江西中医药大学附属医院 南昌 330006
【摘 要】目的：探讨减味寿胎丸对复发性自然流产（RSA）小鼠蜕膜中Annexin A2和DCs的影响。方法：建立CBA/J xDBA/2孕鼠反复自然流产和CBA/JxBALB/c孕鼠正常妊娠模型，按妊娠顺序随机分为RSA模型组、减味寿胎丸高、中、低组，分别灌胃2周后比较蜕膜组织Annexin A2及CD83+、CD1a表达水平。结果：正常组、减味寿胎丸高、中、低组蜕膜组织Annexin A2及CD83+、CD1a表达水平较模型组明显变化，减味寿胎丸高组Annexin A2表达水平明显高于减味寿胎丸中、低组，CD83+、CD1a水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：减味寿胎丸可改善复发性自然流产（RSA）小鼠蜕膜组织高凝状态，调节免疫。
【关键词】减味寿胎丸；复发性自然流产；膜联蛋白A2；树突状细胞
复发性自然流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指连续2次以上的不足20周胎龄的自然流产[1]。既往研究表明，RSA发生率约1%，其在给孕妇造成心理创伤的同时甚至导致不孕，感染、内分泌失调、染色体异常等因素均可引发RSA[2]。膜联蛋白A2（Annexin A2）是一组钙离子依赖的磷脂结合蛋白，对维持血管内血液通畅，预防血栓具有重要作用。树突状细胞（DCs）是体内功能最强的抗原提呈细胞，为维持母胎界面免疫功能中具有重要作用。本研究分析减味寿胎丸对RSA小鼠蜕膜中Annexin A2和DCs的影响，以初步探讨减味寿胎丸的作用机制。
1 材料
1.1 实验动物
健康雌性CBA/J小鼠，SPF级，10周龄，50只；健康雄性DBA/2小鼠，SPF级，10周龄，20只；健康雄性BALB/C小鼠，SPF级，10周龄，5只。均由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：No.44005900000741。
1.2 实验药物
减味寿胎丸复方由菟丝子400g、桑寄生300g、续断300g组成，分别将其制备成复方醇提物和复方水提物，将两者合并既得减味寿胎丸复方总提物样品。
1.3实验仪器
BMJ-1生物组织包埋机（天津航空机电公司），Shandon325型石蜡切片机（英国Shandon公司），KPY-1烤片机（天津航空机电公司），Motic B5显微摄像系统（麦克奥迪实业集团公司），Image pro plus 6.0医学图像分析系统；DAB显色剂：武汉博士德生物工程有限公司；小鼠可溶性CD1a、CD83试剂盒、SABC试剂盒和膜联蛋白A2免疫组化试剂盒均购于美国Proteintech公司。
2 方法
2.1造模方法
将50只雌性CBA/J小鼠分别与20只雄性DBA/2小鼠和5只BALB/c小鼠合笼交配，检出阴栓者计为妊娠第1天，分别建立反复自然流产模型40只与正常妊娠模型10只。
2.2分组及给药方法
按妊娠顺序随机分为RSA模型组、减味寿胎丸高、中、低组，自妊娠第1d灌胃，体积2ml/100g，减味寿胎丸高、中、低组剂量为12g、6、3g生药/kg，模型组及正常组予以相同体积蒸馏水，连续灌胃2周。
2.3 标本制备
孕2周断颈处死小鼠，离体妊娠子宫后自子宫角处钝性撕开子宫壁，于着床部位剥离胎儿胎盘单位，剪刀分离着床部位蜕膜组织，取5个着床部位，以预冷的PBS充分冲洗后放置于液氮中保存。
2.4免疫组化检测
石蜡切片厚度5µm，常规脱蜡至水，3% H20210 min，抗原修复10min，一抗4℃过夜，二抗370C30min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、二甲苯透明、树脂封片观察。每组选取6张切片观察所有阳性颗粒，计算面密度（阳性目标总面积/统计场总面积），定量表达免疫组化阳性反应程度。以 β-actin作为内参，通过计算机图象分析系统计算各值与 β-actin光密度比值，作为Annexin A2的相对表达量。
