梁铁兵[1]2000年在《噬菌体434单链阻遏蛋白的高亲和力DNA结合序列的设计和`筛选》文中提出一．设计和筛选单链阻遏蛋白的高亲和力DNA结合序列 单链阻遏蛋白RR_(TRES)是噬菌体434阻遏蛋白的衍生物，它是噬菌体434阻遏蛋白的N端DBD（1—69位氨基酸）组成的共价二聚体。这个单链分子有两个DBD，一个是野生型噬菌体434的DBD—R，另一个是突变了的DBD—R_(TRES)，二者用重组接头以头接尾的方式连接起来。在R_(TRES)的α3—螺旋中-1、1、2、5位氨基酸与DNA识别紧密相关，它们分别为T、R、E、S。为了筛选出突变的R_(TRES)的DNA结合位点，设计了核心序列为CATACAAGAAAGNNNNNNTTTATG随机DNA库，通过RR_(TRES)与随机DNA库的体外结合和循环筛选。将筛选到的群体克隆并测序。通过与单链阻遏蛋白RR_(TRES)的亲和力测定，对每一个筛选到的序列进行特性分析。结果表明，当结合位点（上述划线部分）为TTAC或TTCC时为最适操纵区序列。它们与单链阻遏蛋白RR_(TRES)的亲和力很高，Kd值在1—10pM的范围。其中随机部分为TTTACG的操纵区与RR_(TRES)的亲和力最高，Kd值约为1pM；当结合位点为TTAC时，平均Kd值为3pM；当结合位点为TTCC时，Kd值在5—10pM之间。天然噬菌体434阻遏蛋白与其操纵区的亲和力的Kd值在nM数量级，与之相比，所筛选操纵区的亲和力明显提高。此外，亲和力大小还受到结合位点两侧的碱基的影响，特别是5'位碱基的影响。 表达纯化同源双突变的单链阻遏蛋白R_(TRES)R_(TRE)，根据R_(TRES)的以上识别特点，设计了一系列新的操纵区序列，它们的共有序列为GTAAGAAARNTTACN，或GGAAGAAARNTTCCN，并测定它们与R_(TRES)R_(TRE)之间的结合特异性。结果表明，它们可被RusRTR田特异识别，且亲和力也很高，Kd值在 5—40pM之间。其中 GLhGAAA…G与 RTRmRTRm之间结合的Kd值约为spM。同样，表达了异源双突变的单链阻遏蛋白R”R，。引 然而它与设计的相关操纵区的亲和力并不很高，Kd值约为 100pM。利用本工作中的随机筛选和合理设计的原则，得到了新的具有特异性识别和高亲和力的蛋白一DNA相互作用。这个方法可望用于其他DBP的新的结合特异性的筛选。二．非同位素的方法筛选单链阻遏蛋白的最佳DNA结合序列初探 克隆和表达了带半眈氨酸尾的单链阻遏蛋白，利用己包彼了马来酚胺的活性板可以与自由琉基结合的特性，将蛋白固定在活性板表面。体外筛选民。s民。。的最佳 DNA结合序列，得到了一些与 RT皿sRT。s结合的序列，但 Kd值 nM数量级。此方法需进一步优化。
梁铁兵, 谭克辉, 种康, 朱至清, S[2]2001年在《噬菌体434单链阻遏蛋白高亲和力DNA配体的筛选和设计》文中提出单链阻遏蛋白ＲＲＴＲＥＳ是噬菌体４３４阻遏蛋白的衍生物，含有两个ＤＢＤ（ＤＮＡ结合结构域），一个是野生型噬菌体４３４的ＤＢＤ－Ｒ，另一个是突变型ＤＢＤ－ＲＴＲＥＳ，二者用重组接头以头接尾的方式连接起来．ＲＴＲＥＳ的ａ－３－螺旋中－１，１，２，５位ＤＮＡ结合氨基酸分别为Ｔ，Ｒ，Ｅ，Ｓ．利用核心序列是ＣＡＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＴＴＴＡＴＧ的随机ＤＮＡ库，体外循环筛选ＲＴＲＥＳ的ＤＮＡ结合位点，将筛选到的群体克隆、测序．单链阻遏蛋白ＲＲＴＲＥＳ的亲和力测定表明，最适操纵区序列含有ＴＴＡＣ或ＴＴＣＣ（上述画线部分）时， Ｋｄ值在 １０－１２～－１１ ｍｏｌ／Ｌ的范围．天然噬菌体４３４阻遏蛋白与其操纵区的亲和力的 Ｋｄ值在１０－９ｍｏｌ／Ｌ数量级，与之相比，所筛选操纵区的亲和力明显提高．同时发现，亲和力大小还受到最适结合位点两侧碱基的影响，特别是５’位碱基的影响．根据ＲＴＲＥＳ的识别特性，设计了共有序列为ＧＴＡＡＧＡＡＡＲＮＴＴＡＣＮ或ＧＧＡＡＧＡＡＡＲＮＴＴＣＣＮ（Ｒ为Ａ或Ｇ）的单链阻遏蛋白ＲＴＲＥＳＲＴＲＥ的操纵区序列．结果表明，它们之间有特异性结合，且亲和力也很高．此方法可望用于其他ＤＮＡ结合蛋白新?
