杨洁[1]2002年在《抗人精浆蛋白单抗Fab段基因的克隆及表达》文中研究表明随着人口老龄化和生活方式的改变，前列腺癌的发病率有增高的趋势，已成为男性群体的一大危害。由于一部分患者不能手术切除，而放疗、激素治疗及化疗缺乏特异性，因而毒性大，应用受限，迄今尚不能达到理想的治疗效果。1987年提出的抗体导向酶—前药疗法(antibody-directed enzyme prodrug therapy,ADEPT)即抗体与前药的专一性活化酶交联，并将其特异性结合于肿瘤部位，使前药可以区域特异性地在肿瘤组织内转化为细胞毒分子，可以提高毒性药物的特异性和疗效，同时减少毒副作用。精浆蛋白是一种组织特异性抗原，它是良性的、增生的以及恶性的前列腺上皮细胞产生的特异性蛋白。近年我室开始进行ADEPT疗法的实验研究，已成功地构建了具有高度的特异性和亲和力的抗人精浆蛋白单抗IgGl，并表达了与酶的交联物，有可能成为治疗前列腺癌的有效方案。但是，由于是鼠源性抗体，在人体内应用过程中既可诱发人抗鼠抗体反应(human antimurine antibody response,HAMA)，又影响单抗疗效，使之应用受到很大限制，也使单抗用作治疗药物的研究一度受挫。 基因工程抗体技术的发展，使基于抗体基础上的治疗研究重新受到关 第 四 军 医 大 学 硕 士 学 位 论 文 注。抗体工程包括嵌合抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体库、抗体融 合蛋白和用作反应器的转基因生物。随着技术的积累和总结，抗体工程正 向着成熟、完善、高水平的技术平台发展。本研究尝试用基因工程的方法 对该单抗进行改构，以期获得小分子抗体，减少其免疫原性。 根据抗体第一骨架区保守性编码序列和恒定区序列，设计了一组引 物，采用RT－PCR方法，从抗人精浆蛋白杂交瘤细胞巳B，中克隆出hb的K 链基因和重链Fd段基因，分别构建到真核表达载体poD“3中，转染HeLa 细胞。用免疫荧光染色方法观察到所克隆的抗人精浆蛋白ib的K链基 因、重链Fd段基因分别具有表达活性。将K链基因和重链Fd段基因构建 到噬粒pComb3中，构建表达载体pComb3－Fab，转化大肠杆菌XLIBlue， 表达了噬菌体抗体。用＼he和 Spe消化噬菌体外壳蛋白 gill基因，自 身连接得到可溶性Fab的表达载体pComb3－Fabs，并表达了可溶性Fab， SDS聚丙烯酚胺凝胶电泳（SDS－PAGE）显示，可溶性 Fab经还原剂处理后 在分子量小于30KD位置上出现两条带。并对表达的小分子抗体进行活性 鉴定。酶联免疫吸附实验（ELISA）结果表明，表达产物与人精浆蛋白有 良好的结合活性。免疫印迹（Western blot）分析显示，该产物可与人精 浆蛋白发生免疫反应。免疫细胞化学对所表达的小分子抗体进行鉴定，该 抗体分子片段具有与人精浆蛋白结合的活性。非竞争酶免疫法初步测定， 本实验表达的Fab段的亲和力约为0．2 XI 00y‘。
杨洁, 郝晓柯, 孙脊峰, 赵晶, 于翠娟[2]2004年在《抗人精浆蛋白单克隆抗体Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达》文中研究表明目的 获得鼠抗人精浆蛋白单克隆抗体Fab段基因并在大肠杆菌中表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,用逆转录聚合酶链反应技术 (RT PCR)克隆Fd段和κ链基因 ;构建到噬粒pComb3中 ;并用ELISA、Westernblotting和免疫细胞化学分析证明表达的Fab段特异性结合人精浆蛋白。结果 从分泌抗人精浆蛋白的鼠单克隆抗体杂交瘤细胞系E4B7中克隆出了重链Fd段和κ链基因 ,经序列测定表明 ,Vκ 属于鼠免疫球蛋白ⅩⅢ家族 ,VH与鼠免疫球蛋白MUSIGHAEI同源性最高。将该Fd和κ链基因克隆到表达载体pComb3中 ,在大肠杆菌中获得了表达。结论 ELISA、Westernblotting和免疫细胞化学分析表明 ,表达的Fab段可以特异性的与人精浆蛋白结合
