2-酮糖酸家族的成员之一。Kdo主要存在于革兰氏阴性菌外膜脂多糖(LPS)的核心区域。Kdo类似物是治疗耐药菌引起的疾病的潜在药物,因此合成新型的Kdo类似物对于开发新型抗耐药菌的药物具有重要意义。Kdo残基作为酸性酮糖,其3位碳的反应活性受到1位羰基吸电子效应及3位羟基缺失的影响,3位碳分枝的Kdo类似物的立体专一性合成具有很大的不确定性,至今无相关文献报道其合成。本文报道了一种高效合成3位碳分枝的单Kdo与双Kdo类似物的方法,其中所用的重要合成砌块3位碘取代的Kdo糖烯是由全乙酰化的Kdo乙酯在NIS/TMSOTf的条件下通过一步反应制得。基于3位碘取代的Kdo糖烯与端炔之间的Sonogashira偶联反应,并且将所得偶联产物3位碳分枝的单Kdo与双Kdo烯炔类似物继续进行不对称氢化反应及皂化反应,可立体专一性得到2-脱氧-α-Kdo类似物,为进一步开发CMP-Kdo合成酶的抑制剂打下了良好的基础。
熊伦[4]2016年在《特拉万星的制备工艺研究及其类似物的合成与抗菌活性筛选》文中进行了进一步梳理本论文由两部分组成：第一部分,特拉万星制备工艺研究。特拉万星是Theravance公司研制的,2009年FDA批准的第一个半合成糖肽抗生素,用于治疗革兰氏阳性菌导致的成人复杂皮肤感染和皮肤结构感染(cSSSI)。特拉万星结构特征在于万古糖胺氨基部分接上疏水性的癸基氨基乙基侧链,在7位氨基酸芳环的对位引入亲水性的膦酸氨甲基。从低成本、易操作、低污染、高产率等方面考虑,本论文选择癸醇为起始原料,经甲磺酰化、乙醇胺亲核取代、Fmoc保护和Parikh-Doering氧化得到关键的中间体N-(9-芴基-9-甲氧羰基)癸基氨基乙醛(5)。盐酸万古霉素与5通过还原胺化反应、脱Fmoc保护、曼尼希反应制备得到特拉万星。针对中间体N-(9-芴基甲氧羰基)-N-正癸基氨基乙醛的合成,本论文优化了投料比和后处理溶剂,取得较好的收率。重点针对还原胺化和曼尼希反应条件和工艺参数进行了综合考察,通过分步还原胺化控制了副反应,优化了曼尼希反应温度和投料比,提高了反应的效率。以万古霉素为原料计算,该合成路线的总收率为46%。第二部分,特拉万星类似物的合成与抗菌活性筛选。糖肽抗生素被专家认为是“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”和“王牌抗生素”。但是伴随着万古霉素的广泛使用,逐渐出现万古霉素耐药的革兰氏阳性菌,特别是万古霉素耐药的肠球菌和金黄色葡萄球菌,使人类的生命健康又受到严重的威胁。因此开发新型糖肽抗生素势在必行,对天然糖肽结构修饰,可以进一步提高其抗菌活性。本论文选择以万古霉素为母核,在糖胺部位引入疏水侧链、七肽骨架C端氨基化修饰以及7位芳环对位引入糖基,设计合成了32个特拉万星类似物(Van001-Van032),并进一步选取金黄色葡萄球菌(Newman strain和Mu50 strain)和粪肠球菌(VanA和VanB)对其进行体外抗菌活性测试。结果表明：有5个化合物(Van011、Van013、Van017、 Van024、Van025)对Newman具有显着的抑制活性(MIC≤0.0625μg/mL);有3个化合物(Van015、Van017、Van025)对Mu50具有显着抑制活性(MIC≤0.125 μg/mL);有4个化合物(Van011、Van013、Van017、Van025)对VanB粪肠球菌具有良好的抗菌活性(MIC≤0.125μg/mL),明显优于上市药物万古霉素和特拉万星。本论文进一步总结归纳了特拉万星类似物的构效关系,同时正在进一步完善药理评价,希望能筛选出更理想的药物候选分子。本论文研究工作为开展新型糖肽抗生素药物研发提供结构基础和设计思路。
