袁源
（南昌市第三医院 江西南昌 330006）
【关键词】成纤维细胞的分离、培养；组织块培养法；酶消化法；体外培养成纤维细胞
【中图分类号】R329 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）11-0105-02
随着当今科技发展，细胞研究成为热点，因此合适细胞培养方法成为实验的基础。本实验主要在组织块培养法上进行改进，为寻找比较合适的人增生性瘢痕成纤维细胞的分离、培养的方法提供依据，提高实验效率。
1.实验方法
标本取自我院骨科患者(伤后5月)，采用组织块和组织块消化培养法，体外培养成纤维细胞第4～8代后，各分为4组。
2.人增生性瘢痕成纤维细胞的分离、培养
标本由本院骨科医生术中切取（经患者及家属知情同意，证实术前未进行任何药物治疗，5岁小儿伤后5月瘢痕，红色，稍高出周边皮肤）。切取瘢痕置于生理盐水培养皿中，送入实验室，给予酒精浸泡5秒，送入无菌台，放入含有青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL)的Hank,s液中漂洗。首先用眼科剪剪除瘢痕的表皮及皮下脂肪，再将真皮层剪成1mm?左右的块状物,使用组织块法接种4瓶：将小块种植于25cm?培养瓶瓶底，保持间距1cm，翻转瓶底朝上，使用10ml注射器抽取含10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100U/ml)的DMEM培养液，注入培养瓶中，4mL左右，将培养瓶置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中，瓶盖扭松1/4圈。静置4小时，组织块贴牢瓶底后，缓慢翻转培养瓶，使培养液浸过所有组织块，继续培养。剩余组织块采用改进组织块法，浸入0.25%胰蛋白酶和0.02%依地酸溶液，水平面高出组织约2cm，室温保持30分钟后，送入4℃冰箱消化过夜。次日清晨，取出培养瓶，酒精消毒后送入无菌台，取出组织，以10%胎牛血清终止消化。使用吹打管将小块种植于25cm?培养瓶瓶底，保持间距1cm，翻转瓶底朝上。使用10ml注射器抽取含10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100U/ml)的DMEM培养液，注入培养瓶中，4mL左右，将培养瓶置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中，瓶盖扭松1/4圈。静置4小时，组织块贴牢瓶底后，缓慢翻转培养瓶，使培养液浸过所有组织块，继续培养。每隔5天换液，待细胞游离、扩增至基本融合成片达瓶底80%后，进行消化传代。10ml注射器吸去瓶中培养液，D-Hanks液漂洗3次后，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%依地酸溶液，消化1～3min，肉眼可见瓶底斑片脱落、漂浮、溶解，立即送入显微镜下观察：细胞明显失去两极，回缩、变成圆球形，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用弯头吸管反复吹打瓶壁细胞，吹打时动作轻柔，顺序从瓶底一侧吹响另一侧。将消化下的细胞置入离心管离心，去上清，加入培养液6ml左右，按1：3比例接种于新的培养瓶中，并补加含10%胎牛血清的DMEM培养液，混匀，于温箱中继续培养。3天左右，当细胞再次长满时，继续按1：3传代。（实验采用第4～8代细胞进行）
3.两种不同分离方法人增生性瘢痕成纤维细胞的生长
组织块改进法培养细胞第3天，在倒置相差显微镜下观察可见组织块周边有游走的贴壁细胞，呈梭行或多角形，核卵圆，散在分布于瓶底，排列稀疏。第12天组织块周边可见大量呈梭行的瘢痕成纤维细胞鱼群样生长，鱼群周边可见大量的散在成纤维细胞，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2～3个的突起，长短不一，细胞间排列明显紧密，较少的细胞间隙。第18天细胞明显增多，细胞缝隙明显减少，分布培养瓶底80%面积，细胞相互平行排列，呈旋涡状或鱼群状，部分拥挤处细胞呈针尖样。组织块法第8天可见组织块周边有游走的贴壁细胞。第20天，25天分别见到上述现象，进行细胞传代，传代后细胞生长迅速，分布瓶底80%时再进行传代，约5天左右传代1次。见图1.2.1～1.2.8。
4.结论
组织块改进法获得细胞时间明显缩短，较组织块法提前5天爬出成纤维细胞，提前一周长满瓶底。
5.讨论
自Conway[1]体外培养成纤维细胞成功以来，细胞研究逐渐成为热点。因此如何有效体外培养细胞十分关键。目前主要的培养方法根据是否使用消化酶分为两大类：一类是组织块培养法，另一类酶消化法。目前大部分的科研工作者采用组织块培养法。黄勇[2]等人在组织块接种6天后可见细胞爬出，郭冉[3]组织块法接种10天左右可见细胞爬出，加入多聚赖氨酸后1周可见游离的细胞，李永林[4]等人经实验证实酶消化法明显较组织块法更快培养出成纤维细胞等人。林尊文[5]等人证实酶消化法培养细胞存度高、培养周期短。本实验分别采用组织块法和改进组织块培养法，同一批组织块，取自小儿伤后5月增生期瘢痕，两者均培养出成纤维细胞。改进法在剪成小块的基础上使用0.25%胰蛋白酶和0.02%依地酸4℃消化，消化后组织贴壁更紧，不易漂浮，胶原纤维在消化后也更易成纤维细胞的爬出。因此改进法获得细胞时间明显缩短。
实验注意事项：（1）瘢痕组织经消毒后尽快处理；（2）年轻患者瘢痕组织更易培养；（3）实验操作避免组织块的漂浮，但酶消化法因消化液的粘性，不易漂浮；（4）培养过程中注意无菌操作，避免污染。
综上所述，目前大量的实验证实结合组块法的酶消化法更易培养出成纤维细胞。可快速高效培养成纤维细胞，对于细胞生物学的研究具有重要意义。
图1.2.1 改进组织块法第3天 图1.2.5 组织块法第8天
（倒置相差显微镜400X） （倒置相差显微镜400X）
图1.2.2 改进组织块法第7天图 1.2.6 组织块法第15天
（倒置相差显微镜400X） （倒置相差显微镜400X）
图1.2.3 改进组织块法第12天图 1.2.7 组织块法第20天
（倒置相差显微镜400X） （倒置相差显微镜400X）
图1.2.4 改进组织块法第18天图 1.2.8 组织块法第25天
（倒置相差显微镜400X） （倒置相差显微镜400X）
【参考文献】
[1]Conway H.Observation on the behavior of human Keloids[J].Plast Reconstrsurg,1959,24(2):229.
[2]黄勇，任林森，芩瑛.瘢痕成纤维细胞培养及其生物学行为的实验研究[J].Chinese J.Reparative and Reconstructive Surgery,1998,12(6):332-334.
[3]郭冉，刘洁婷，刘海峰等.组织贴壁法原代培养人皮肤瘢痕成纤维细胞[J].牡丹江医学院学报，2010,31(1):31-32.
[4]李永林，陈壁，汤朝武等.烧伤患者深Ⅱ度创面成纤维细胞的体外培养.Chin J Burns,February 2003,Vol.19,No.1:35-37.
[5]林尊文，徐少宏，游敏等.人增生性瘢痕成纤维细胞的改良培养和鉴定[J].实用医学杂志，2011,27(24):4367-4369.
论文作者:袁源
论文发表刊物:《心理医生》2015年11期供稿
论文发表时间:2016/4/28
标签：细胞论文; 组织论文; 瘢痕论文; 纤维论文; 培养液论文; 显微镜论文; 瓶底论文; 《心理医生》2015年11期供稿论文;