刘运洪[3]2011年在《人源抗VEGFR2单链Fab抗体克隆表达研究》文中研究说明[背景]肿瘤的生长、侵袭和转移受诸多因素影响和制约,血管形成是其重要因素之一。肿瘤血管不仅提供了肿瘤生长所需的营养,而且也是癌细胞播散的途径。在血管内皮细胞的增殖和血管生成过程中,血管内皮生长因子受体2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)起重要作用。目前以肿瘤血管形成为靶点的抗肿瘤治疗研究正成为当前的热点。Fab抗体(fragment antigen binding, Fab)是由两条肽链,即轻链(LC)和重链Fd段(Fd)通过二硫键和非共价键结合在一起,相当于全长IgG1抗体的1/3,其无Fc段,免疫原性低、分子量小,更易到达病灶,半衰期长于单链可变区片断(scFv),广泛用于与生物毒素等的融合表达,目前,成熟的噬菌体展示技术可以制备的完全人源化抗体Fab片断,其免疫排斥反应小,是极具潜力的免疫靶向治疗药物。但是,Fab在原核系统表达量普遍较低。本课题通过噬菌体展示技术成功建立全人源抗VEGFR2 Fab抗体,筛选获得较高亲和力的克隆,根据该Fab片断的特点,设计一段长约110bp的人工合成的linker基因,连接LC和Fd,使二者在一个起始子下翻译和表达,表达产物为一条肽链,形成单链Fab片断(single chain Fab fragment, scFab),借助高效表达载体pET系列,构建分泌型表达重组载体pET25b(+)-scFab和插入HRV3C蛋白酶切位点的融合型表达重组载体pET32a-HRV3C-scFab,通过建立最适表达和纯化条件,提高抗体在大肠杆菌里的可溶表达产量。[方法](1)从人外周淋巴细胞提取总RNA,逆转录为cDNA,通过PCR技术将LC和Fd基因克隆到噬菌体载体pComb3XSS上,构建抗人VEGFR2噬菌体抗体库,通过ELISA筛选亲和力和特异性高的克隆(抗体基因片段)。(2)利用PCR技术,从噬菌体抗体库中高亲和力的克隆中获得LC和Fd基因,在其两端引入酶切位点,以酶切-连接的方式克隆至设计含有linker基因质粒上linker的前后两端,以构建pGH-scFab重组载体方式将LC和Fd基因连接形成scFab基因片段。(3)选择pGH-scFab重组载体上合适的酶切位点,以酶切-连接的方式将scFab克隆至pET25b(+)载体上,构建pET25b(+)-scFab重组载体,转化3种不同的表达型宿主菌BL21(DE3)、Origami2(DE3)和Rosetta-gami 2(DE3),检测蛋白的表达形式,通过在不同温度、不同诱导起始OD600值、不同诱导剂IPTG浓度的条件下,研究pET25b(+)-scFab的最佳表达条件。(4)选择scFab两端合适的酶切位,以酶切-连接的方式克隆至设计含有HRV3C蛋白酶切位点的质粒上HRV3C基因下游,再以以酶切-连接的方式将HRV3C-scFab基因片段克隆至含硫氧还蛋白(Trx)的融合表达载体pET32a上,构建pET32a-HRV3C-scFab重组载体,转化表达型宿主菌Rosetta gami 2(DE3),通过在不同温度、不同诱导起始OD600值、不同诱导剂IPTG浓度的条件下,研究pET32a-HRV3C-scFab的最佳表达条件。(5)在最佳表达条件下,大量表达scFab抗体蛋白,按照镍柱亲和层析纯化,HRV3C蛋白酶切,凝胶层析的先后顺序纯化scFab,用超滤离心浓缩和BCA蛋白定量调整scFab蛋白浓度,再通过ELISA以及流式细胞术检测scFab的亲和力和特异性。[结果](1)构建了人源抗VEGFR2 Fab噬菌体抗体库,并通过4轮筛选获得了亲和力高的克隆pComb3XSS-Fab(33#)。(2)构建了pGH-scFab重组载体,成功地将LC和Fd基因在质粒上连接形成scFab基因片段。(3)构建了pET25b(+)-scFab分泌型表达重组载体,研究显示：最佳表达型宿主菌为Rosetta gami 2(DE3),主要为包涵体表达,最佳诱导温度为20℃,最佳诱导起始OD600值为0.4,最适诱导剂IPTG浓度为0.5mM。(4)构建了pET32a-HRV3C-scFab融合型表达重组载体,用表达型宿主菌为Rosetta gami 2(DE3)进行表达时,主要为可溶表达,最佳诱导温度为20℃,最佳诱导起始OD600值为0.8,最适诱导剂IPTG浓度为0.5mM。