乔现婷[5]2011年在《林可霉素高产菌株的选育及代谢过程的调控》文中提出本课题通过比较几种诱变方法的优缺点,选出一种最优的诱变方法——0.5%EMS处理2h+UV照射30s,在分析已有林可链霉菌的代谢途径的基础上,发现丙基脯氨酸和谷氨酰胺是林可霉素合成途径中的关键物质,通过查阅文献找到这两种物质的结构类似物,以该两种结构类似物作为复合诱变后的筛选物质。实验中以林可链霉菌07-5为出发菌株,经过叁次EMS+UV复合诱变,依次以丙基脯氨酸和谷氨酰胺的结构类似物为筛选物质,定向筛选出具有该两种物质抗性的突变株P2-A6-P10-10,其产量较出发菌株提高了45%。在突变株和出发菌株的发酵过程中,分别在发酵开始时和144h时添加0.06%和0.005%的丙基脯氨酸的结构类似物,产量分别提高了13.7%和13.8%；分别在144h时和发酵开始时添加0.04%的谷氨酰胺,产量分别提高了14.1%和17.3%。突变株经叁周保藏和传代实验,菌株高产且稳定。在林可链霉菌发酵产林可霉素的过程中,在不同时间点添加一定量的丙氨酸和叁甲胺可以发现,林可霉素的产量提高了25%,通过测定林可霉素合成过程中的一些关键酶的酶活及关键代谢产物的含量,发现,在发酵开始时添加0.01%的丙氨酸,可抑制糖酵解途径中的丙酮酸激酶的酶活,从而使菌体中积累高浓度的磷酸烯醇式丙酮酸,而在发酵24h时添加0.02%的叁甲胺,可以抑制莽草酸途径中邻氨基苯甲酸合成酶的酶活,从而使菌体内积累高浓度的酪氨酸,进而提高林可霉素的产量。将经诱变筛选得到的突变株P2-A6-P10-10和出发菌株07-5在50L罐上进行发酵,通过工艺上的改进,实现了其产量较出发菌株26.7%的提高。通过测定发酵过程中的各个指标,发现突变株较出发菌株的生长代谢和合成代谢要更加旺盛。
王萌萌[6]2016年在《仿生材料的制备及其与蛋白质及细胞的相互作用》文中研究表明仿生材料学,是指从分子水平上研究天然物质的结构特点和构效关系,进而开发出类似或优于原天然物质功能的新型材料。仿生的策略广泛应用于生物材料领域,通过模拟生命体中各种生物物质(如蛋白质和细胞等)的分子结构,促进相关的生物反应,将有利于材料与生命体的融合及材料生物功能的实现。生物物质之间的相互作用大致可分为活性结合与惰性排斥两种,前者是实现生命体内各种生理活动的途径,后者是保证各种生物活性激活的特异性和准确性的前提。因此,生物材料的仿生策略也应包含惰性和活性两个方面,即,在惰性背景之上特异性激活目标生物学过程,这样才能保证其功能的有效性。而仿生的核心环节则是模拟生物物质的功能性分子结构,进而实现类似的生物相互作用。细胞是生物体基本的结构和功能单元,其功能的实现依赖于细胞膜特殊的分子构成。细胞膜的磷脂结构提供了细胞内外环境之间的惰性屏障,而磷脂双分子层中结合的膜蛋白和膜糖等分子则介导了细胞与周围环境之间的信息、物质和能量的交换。本论文从仿生的角度出发,通过分子设计,分别模拟细胞膜中对细胞分化起关键作用的糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)成分以及作为惰性屏障的磷脂分子结构,探索了这些仿生分子在诱导干细胞向神经方向分化以及抗蛋白吸附方面的功能性。具体包含以下两部分内容：1.仿细胞膜糖结构的GAG类似物的合成及其对干细胞向神经方向分化行为的影响。GAG是细胞膜表面主要的糖结构,能够结合细胞质基质中多种蛋白质,是细胞信息传递过程中的主要媒介,特别在调控干细胞行为方面有显着影响。然而,GAG分子结构的多样性与不可控制性限制了其在生物工程方面的广泛应用。通过分子设计,模拟关键的GAG功能性分子结构,制备结构精确可控的GAG类似物,则可以取代天然GAG,实现相应的生物学功能。