2.5统计学方法
采用SPSS19.0软件分析处理数据，计量资料以均数 标准差（ ）表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间方差分析用F检验，P＜0.05为有统计学意义。
3 结果
3.1各组小鼠蜕膜组织Annexin A2表达水平比较
正常组及减味寿胎丸高、中、低组蜕膜组织Annexin A2表达水平较模型组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；减味寿胎丸高组小鼠蜕膜组织Annexin A2表达水平明显高于减味寿胎丸中、低组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
注：与模型组比较，#P<0.05；与减味寿胎丸高组比较，*P<0.05。
3.2各组小鼠蜕膜组织CD83+、CD1a水平比较
模型组小鼠蜕膜组织CD83+、CD1a水平明显高于正常组和减味寿胎丸高、中、低组，差异有统计学意义（P<0.05）；减味寿胎丸高组小鼠蜕膜组织CD83+、CD1a水平明显低于减味寿胎丸中、低组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
4 讨论
作为钙离子依赖的磷脂结合蛋白Annexins家族的重要成员之一，膜联蛋白A2（Annexin A2）通过与多种蛋白和非蛋白类物质相互作用在离子通道活化、细胞内信号传导、维持上皮细胞正常形态等方面发挥重要作用[3]。Annexin A2是一个促纤溶的内皮细胞表面受体，可与组织型纤溶酶原激活物（tPA）和纤溶酶原结合，进而促进纤溶酶生成，防止血栓形成[4]。既往研究表明，静脉注射重组Annexin A2于栓塞性脑卒中大鼠体内可明显抑制体内血栓形成[4]。树突状细胞（Dendritic cells，DCs）属于一种抗原提呈细胞，可在母胎界面的免疫耐受中发挥调控作用。研究表明，RSA患者与正常孕妇体母胎界面局部DCs数量、形态及功能存在差异。CD83和CD1a是DCs的主要特异性标志物，可反映DCs的生长状况。本研究得到正常组及减味寿胎丸高、中、低组蜕膜组织Annexin A2表达水平较模型组明显升高（P<0.05），表明蜕膜组织抗凝蛋白Annexin A2表达降低可能是导致RSA小鼠高凝状态，进而引发妊娠失败的原因之一；减味寿胎丸高组Annexin A2表达水平明显高于减味寿胎丸中、低组（P<0.05），提示减味寿胎丸可通过提高蜕膜组织Annexin A2表达改善高凝状态，防止血流受阻和血栓形成，进而为妊娠提供充足的血供；减味寿胎丸高组小鼠蜕膜组织CD83+、CD1a水平明显低于减味寿胎丸中、低组，表明减味寿胎丸可以通过降低CD83+表达，提高CDla+表达调节免疫。综上所述，减味寿胎丸的可能机制之一为改善子宫蜕膜组织高凝状态，确保血运通畅，调节免疫，维持正常妊娠。
参考文献：
[1]谢玲，王玉.寿胎丸加味治疗先兆流产和习惯性流产43 例[J].江西中医药，2011，42（342）：51-54.
[2]何晓萍，陈勤芳.复发性自然流产的病因学研究进展[J］．生殖与避孕，2013，33（10）：701-706.
[3]李慧芳，雷磊，谭展望，等.寿胎丸对RSA模型小鼠子宫蜕膜Annexin A2及TTR表达影响的研究[J]，中华中医药学刊，2013，31（11）：2369-2372.
[4]雷磊，李慧芳，谭展望，等.寿胎丸对反复自然流产模型小鼠子宫蜕膜蛋白表达的影响[J]，中国中医药信息杂志，2013，20（7）：42-45.
基金项目：江西省卫生厅中医药科研基金课题，编号：2013A059
论文作者:方家,刁军成,李林
论文发表刊物:《航空军医》2015年18期
论文发表时间:2016/4/15
标签：小鼠论文; 组织论文; 模型论文; 水平论文; 蛋白论文; 统计学论文; 自然论文; 《航空军医》2015年18期论文;