(5)先后通过镍柱的亲和层析纯化,HRV3C蛋白酶切,分子筛过滤纯化,超滤离心浓缩,最后得到高纯度的scFab抗体蛋白。蛋白浓度为0.1mg/m1时,直接法ELISA的OD450/570nm值为1.583,竞争抑制ELISA显示其对VEGF有53%抑制率,流式细胞术检测显示对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)有39.62%的结合力。[结论](1)噬菌体抗体库技术是获得人源抗体的有效途径,并且通过反复筛选可以得到高亲和力的克隆。(2)与Overlap PCR技术相比,在质粒上进行两个基因片段连接操作可行性更高,尤其是在像本实验中不易设计引物的情况下。(3)pET25b(+)-scFab和pET32a-HRV3C-scFab重组表达载体的表达条件研究显示：使用含大肠杆菌稀有密码子的宿主菌能显著增加scFab的表达；在没有分子伴侣的条件下,scFab主要以包涵体形式表达,硫氧还蛋白(Trx)的融合scFab进行表达能显著增加scFab的可溶表达量；此外低温、合适的诱导剂IPTG和起始起始OD600值都有利于增加scFab表达量。(4)本实验通过合适的纯化方式组合,最后得到高纯度的scFab抗体蛋白,HRV3C蛋白酶切是在低温(4℃)下进行,这既去除了分子伴侣,又保证了目的蛋白的活性。(5) scFab抗体蛋白的功能检测结果显示：linker的设计,对Fab的空间结构尤其是功能改变不大,但是能显著提高Fab抗体的产量。(6)本实验的研究结果为肿瘤血管靶向治疗动物实验及临床试验奠定基础,为Fab抗体的生产提供一个新的思路,也为本实验室建立了一个高效的原核融合表达平台。
吕波[4]2014年在《β-葡萄糖醛酸苷酶的底物特异性改造及其核酸适配体的固定化研究》文中研究表明甘草酸(GL)是一类重要的糖苷类化合物,具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎症、抗高血压、抗高血脂及促进肾上腺皮激素等功效,同时作为食品添加剂和精细化工品被广泛的用于食品工业和化妆品领域。其衍生物单葡糖醛酸基甘草次酸(GAMG)具有更好的生物利用度、生物安全性、药用治疗价值,同时甜度更高、溶解性与吸收性更强,而且结构本身具有更丰富的活性官能团,可为设计新型的甘草酸衍生物提供新的思路。为了提高大肠杆菌表达真菌来源的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)的底物特异性,本论文对催化水解甘草酸生成GAMG的PGUS-E进行一系列分子改造的研究,包括高效筛选PGUS-E底物特异性表达系统的构建,PGUS-E的非理性设计和半理性设计改造及其底物特异性机制的研究。同时,本论文探索了PGUS-E的特异性核酸适配体的筛选及其固定化应用研究。主要研究结果如下:以大肠杆菌E.coli DH5a为宿主,通过构建50nt的同源臂,利用Red同源重组敲除宿主自身表达得β-葡萄糖醛酸苷酶(E-GUS)的uidA基因。PCR验证和酶学考察成功敲除了uidA基因,消除了宿主β-葡萄糖醛酸苷酶(gusA)本底的干扰。构建了利用组成型表达真菌来源的β-葡萄糖醛酸苷酶,温度诱导表达噬菌体裂解酶SRRZ,一锅法(one-pot)筛选甘草酸催化底物特异性突变体的载体。考察了不同启动子强度的对PGUS-E表达的酶活影响,优化了不同温度下噬菌体裂解酶SRRZ的表达对宿主的裂解效率的影响。然后,通过定向进化技术对PGUS-E进行非理性改造。采用易错PCR构建PGUS-E的随机突变文库,通过优化Mn2+的浓度将突变率控制在1-2/kb,通过一锅法(one-pot)筛选方法进行筛选,通过筛选~10000个突变体后,获得了一系列底物特异性得到显著提高的突变酶,其中C9、F72和M51的效果明显,对甘草酸底物选择性分别提高了25%、37%和41%。结构分析表明突变体的突变位点均分布在远离活性中心的位置。利用Swiss-model同源建模构建了PGUS-E的三维结构模型,通过对突变位点的结构分析,TIM桶状结构域中α螺旋结构的变化对底物特异性的改善有很大的影响。为了进一步提高PGUS-E的底物特异性,对PGUS-E进行了进一步的半理性改造。利用同源比对确定了PGUS-E的活性位点,通过Autodock/Vina软件分子模拟对接了甘草酸、GAMG和葡糖醛酸与PGUS-E晶体结构的复合物结构,模拟预测得到的各底物结合位点并构建一系列的饱和突变体库。