GAG的功能性分子结构主要包含硫酸酯基团和糖环结构,因此本论文分别采用小分子合成及共聚的方式实现了这两种结构的有机结合,获得了GAG类似物。首先,对糖类分子p-环糊精(β-cyclodextrin, β-CD)进行磺化改性,制备GAG类似物。分别通过硫-溴点击反应与铜催化迭氮-端炔环加成反应在β-CD上修饰了磺酸基团,得到分子结构有所差异的磺化β-CD:β-CD-(S-SO3Na)7与β-CD-(N3-SO3Na)7。细胞实验结果表明,这两种GAG类似物加入细胞培养液中均可促进L929细胞及胚胎干细胞生长,与天然GAG肝素相比,细胞数量没有明显差别,说明具有良好的细胞相容性。在诱导干细胞向神经方向分化的过程中,β-CD-(S-SO3Na)7与β-CD-(N3-SO3Na)7表现出较肝素更高的促分化效率。培养14天时,β-CD-(S-SO3Na)7与β-CD-(N3-SO3Na)7促进干细胞向神经分化的效率分别为肝素的1.2倍与1.9倍,而未磺化的β-CD其效率仅为肝素的0.6倍,与空白对照组相比无显着差异。因此,通过对糖类分子p-CD的磺化改性,可模拟天然GAG分子在促干细胞分化方面的生物学功能。在此基础上,为了进一步模拟GAG的长链结构,并调节功能性组分的相对含量,提出了制备GAG类似物的新概念,即,将GAG分子中“磺酸基团”与“糖基团”单元进行拆分和重组。首先,分别合成含有“磺酸基团”与“糖基团”的单体,利用可逆加成-断裂链转移聚合(Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization, RAFT)共聚合和方式将两种功能性单元进行组合。通过改变投料比,可以精确调控共聚物中“磺酸基团”与“糖基团”的相对含量。细胞实验结果表明,该GAG类似物具有良好的细胞相容性,加入干细胞培养液中能够促进干细胞增殖。在诱导干细胞向神经方向分化的过程中,GAG类似物的存在能够提高分化效率,提高的程度与共聚物的组分相关。当磺酸基团与糖基团比例接近1：1时,共聚物促干细胞向神经分化的效率最高,是肝素的3.1倍。因此,这种类GAG共聚物可以通过精确调控功能单元的组成,实现更优于天然GAG的生物学功能。2.仿细胞膜磷脂结构的两性离子聚合物表面的制备及其抗蛋白吸附性能研究。磷脂双分子层外壁的两性离子结构是赋予细胞膜惰性屏障功能的关键,因此利用两性离子分子修饰的材料表面具有良好的抗污性能,而发展简单普适的修饰方法则是使两性离子表面得以广泛应用的关键环节。本文将末端带有黏性分子3,4-二羟基苯基-L-丙氨酸(3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine, DOPA)的两性离子聚合物修饰在材料表面,研究了其抗蛋白质吸附的功能。利用修饰了DOPA的原子转移自由基聚合物(AtomTransfer Radical Polymerization, ATRP)引发剂分别引发单体磺酸基甜菜碱(sulfobetaine, SB)和羧酸基甜菜碱(carboxybetaine, CB)的聚合,制备了具有不同分子量的聚磺酸甜菜碱聚合物(poly (sulfobetaine), pSB)与聚羧酸甜菜碱聚合物(poly (carboxybetaine), pCB),并将其修饰在聚二甲基硅氧烷弹性体(polydimethylsiloxane, PDMS)表面。蛋白质吸附结果表明,聚合物分子量在一定范围内的增加有利于提高相应聚合物改性表面的抗蛋白质吸附能力；增加聚合物末端的DOPA数量有利于获得更为致密的聚合物修饰层,从而进一步提高了改性表面的抗蛋白质吸附能力。此外,在聚合物接枝过程中加入多巴胺小分子,也有利于提高聚合物层的致密性,从而进一步降低蛋白质吸附量。本论文从仿生细胞膜的角度出发分别获得了具有生物活性的GAG类似物及具有生物惰性的两性离子分子修饰的材料表面。未来的努力方向应是在材料界面将两者有机结合,抑制非特异性反应的同时促进目标生物活性,实现更全面的仿生功能。
