摘要：微生物学的研究近年来得到广泛的关注，尤其是为生物多样性的研究尤为突出。微生物多样性的深入研究将有助于微生物资源更好地开发和利用。而矿泉是比较独特的生境，对其研究可以丰富微生物资源的认识，为后续微生物资源的开发利用提供理论基础。本文总结了现阶段国内外对微生物多样性研究的主要方法，为微生物学的研究发展提供基础支撑。
关键词：微生物；多样性；矿泉
水循环系统的一个重要和有趣的现象是“泉”，而矿泉的主要成因是大气降水入渗至地下，并在地下含水层中由水力梯度驱动发生渗流，遇侵入岩体等低渗透性地质体阻挡、或者承压水出露于地表，形成不同类型的泉水。
目前国内外对于矿泉水微生物的研究主要可根据矿泉水的温度分为冷泉和热泉，主要包括对矿泉水中的土著微生物群落的组成以及矿泉中特异性菌株的开发利用等方面。关于冷泉微生物相关的研究，国外研究者主要以硫化物冷泉泉水为研究对象，着重针对微生物组成、群落多样性以及功能进行调查。热泉是由于火山爆发而形成的独特生态系统，在温度、压力、盐度以及PH值等理化指标方面，都有其鲜明特征，包括陆地热泉和海底热泉两种。对于热泉微生物的研究，国际与国内都集中在宝贵的嗜热微生物资源上。
环境中微生物是由多个种群组成的微生物群落，是地球上多样性最为丰富的生物类群，虽然不被人类肉眼所见，但是却广泛的参与了地球的物质和能量循环。它们的不同种群之间存在着共生、互利、共存、竞争等各种复杂的关系，在物质循环和能量转化过程中发挥着重要作用。对环境微生物群落的研究可以从微生物的量、代谢活性、群落结构多样性及代谢功能等几个不同方向进行。其中，微生物群落多样性是环境微生物群落研究的核心内容。研究环境微生物多样性可以了解微生物群落结构，微生物的种类和数量分布特点，并且可以从群落层面上了解和评价生物修复和生物处理技术的机理与效果，同时为控制和优化微生物群落结构提供科学依据[1]。
1.环境微生物多样性的研究方法
1.1微生物平板纯培养法
微生物平板纯培养法是细菌培养最常用的方法，它是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。这种计数法的优势在于能测出样品中的活菌数，且操作简便、检测准确性好，因而得到广泛应用。其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度本法特别适合于测定沉积物中微生物的特定生理群的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群(如大肠菌群)的数量[2]。微生物平板纯培养法是用于估计微生物多样性的传统方法，被认为是监测特殊微生物群落变化的行之有效的方法。可用于跟踪特定分类组或功能组的微生物数量，并评价在该平板上的微生物群落的组成[3]。
1.2BIOLOG平板分析法
BIOLOG法是目前已知的研究微生物代谢功能多样性很有效的方法，该方法依据微生物在利用碳源过程中产生的自由电子与四唑盐染料可发生还原显色反应的原理，颜色的深浅表示微生物对碳源的利用程度。通过在一块微平板上同时测定微生物对不同单一碳源的利用能力来鉴定纯种微生物或比较分析不同的微生物群落。该方法是一种较为快速、简便的好方法，可以获得大量土壤环境微生物群落结构和功能多样性方面的信息[4]。
1.3磷脂脂肪酸方法
磷脂脂肪酸谱常被用于研究复杂群落中微生物的多样性，是基于生物化学手段的一种微生物生态学研究技术。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆它利用有机溶剂将土壤中活体微生物通过不同生化途径合成的磷脂脂肪酸浸提出来，经过分离纯化，通过对脂肪酸谱图的解析确定微生物群落的结构以及微生物量。该方法最适合用作总微生物群落分析，而不是专一的微生物种类的研究[5]。
1.4分子生物学技术
1.4.1变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE）技术
由于受到营养物质和培养条件的限制，自然界中只有0.1%～1%的微生物能够被作为细菌培养，并且培养条件要求高，测定周期较长，操作较复杂，只适于进行特殊生理类群的测定。因此，依赖于纯培养进行微生物多样性分析时其结果往往具有局限性，20世纪90年代引入分子生物学技术之后，将环境微生物领域带入一个革命性的新时代。分子生物学技术手段的发展使微生物多样性与生态系统功能关系的研究上也有了巨大的进步，这种方法直接从基因水平对土壤环境微生物进行分析，可以反映土壤中绝大部分的微生物信息，是目前应用于微生物多样性研究的重要的方法[6]，其广泛应用为研究微生物遗传多样性带来了新的契机。原来建立在实验室培养基础上的形态学和细胞学研究逐渐在向不依赖于培养的分子生物学和分子遗传学研究转换[7]。
1.4.2高通量测序技术
随着分子生物学的发展，以16S rDNA基因为分子标记的高通量测序技术凭借低成本、高通量、流程自动化的优势为研究转基因作物对根际细菌群落结构的影响提供了新的技术平台。目前，市面上常用的用于研究环境微生物的高通量测序平台有Illumina MiSeq、Ｒoche 454。
16S核糖体RNA(16S ribosomalRNA，简称16S rRNA)是原核生物的核糖体中30S亚基的组成部分。由于不同种的真细菌与古细菌之间的16S rＲNA编码基因16S rDNA是高度保守的，且16S rDNA序列长度适中(1540bp)，包括9个高可变区(hypervariable region)和8个保守区(constant region)，因此，常被用于对各种生物进行系统发生学方面的研究。利用16SrDNA的通用引物进行PCR扩增，获得绝大部分微生物16SrDNA高可变区的扩增产物，构建扩增产物的文库，运用llumina MiSeq平台或Roche454平台进行高通量测序，然后比较分析测序数据，对土壤微生物群落的多样性进行研究。
2.展望
深入的了解矿泉微生物群落的多样性，可以更好的开发利用微生物资源。本文总结的研究方法都存在局限性，因此，发展新技术研究矿泉微生物多样性极具挑战性，尚需科研人员进一步探索。
参考文献
[1]陈晶.微生物多样性的研究方法概况[J].生物技术,2005,(04):85-87.
[2]潘虹,杨臣,方振兴,孙义敏,吴婧.五大连池新生代火山泥有机成分检测及其指标相关性分析[J].安徽农业科学,2016,44(04):193-196.
[3]马美玲.环境工程中微生物分析方法研究进展[J].科技信息,2011,(22): 183.
[4]焦晓丹,吴凤芝.土壤微生物多样性研究方法的进展[J].土壤报,2004, (06):789-792.
[5]刘银银,李峰,孙庆业,谢永宏.湿地生态系统土壤微生物研究进展[J].应用与环境生物学报,2013,19(03):547-552.
[6]张薇,魏海雷,高洪文,胡跃高.土壤微生物多样性及其环境影响因子研究进展[J].生态学杂志,2005,(01):48-52.
论文作者:刘艳君
论文发表刊物:《基层建设》2019年第19期
论文发表时间:2019/9/20
标签：微生物论文; 群落论文; 多样性论文; 方法论文; 土壤论文; 热泉论文; 环境论文; 《基层建设》2019年第19期论文;