通过筛选~6000个突变体后,获得影响底物特异性关键位点Ala365和Arg563,底物特异性提高了65%和77%。将获得Ala365和Arg563位点进行组合突变,筛选甘草酸底物特异性进一步提高的突变体,其中突变体A365H/R563E、A365T/R563E的底物特异性分别为96%和95%。分析突变位点的结构变化,发现Thr365/His365的侧链通过范德华力的作用,π-π相互作用固定GAMG的部分糖基结构,减弱了GAMG与活性催化位点之间的亲和作用力,Glu563侧链的羧基影响Asp162的侧链使得五环三萜苷元的底物结合口袋更加紧密,进一步阻止苷元滑向Pgus-E的活性中心,提高PGUS-E底物的特异性,从分子水平解释了突变体氨基酸残基突变改变底物特异性的机理。建立了利用磁珠法SELEX技术筛选PGUS-E适配体的方法,构建了含有440个核酸随机文库,采用磁性纳米颗粒作为固相分离介质固定PGUS-E进行筛选核酸适配体。确定了dsDNA文库的PCR扩增的最佳退火温度、最佳扩增循环数,优化ssDNA的制备。经过18轮筛选,获得11个不同核酸适配体序列,通过序列分析,其二级结构主要以颈环和发夹结构存在。通过BIAcore亲和力测定和靶蛋白捕捉实验表明核酸适配体Apt5与PGUS-E有亲和力高、特异性强,其亲和力为200nM,达到了抗体-抗原的水平。考察Apt5固定化的PGUS-E的载体重复使用效率,使用7次后固定化的酶活为初始酶活的72%,Apt5的再生率为91%,具有良好的稳定性,为后续实现PGUS-E一步纯化固定化提供新的思路。
陈劲秋[5]1998年在《单链DNA结合蛋白——一个研究蛋白-DNA相互作用的模式系统(英文)》文中进行了进一步梳理我们设计并构建了一个新的单链DNA结合蛋白模式系统,它的基本骨架(RR)是将噬菌体434野生型阻遏蛋白(cI)的两个N-末端DNA特异性结合域(R)共价相连,RR与cI具有相同的特异性识别和高亲和力结合其DNA操纵子的能力。将RR中与DNA特异性相互作用的5个氨基酸替换成相关噬菌体P22的氨基酸,所得的R~*DNA结合域可特异性高亲和力地识别P22操纵子序列。通过筛选RR和RR~*的特异识别位点及测定其对不同识别序列的亲和力,我们进一步研究了此模式系统的识别特性。在此基础上,我们构建了此模式系统的随机蛋白库,并用它筛选出了一批可特异性识别特定DNA序列的新单链DNA结合蛋白。以上实验结果表明,此模式系统可用于构建筛选新的DNA结合蛋白,及用于研究DNA和蛋白相互作用的机理。
闫新[6]2008年在《枯草杆菌基因一步敲除法的建立和MPH在芽孢杆菌中表达的研究》文中研究指明枯草杆菌由于具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白较理想的宿主。但由于受自身分泌蛋白酶多、构建的重组表达质粒不太稳定等因素影响,其应用受到一定的限制。近年来,随着分子生物学和基因工程的发展及168菌株基因组测序的完成,枯草芽孢杆菌的研究进入了新的快速发展时期,而其作为基因工程表达系统也不断完善,并展现出良好的应用前景。同时,枯草芽孢杆菌的遗传学操作方法也在不断地更新,快捷高效的方法会大大提高研究的效率。本文旨在建立一套快捷高效的枯草杆菌遗传学操作方法,并应用其对宿主菌进行改造,以提高外源蛋白的表达效率。本文亦研究了农药降解酶的枯草杆菌孢子表面展示和野生芽孢杆菌的转化及外源蛋白表达,为农药降解酶剂型的开发和寻找新型表达系统打下了基础。现有的枯草芽孢杆菌遗传操作系统依赖于载体的构建和枯草芽孢杆菌自身的重组系统,耗时长、效率低。本文将Cre/loxP定点重组系统和重叠延伸PCR技术结合建立了一套快捷高效的枯草芽孢杆菌基因组操作方法。用重叠延伸PCR技术代替载体构建快速地将目标敲除位点的上下游同源臂和抗性标记盒融合起来,用Cre/loxP定点重组系统代替菌体自身的重组系统高效的删除抗性标记,整个操作过程可以在2天内完成,大大提高了效率。应用该方法实现了枯草芽孢杆菌的基因敲除、基因的框内删除(in-frame deletion)以及基因组大片断的删除。该方法还适用于基因组的重排(genome rearrangement)和大规模的基因敲除。为解决枯草芽孢杆菌表达系统蛋白酶问题而构建的缺失8个蛋白酶基因的WB800菌株染色体上残留了三个抗性标记(mpr::ble nprB::bsr wprA::hyg),影响该菌株的进一步改造及工程茵的构建。