丁开国[7]2015年在《定位磺化壳聚糖生物活性的研究》文中研究指明肝素/硫酸乙酰肝素是糖胺聚糖家族中的一类重要的多糖,具有多种重要的生物学功能。肝素/硫酸乙酰肝素能特异性结合多种细胞外基质蛋白和信号分子,并且能调节广泛的生理功能。磺化壳聚糖作为一种肝素类似物,具有与肝素/硫酸乙酰肝素十分相似的分子结构,其分子中所具有的磺酸基团及其结构能够同肝素中的磺化结构一样实现对蛋白质结合活性的调控,从而具备类似肝素的生物功能,包括抗凝血、抗病毒、抗肿瘤、抗菌、调节细胞分化等。与肝素相比,磺化壳聚糖具有活性单一,结构可控的优点,因此其具有极好的应用前景。研究磺化壳聚糖的生物功能具有极其重要的意义。本课题制备了多种不同磺化位点修饰的壳聚糖,考察磺化壳聚糖的磺化位点及结构对细胞增殖、分化行为的影响。另外,将磺化壳聚糖负载于壳聚糖膜片表面,制备了具有强抗菌且促细胞增殖的多功能生物材料,具体内容如下:1.通过化学手段对壳聚糖加以磺化改性,获得了多种不同磺化位点的定位磺化壳聚糖,并将磺化壳聚糖添加到培养基中对细胞进行培养。结果表明,磺化壳聚糖对普通细胞及胚胎干细胞均有一定的促增殖活性。2.磺化壳聚糖能影响干细胞的分化行为,我们将不同的定位磺化壳聚糖添加到培养基中对小鼠胚胎干细胞进行培养,结果发现,几种磺化壳聚糖均能促进干细胞向神经方向分化,其中6-O-磺化壳聚糖促进效果最为显着,且磺化程度的提高有利于神经方向的分化,表明磺化壳聚糖诱导干细胞神经分化受到磺化位点及磺化程度的共同影响。3.通过正负离子的结合效应,结合戊二醛的辅助交联作用将6-O-磺化壳聚糖负载于壳聚糖膜片的表面,该表面具有良好的生物相容性,在促进细胞的生长与增殖的同时还具有较强的抗菌效果。我们的研究表明,定位磺化壳聚糖具有促进细胞增殖、干细胞定向分化以及抗菌等多种生物活性,通过磺化壳聚糖改性的生物材料具有良好的促细胞增殖及抗菌效果,为今后制备多功能组织诱导型材料建立了很好的研究基础。
赵雪尔[8]2014年在《一锅酶法合成globotriose及其类似物》文中指出糖复合物广泛分布于自然界中,是生物体必不可少的成分,参与重要的生物学过程,如信号转导,细胞识别,受精和发育等。在非正常生理状况下,糖缀合物与机体的病理过程有着密切关系。此外,在疾病的治疗和药物开发中,糖复合物被广泛应用,例如临床上肿瘤的诊断,肿瘤疫苗的开发等。80%的糖复合物是以糖脂的形式存在。其中,鞘糖脂是最主要的存在形式。现在我们已知,脊椎动物中几乎所有的糖脂都是鞘糖脂。Gb3(Globotriaosylceramide)属于中性糖鞘脂,结构式为a-Gal(1→4)β-Gal(1→4)β-Glc(1→O-ceramide)o Globotriose (Gala l-4Ga1β1-4Glc)叁糖是globotrio-神经酰胺的碳水化合物部分,参与许多重要的生理学过程。Globotriose叁糖不仅应用于结肠癌的治疗,最新研究表明,globotriose与人体感染HIV/AIDS密切相关。除此之外,许多人类病原菌触发疾病是通过连接它们的微生物黏附蛋白到宿主细胞粘膜表面糖复合物的糖链上。例如,产志贺毒素大肠杆菌(STEC)产生的志贺氏毒素(Stx)与宿主肠细胞表面的寡糖链globotriose (Galα1-4Galβ1-4Glc)结合,然后Stx通过转位跨过肠屏障而进入宿主的循环系统,从而引起痢疾,甚至是危及生命的溶血性尿毒综合征(HUS)。本论文共有两个章节。第一章为绪论部分；第二章为实验部分,主要阐述了globotriose及其类似物的合成。