杨洁, 郝晓柯, 张盈华, 孙脊峰, 赵晶[3]2002年在《抗人精浆蛋白单抗重链Fd段基因的克隆及其在HeLa细胞的表达》文中认为目的 获得鼠抗人精浆蛋白 m Ab重链 Fd段基因 ,并将其转染到 He L a细胞进行表达 .方法 从分泌抗人精浆蛋白 m Ab的杂交瘤细胞系 E4 B7中提取总 RNA,用 RT- PCR法获取重链 Fd段 c DNA.将其克隆入真核表达载体 pc D-NA3,用脂质体转染法转染 He L a细胞 ,并用免疫荧光染色方法检测重链 Fd段的表达 .结果 从分泌抗人精浆蛋白的鼠m Ab杂交瘤细胞系 E4 B7中克隆出了重链 Fd段基因 ,序列测定表明 ,VH 与鼠免疫球蛋白 MUSIGHAEI同源性最高 .将含重链 Fd段基因的真核表达载体 pc DNA3- E4 B7Fd中转染He L a细胞后 ,在 He L a细胞中检测到了重链 Fd段的表达 .结论 获得了序列正确的重链 Fd段基因 ,它在 He L a细胞中可以成功地表达 ,为进一步构建和表达 Fab奠定基础 .
孙脊峰, 杨洁, 郝晓柯, 赵晶, 温伟红[4]2003年在《抗人精浆蛋白抗体Fab片段在大肠杆菌中表达及活性鉴定》文中指出目的 :构建编码抗人精浆蛋白抗体Fab基因的表达载体 ,并在大肠杆菌中进行表达。方法 :从克隆载体pUC19 К和pBluescriptKS(M13 ) Fd中 ,酶切获得抗人精浆蛋白单克隆抗体 (mAb)Fd基因和К链基因。然后将Fd和К链基因重组到Fab表达载体pComb3中 ,构建抗人精浆蛋白Fab基因的重组表达载体pComb3 Fab ,并在XL1 Blue菌中表达。结果 :经重组表达载体转化的XL1 Blue菌株可表达Fab基因。Westernblot和免疫细胞化学分析表明 ,表达产物Fab具有特异性结合精浆蛋白的活性。结论 :抗人精浆蛋白Fab基因成功地获得 ,为进一步将其与抗肿瘤药物偶联用于前列腺癌的导向治疗创造了条件。表达为构建其它基因工程抗体提供了基础。
杨洁, 郝晓柯, 张盈华, 孙脊峰, 赵晶[5]2002年在《抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达》文中研究表明目的 获得鼠抗人精浆蛋白单抗（ｍＡｂ）κ链基因，并将其转染到ＨｅＬａ细胞进行表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白ｍＡｂ的杂交瘤细胞系Ｅ４Ｂ７中提取总ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ法获取κ链ｃＤＮＡ。将其克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３，用脂质体转染法转染ＨｅＬａ细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠ｍＡｂ杂交瘤细胞系Ｅ４Ｂ７中克隆了κ链基因。序列测定表明，Ｖκ属于鼠免疫球蛋白ⅩⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－Ｅ４Ｂ７κ转染ＨｅＬａ细胞后，在ＨｅＬａ细胞中检测到了κ链的表达。结论 获得了序列正确的κ链基因，并在ＨｅＬａ细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Ｆａｂ段打下了良好基础。
参考文献：
[1]. 抗人精浆蛋白单抗Fab段基因的克隆及表达[D]. 杨洁. 第四军医大学. 2002
[2]. 抗人精浆蛋白单克隆抗体Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达[J]. 杨洁, 郝晓柯, 孙脊峰, 赵晶, 于翠娟. 免疫学杂志. 2004
[3]. 抗人精浆蛋白单抗重链Fd段基因的克隆及其在HeLa细胞的表达[J]. 杨洁, 郝晓柯, 张盈华, 孙脊峰, 赵晶. 第四军医大学学报. 2002
[4]. 抗人精浆蛋白抗体Fab片段在大肠杆菌中表达及活性鉴定[J]. 孙脊峰, 杨洁, 郝晓柯, 赵晶, 温伟红. 细胞与分子免疫学杂志. 2003
[5]. 抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达[J]. 杨洁, 郝晓柯, 张盈华, 孙脊峰, 赵晶. 细胞与分子免疫学杂志. 2002