我们用新建立的方法依次将这三个抗性标记删除,获得了一株“绿色的”蛋白酶缺陷株WB8003,作为后续外源蛋白表达的宿主菌。基于Cre/lox定点重组系统和PCR技术的基因敲除方法可以改造成为将外源基因整合到枯草杆菌基因组上的快捷方法,且不留下抗性标记。我们将甲基对硫磷水解酶基因(mpd)表达盒插入到WB8003的淀粉酶基因(amyE)位点,得到工程菌株BSM1。该方法可用于将多个拷贝的目的基因表达盒整合到枯草杆菌基因的不同位点,可以优先选择蛋白酶基因位点,这样在增加表达盒拷贝数的同时又能将蛋白酶基因失活,从而达到提高目标蛋白表达量的目的。枯草杆菌168基因组上groESL操纵子和gut操纵子之间有段13 kb低G+C的区域叫原噬菌体3(propha 3),该区域含有BsuM(ydiO和ydiP)修饰系统和BsuM限制系统(ydiR,ydiS和ydjA),限制修饰系统对质粒转化效率的影响很大。我们用新建立的遗传操作方法删除了该区域,研究了其对质粒转化效率的影响,结果显示该限制修饰系统显著影响带有XhoI位点质粒的转化效率,对没有该位点的质粒影响不大。此外,本研究发现大肠杆菌对质粒的甲基化修饰不影响其对168的转化效率。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前应用最广泛的表达系统之一,我们在用其表达外源蛋白时往往要对宿主茵进行改造,但其现有的遗传操作方法效率较低。参照枯草芽孢杆菌中的模式,基于Cre/loxP定点重组系统和PCR技术,我们建立了一种高效快捷的毕赤酵母基因敲除方法,整个敲除过程可以在4天内完成,该方法被成功用于his4和pep4因的敲除。P.pastoris表达系统是将外源基因整合到染色体上进行表达,该方法亦可用于外源基因的多拷贝整合,提高表达量。芽孢杆菌的孢子抗逆性强、生产简单,近年来发展成为展示重组蛋白的优良载体。但研究者主要将其用于口服重组蛋白疫苗的载体,未见用于环境污染物修复的报道。目前报道的用于表面展示研究的有机磷水解酶只有OPH。在本研究中我们将本实验室分离到的有机磷水解酶MPH展示于枯草杆菌芽孢的表面。获得的重组孢子具有MPH活力,但是活力较低,离实际的应用还有很大距离,下步的工作重点是提高MPH的活力。农药的降解过程需要若干个酶的参与,孢子衣蛋白中CotB、CotC和CotG都可以作为外源蛋白展示的靶位点,可以用不同的靶位点在同一个孢子表面展示多个降解酶,将农药的降解途径从胞内转移到孢子表面。在本实验室之前的工作中发现通过将枯草杆菌模式菌株(供体茵)和野生的芽孢杆菌(受体菌)混合培养可实现不可自我转移的pUB110衍生质粒向受体菌的转移,但不知质粒通过何种方式进行转移。本研究证明野生芽孢杆菌通过形成感受态摄取供体菌释放的质粒,同时还发现质粒的存在形式和来源对野生芽孢杆菌的转化影响很大,多聚体和来源于相近种的质粒转化效率最高。并发现有些野生菌株在外源蛋白表达方面显著优于模式菌株。这为野生芽孢杆菌的转化提供了参考,也为进一步开发新的表达系统打下了基础。
陈宗艳[7]2008年在《DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用》文中研究指明鸭乙型肝炎病毒(Duck Hepatitis B Virus,DHBV)与乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus,HBV)同属嗜肝DNA病毒科,这类病毒的特征是有强的嗜肝细胞特性,在病毒形态、基因组结构、复制过程等生物学特性相似。DHBV感染鸭模型是研究HBV的生物学特性、致病机制和抗HBV药物的实验动物模型。本文通过调查四川地区麻鸭自然携带DHBV的情况,分离DHBV毒株,以此毒株为模板,扩增主要抗原基因preS。通过构建DHBV-preS原核表达质粒并诱导表达,从而对表达蛋白免疫原性、表达蛋白抗体介导的免疫组化检测人工感染DHBV后在体内的蛋白定位分析与侵染规律,以期系统地了解的入侵方式和复制机理,为阐明DHBV的发病机制提供关键的实验数据。