由于globotriose在病理学过程和药物开发策略中的重要应用价值,本论文第二章主要进行了一锅多酶法大量合成globotriose的研究。首先,底物半乳糖和ATP在半乳糖激酶SpGalK的催化下合成了半乳糖-1-磷酸(Gal-1-P).其次,生成的Gal-1-P和UTP反应,在UDP-葡萄糖焦磷酸化酶SpGalU的催化下产生UDP-Gal。UDP-Gal是合成globotriose的直接供体,乳糖是合成globotriose的受体。最后,UDP-Gal和乳糖在α-1,4-半乳糖基转移酶LgtC的催化下合成目标产物globotriose。反应后的混合物经过活性炭色谱和P2分子筛柱纯化,得到globotriose纯品。利用质谱(LCMS-IT-TOF)和核磁共振谱(1HNMR和13C NMR,400MHz,D2O)对合成的产物进行分子量检测和结构鉴定。此外,本实验利用的酶SpGalU和LgtC具有混杂的底物适应性,为大量快速的生产globotriose类似物提供了可能。利用此多酶一锅体系,以二脱氧半乳糖、四脱氧半乳糖、六脱氧半乳糖替代半乳糖作为初始底物,其余反应条件不变,最终获得了叁种globotriose的类似物。这种多酶一锅体系在低成本、大规模制备药用价值的globotriose及其类似物中具有重要的应用前景。
许卫超[9]2005年在《新型C10高碳糖核苷类化合物及其胺基衍生物的合成研究》文中研究指明本论文以α-D-木糖和含烯醇醚结构的C10高碳糖为原料合成了一系列新型的木糖核苷、高碳糖核苷及高碳糖胺基衍生物,并对所合成的化合物进行了活性测试,部分化合物具有较好的生物活性。 在广泛分析研究文献的基础上,我们主要开展以下几个方面的研究: 一、以α-D-木糖为起始原料合成了C10高碳糖,五乙酰基C10高碳糖,四乙酰基木糖及四苯甲酰基木糖。其具体反应步骤如下: 二、以四乙酰基木糖和四苯甲酰基木糖和五乙酰基C10高碳糖为原料,利用Vorbrüggen法合成了结构新颖的木糖和高碳糖核苷类似物,其中两个具有双碱基。经红外、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱确证了它们的结构。
李伟[10]2010年在《功能性低聚糖的酶法合成及其生理功能评价》文中进行了进一步梳理功能性低聚糖属于益生元的一类,是有别于普通低聚糖的一类功能因子,其包含多种类型的物质,新型功能性低聚糖的开发是国际益生元界的热点问题,酶工程技术的发展为解决这一问题提供了契机。同时由于功能性低聚糖本身结构的特殊性以及分离纯化较为困难,在过去的研究中通常采用商品化的产品,或者将其仅进行简单分离就作为底物进行益生功能评价,因而并不能从本质上说明是混合物中的哪一种确定结构的低聚糖在厌氧发酵过程中发挥了积极作用,也不能确定低聚糖结构对于其益生功能以及抑癌活性的影响。在前人的研究中已经发现功能性低聚糖的化学结构(包括单糖残基的类型和组成、糖苷键的构型和连接方式)对于益生功能以及抑癌活性都有重大的影响作用,特别是低聚糖在肠道内的选择特性和发酵特性,因此从理论上阐明功能性低聚糖的精细结构与其生理功能间的关系具有重大意义。本文分为五个部分,分别重点对不同来源的p-D-半乳糖苷酶合成新型功能性低聚糖、各种单一组分低聚糖的分离纯化以及结构鉴定、酶法合成的条件优化、不同结构低聚糖纯品体外肠道益生功能比较、不同结构低聚糖纯品体外抑制人胃癌细胞株BGC-823作用进行了研究。主要研究结果如下：1.酶法合成功能性低聚糖及其分离纯化、结构鉴定本研究选用来源于Bacillus circulans、Penicillum multicolor和Aspergillus oryzae中的β-D-半乳糖苷酶作为催化剂,分别以乳糖、乳糖和蔗糖、乳糖和N-乙酰葡萄糖胺为底物进行酶法合成,并且使用HPLC监测整个反应进程,探究不同来源的酶在不同底物存在条件下产物的种类。通过高压、中压、常压色谱结合活性炭-硅藻土吸附层析和凝胶排阻吸附层析等分离手段对酶法合成的产物进行分离纯化,得到9种低聚糖纯品,将纯化所得的各物质纯品通过UV. ESI-TOF-MS、1H-NMR、I3C-NMR等分析手段进行结构表征,同时还对一种商品化的低聚果糖QHT-90S混合物进行了HPLC分析并进行了结构表征。发现来源于B. circulans中的β-D-半乳糖苷催化的反应生成的产物主要以β-(1→4)糖苷键形式存在,另外还有少量以p-(1→3)和β-(1→6)糖苷键形式存在,产物的聚合度为2至4。酶法合成后纯化得到其中的叁种物质：β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→2)-β-D-Fruf、β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-D-GlcpNAc和β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc前人未见报道,为合成后首次命名。来源于P. multicolor和A. oryzae中的p-D-半乳糖苷催化的反应结果相似,前者的催化效力和专一性要强于后者,产物主要以β-(1→6)糖苷键形式存在,另外还有少量以β-(1→4)糖苷键形式存在,产物的聚合度最高为3至4。2.酶法合成功能性低聚糖的条件优化本文对反应温度、底物浓度、供受体比以及酶浓度等反应条件进行研究,确定了合成各种GOS、乳果糖及其类似物、N-乙酰乳糖胺及其衍生物纯品的最优条件。研究表明反应温度、底物浓度以及供受体比的变化对于产物的合成影响较大,为主要的影响条件,而酶浓度对于各产物最高产量的影响不显着,为次要影响条件。经过对反应优化,确定了各物质合成的最佳条件如下：(1) 4'-GOS3:40℃, pH 6.0,60%的乳糖浓度,1.0 U/mL的酶浓度(来源于B. circulans的β-D-半乳糖苷酶)反应6 h;(2) 4'-GOS4:40℃, pH 6.0,60%的乳糖浓度,1.0 U/mL的酶浓度(来源于B. circulans的β-D-半乳糖苷酶)反应8 h；(3)6'-GOS3:50℃,pH 5.0,70%的乳糖浓度,0.3 U/mL的酶浓度(来源于P. multicolor的β-D-半乳糖苷酶)反应6 h; (4)6'-GOS4: 50℃,pH 5.0,70%的乳糖浓度,0.3 U/mL的酶浓度(来源于P. multicolor的p-D-半乳糖苷酶)反应8 h;(5)乳果糖和4'-galactosyl-lactosucrose:40℃, pH 6.0,60%的总糖浓度(30%乳糖和30%蔗糖),1.0 U/mL的酶浓度(来源于B. circulans的p-D-半乳糖苷酶)反应6 h; (6)异乳果糖：50℃,pH 6.0,60%的总糖浓度(30%乳糖和30%蔗糖),1.0 U/mL的酶浓度(来源于B. circulans的β-D-半乳糖苷酶)反应12 h; (7)N-乙酰乳糖胺、4'-galactosyl-LacN Ac以及4'-digalactosyl-LacN Ac:40℃,pH 6.0,1.0 M的总糖浓度(0.5 M乳糖和0.5 MN-乙酰葡萄糖胺),1.0U/mL的酶浓度(来源于B. circulans的p-D-半乳糖苷酶)分别反应4、5、6 h;(8)N-乙酰异乳糖胺：60℃,pH 6.0,1.0 M的总糖浓度(0.5 M乳糖和0.5 MN-乙酰葡萄糖胺),1.0 U/mL的酶浓度(来源于B. circulans的p-D-半乳糖苷酶)反应12h。3.