同时建立基于定量检测DHBV的FQ-PCR方法,用于DHBV疾病模型研究,并结合体外模型HepG2.2.15细胞研究抗乙型肝炎新药,结果如下:DHBV毒株的分离及分子特征解析结果表明:四川麻鸭自然携带DHBV 4%,证实四川麻鸭是研究实验性DHBV感染动物模型的良好鸭种;对分离到的其中3株DHBV阳性血清全基因克隆、测序并进行生物信息学分析,发现全基因组均含3006个核苷酸(GenBank登录号EU429324,EU429325,EU429326),具有X-like开放阅读框特征;进一步研究ORF-S还表明该基因编码33个氨基酸,有四个疏水区,无N-糖基化位点,也无豆蔻酰化位点,在1～30aa内有一个明显的信号肽,在19～20aa处有断点,跨膜螺旋预测为外膜蛋白,抗原位点主要分布于preS区氨基酸序列中。根据DHBV-preS序列,设计一对特异性引物,以分离的DHBV毒株为模板扩增目标基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将DHBV-preS基因正向插入原核表达载体pET-32a(+)的ApaI和NcoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a(+)/DHBV-preS。重组表达质粒pET32a(+)/DHBV-preS转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,能表达出了大小约为37kD的preS重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;经对不同诱导时间及诱导剂IPTG浓度等条件进行优化,确定重组质粒pET32a(+)/DHBV-preS的最佳诱导条件为0.8mmol/LIPTG、37℃条件下诱导4h。表达产物用镍柱亲和层析纯化后,将得到的preS重组蛋白做梯度稀释,初步建立ELISA检测DHBsAb的方法(间接法);同时将纯化的重组蛋白与等量弗氏佐剂混合制备preS重组蛋白免疫原,四次免疫家兔,获得的兔抗DHBV-preS高免血清经辛酸-硫酸铵粗提后,阴离子交换柱层析纯化抗体IgG。建立DHBV-preS基因表达蛋白抗体介导的免疫组化方法;针对DHBV的保守序列设计并合成引物及荧光标记探针,建立实时荧光定量聚合酶链反应(fluorsescencequantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测方法。建立的标准曲线循环阈值(cycle threshold,Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.993,将其检测极限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为5copies/L,未检测到鸭病毒性肝炎、鸭瘟病毒、鸭源致病性大肠埃希氏菌、鸭源致病性沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌,表明FQ-PCR检测DHBV方法灵敏、特异性强。采用鸭乙型肝炎病毒人工方法感染1日龄四川麻鸭,攻毒后于不同时间采血分离血清,采集肝脏、胰腺、肾脏、脾脏等组织或器官,经建立的DHBV-preS基因表达蛋白抗体免疫组化方法和FQ-PCR方法检测DHBV在感染鸭体内侵染过程与定位分布,并结合组织学和血液生化指标对DHBV在感染鸭体模型侵染规律进行系统观察。结果显示:感染后2d可在血清和肝组织中检测出DHBV DNA,血清中DHBV DNA从感染后第10d～30d DHBV DNA的拷贝数保持在1.00E+09以上,肝组织中DHBVDNA的含量从感染后第5d～52d保持在5.00E+09以上;肝脏DHBV DNA第14d达到最高水平,而血清中DHBV DNA第22d达到最高水平。肝脏、胰腺、肾脏、脾脏的损伤程度与DHBV DNA水平成正相关;在感染后3～52d内的不同时间点从肝脏、胰腺、肾脏、脾脏及大脑六种组织器官中检测出DHBsAg,DHBsAg主要分布在细胞浆,少部分分布于细胞核,未能从食道、腺胃、肺、心脏、生殖器和肌肉中检测到DHBsAg,表明DHBV嗜肝的同时具有泛嗜性,且在靶器官的侵染与分布具有一定选择性;在感染后1～3d、52d以后各组织相继不能检出DHBsAg,感染后12～31d病毒在机体内各组织的分布最为广泛,感染后4d肝脏开始出现DHBsAg阳性细胞,感染后6d肾脏、胰腺、脾脏相继开始出现DHBsAg阳性细胞,而脑组织在感染后10d出现阳性细胞;肝脏的检出率最高,持续至52d,大脑的检出率最低,分析表明该蛋白可能是膜蛋白,具有运输核浆与引导病毒组分进入核内参与病毒复制的功能。DHBV感染后第4d,总蛋白和白蛋白含量开始降低,谷丙、谷草转氨酶活性升高(P＜0.01),乳酸脱氢酶活性升高(P＜0.01),肌酐和尿素有变化但无规律,表现为升高趋势,感染后44d开始,各项血液生化指标逐渐趋于正常值,表明DHBV引起肝脏损伤的同时累及肾脏。在建立的抗人类乙型肝炎新药体内药效评价的技术平台和体外模型HepG2.2.15上评价抗乙型肝炎新研制药物-核苷类似物(代号PNA)的作用。在HepG2.2.15细胞系中,PNA有明确的抑制HBV DNA复制作用,抑制HBsAg和HBeAg,在7.8～62.5μg/mL剂量范围内有剂量—时间依赖关系,未见到明显细胞学毒性;在鸭乙肝动物模型中,PNA对DHBV DNA抑制率达50%的最低用药剂量为口服20mg/kg,口服40mg/kg、80mg/kg PNA对DHBV的抑制率与拉米夫定口服组(50mg/kg)基本一致,可以减轻鸭脏炎症,抑制DHBsAg在肝脏中的表达。
李明辉[8]2006年在《人β2糖蛋白Ⅰ第一功能区重组质粒以及带有绿色荧光蛋白报告基因的pSilencer3.1-H1重组质粒的构建》文中认为β2糖蛋白1(beta2-glycoprotein 1,β2GPⅠ)是一种血浆糖蛋白,血浆含量较丰富,人血浆中β2GPⅠ含量为150-200mg/L。主要在肝脏合成,也可表达在其它细胞中。β2GPⅠ与血浆中脂类结合,参与脂肪的转运与代谢,最早称它为载脂蛋白H(apolipoprotein H,apoH)。它由326个氨基酸构成单一多肽链,组成5个功能区。1990年,几个研究小组同时报道了β2GPⅠ可能是抗磷脂抗体综合征(APS)的一种自身抗原以来,人们对β2GPⅠ与自身免疫性疾病的相关性进行了广泛的研究。目前普遍认为β2GPⅠ是抗磷脂抗体真正的靶抗原,但对于抗体特异性识别的β2GPⅠ抗原表位存在于哪个功能区的研究结果还存在许多分歧。有报导称其位于β2GPⅠ第五功能区,也有研究者认为β2GPⅠ第四功能区在隐藏表位的暴露中起关键性作用,但多数学者认为β2GPⅠ的特异性抗原表位最有可能存在于第一功能区。对抗磷脂抗体所针对的抗原及抗原表位的研究是当今抗磷脂抗体研究领域的热点之一,其关系到对许多自身免疫性疾病本质的认识。本文应用PCR技术获得了人β2GPⅠ第一功能区cDNA片段,根据同尾酶特性,构建了人β2GPⅠ第一功能区的二串联体cDNA。将β2GPⅠ第一功能区单体和二串联体基因序列插入PQE30原核表达载体,经IPTG诱导获得大量目的蛋白,利用所表达的蛋白的N端携带的6个组氨酸与镍离子的亲合性纯化目的蛋白,纯化的目的蛋白经免疫印迹分析证明,人β2GPⅠ第一功能区单体和二串联体蛋白同人β2GPⅠ全长蛋白一样能与小鼠抗人β2GPⅠ单克隆抗体特异性结合,具有人β2GPⅠ的抗原性,且二者与APS患者血清中抗hβ2GPⅠ抗体的结合活性同人β2GPⅠ全长蛋白无明显差别,表明人β2GPⅠ的特异性抗原表位很可能存在于它的第一功能区。本课题为进一步研究抗人β2GPⅠ抗体所针对的抗原表位奠定了基础,对于深入探寻自身免疫性疾病的发病机理和治疗方法具有重要意义。
萨仁高娃[9]2007年在《文昌鱼含有DUF985和Phd-like-VIAF基序的理论蛋白基因的鉴定、表达和功能分析》文中指出随着基因组测序的迅猛发展,越来越多的含有DUF985保守域的理论蛋白基因被提交到数据库。这些基因不和任何一种已知蛋白或已知功能的蛋白相关。我们实验首次表明文昌鱼中编码DUF985保守域的蛋白具有磷酸葡萄糖异构酶活性,是其家族的一个新的成员。我们成功地将BbDUF985在大肠杆菌表达系统和酵母表达系统中得到表达;酵母表达系统中表达的重组蛋白活性高达440 U/mg,远远高于大肠杆菌表达系统表达的重组蛋白。组织切片的原位杂交实验和免疫组化实验证明,BbDUF985的表达具有组织特异性,其在肝盲蘘和卵巢中的表达水平较高。在转染了表达质粒pEGFP-N1/BbDUF985的CHO细胞中,融合蛋白定位于胞质中,表明BbDUF985是一个细胞质蛋白。另一方面,Western blotting实验证明BbDUF985也可被分泌到文昌鱼的体液当中,BbDUF985的细胞质和细胞外的并存这一事实似乎表明其与已知的PGI一样,可能具有多种生物学功能。