不同结构功能性低聚糖纯品体外肠道益生功能研究本文利用体外厌氧粪样混合培养的方法对酶法合成得到的不同键合形式、不同聚合度的系列GOS、FOS.乳果糖及其类似物纯品进行研究,利用FISH技术比较总菌群数、有益菌以及有害菌的数量,并用PI评价受试底物的益生功能；通过发酵过程中各种SCFA种类和含量的变化,确定了菌群代谢对产生SCFA的影响,在一定程度上阐明了其结构与益生功能之间的关系。(Galactosyl)n-glucose (n=1-3)结构的GOS相比较glucose-(fructosyl)n(n=1-3)结构的FOS,PI值更高。GOS系列低聚糖对Bifidobacterium spp.具有很强的选择性,相应在发酵过程中有大量乙酸和乳酸生成,在GOS中,以β-(1→6)糖苷键相连的GOS (6'-GOS3)比β-(1→4)糖苷键相连的GOS产生了更高的PI;而FOS系列低聚糖却对Lactobacillus/Enterococcus spp.具有较强的选择性。GOS系列低聚糖的丁酸产生量都比FOS系列低聚糖高。聚合度也会对PI造成影响,聚合度≤3的低聚糖通常12 h时PI就能达到最大值,而聚合度>3的低聚糖通常要24 h才能达到最大值,聚合度越高,益生功能越持久。除两种普通低聚糖(乳糖和蔗糖)在24 h会引起Bacteroides-Prevotella group和Clostridium histolyticum group (clustersⅠandⅡ)数量明显增加外,其余低聚糖与对照组相比对两种菌属均无增殖作用。以β-(1→4)糖苷键相连的叁糖,即结构为(galactosyl)2-glucose的4'-GOS3与结构为galactosyl-glucosyl-fructose的乳果糖相比,会产生更高的PI值,而且在整个反应时间内,Bifidobacterium spp.和Lactobacillus/Enterococcus spp.在总菌群中所占的比例均在不断提高,若(galactosyl)2-glucose结构中半乳糖残基间的连接变成β-(1→3)糖苷键形式(异乳果糖),对PI影响较大。在整个反应时间内,异乳果糖的PI均高于4'-GOS3,同时异乳果糖在24 h时总酸量最高。以α-糖苷键相连的棉籽糖在24 h还会引起Clostridium histolyticum group (clustersⅠandⅡ)数量的增加,这不利于PI的提高,而其得到的总酸量也是所有低聚糖中最少的。4.不同结构功能性低聚糖纯品体外抑制人胃癌细胞株BGC-823作用研究本文研究了不同键合形式、不同聚合度的的GOS、FOS、乳果糖及其类似物纯品对人胃癌细胞株BGC-823细胞的体外增殖的影响,通过比较不同作用时间以及不同作用浓度下各种功能性低聚糖纯品对于胃癌细胞的抑瘤率,初步探讨不同结构功能性低聚糖纯品对胃癌细胞的作用效果,在一定程度上阐明了低聚糖结构对于癌细胞生物活性的影响。结果表明除棉籽糖外,其它低聚糖的抑瘤率与其浓度间均存在剂量依赖关系,在相同时间条件下,随浓度的升高,抑瘤率逐渐增强；在相同的浓度下,随时间的延长,抑瘤率也相应提高。比较低浓度(10 mg/mL)下各低聚糖的抑瘤率可知以β-(1→3)糖苷键相连的异乳果糖对癌细胞的抑制率要高于以β-(1→4)糖苷键相连的乳果糖和GOS (4'-GOS3和4'-GOS4)；以p-(1→2)糖苷键相连的FOS系列低聚糖也取得了较高的抑瘤率,但两种以β-(1→6)糖苷键相连的GOS(6'-GOS3和6'-GOS4)在整个反应过程中抑瘤率一直较低；同种类型低聚糖其叁糖和四糖之间抑瘤率差异不显着。
参考文献：
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