本项研究成功地描述了含有DUF985保守域的理论蛋白的表达、生物功能和细胞定位,为近一步了解这种理论蛋白的生化和生理功能奠定了基础。我们还对文昌鱼含有phd-like-VIAF保守域的理论蛋白基因进行了鉴定,许多含有phd-like-VIAF保守域的理论蛋白基因被提交到数据,这些基因和已知蛋白phosducin-like 3或未知功能的蛋白相关。我们成功地将Amphi-phdL在大肠杆菌表达系统中得到表达。组织切片的原位杂交实验和免疫组化实验证明,Amphi-phdL的表达具有组织特异性,其在肝盲蘘和卵巢中的表达水平较高。在转染了表达质粒pEGFP-N1/Amphi-phdL的CHO细胞中,融合蛋白定位于胞质中,表明Amphi-phdL是一个细胞质蛋白。Western blotting实验证明Amphi-phdL在文昌鱼的组织液和体液都存在,至于Amphi-phdL的功能正在进行鉴定中。
侯巍[10]2006年在《H-FABP表达、单克隆抗体制备、测定方法建立及临床应用研究》文中进行了进一步梳理本研究的目的是通过建立H-FABP的测定方法,观察其在心血管疾病中的应用价值。通过大肠杆菌和毕赤酵母表达并纯化了重组人H-FABP,将其免疫BALB/c小鼠,与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得抗人H-FABP单克隆抗体。建立了人血清H-FABP ELISA测定方法并进行了初步的临床应用。 1 根据已报道的人H-FABP基因序列,采用RT—PCR的方法从人心肌中获得H-FABP基因。将所得的PCR产物插入原核表达载体pQE30、pBV220和酵母pPICZαA得重组质粒(pQE-H-FABP、pBV-H-FABP和pPICZ-H-FABP)并转化大肠杆菌M15、DH5α和毕赤酵母X-33,通过IPTG诱导、温度诱导和甲醇诱导,成功表达并纯化了三种不同形式的人H-FABP。首次报道通过大肠杆菌DH5α和毕赤酵母X-33表达H-FABP。 2 成功的制备并纯化了7株抗人H-FABP单克隆抗体,通过鉴定,从中筛选出4D7、9H10两株亲和力高、空间位点不同的单克隆抗体。 3 建立了人血清H-FABP夹心ELISA测定方法,对其精密度、灵敏度、线性范围、稳定性进行了检测。并与进口同类方法试剂盒进行比较(r=0.99)。解决了目前人血清H-FABP测定 4 首次将H-FABP与MYO、cTnI、CK-MB联合测定应用于AMI诊断。解决了AMI早期无国产试剂盒的问题。 5 首次将H-FABP与cTnI、CK-MB、CRP联合测定应用于UA诊断和与预后观察。 6 证明了H-FABP在AMI和UA早期诊断中的作用。 7 为建立快速AMI早期诊断方法奠定了基础。
参考文献：
[1]. 噬菌体434单链阻遏蛋白的高亲和力DNA结合序列的设计和`筛选[D]. 梁铁兵. 中国科学院植物研究所. 2000
[2]. 噬菌体434单链阻遏蛋白高亲和力DNA配体的筛选和设计[J]. 梁铁兵, 谭克辉, 种康, 朱至清, S. 中国科学(C辑:生命科学). 2001
[3]. 人源抗VEGFR2单链Fab抗体克隆表达研究[D]. 刘运洪. 昆明医学院. 2011
[4]. β-葡萄糖醛酸苷酶的底物特异性改造及其核酸适配体的固定化研究[D]. 吕波. 北京理工大学. 2014
[5]. 单链DNA结合蛋白——一个研究蛋白-DNA相互作用的模式系统(英文)[C]. 陈劲秋. 生命科学与生物技术：中国科协第三届青年学术年会论文集. 1998
[6]. 枯草杆菌基因一步敲除法的建立和MPH在芽孢杆菌中表达的研究[D]. 闫新. 南京农业大学. 2008
[7]. DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用[D]. 陈宗艳. 四川农业大学. 2008
[8]. 人β2糖蛋白Ⅰ第一功能区重组质粒以及带有绿色荧光蛋白报告基因的pSilencer3.1-H1重组质粒的构建[D]. 李明辉. 吉林大学. 2006
[9]. 文昌鱼含有DUF985和Phd-like-VIAF基序的理论蛋白基因的鉴定、表达和功能分析[D]. 萨仁高娃. 中国海洋大学. 2007
[10]. H-FABP表达、单克隆抗体制备、测定方法建立及临床应用研究[D]. 侯巍. 吉林大学. 2006
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