（河北省沧州中西医结合医院神经外科 河北 沧州 061001）
【摘 要】目的：研究人脑胶质瘤CDl33和CD34表达与预后的关系。方法：采用免疫组化方法检测63例人脑胶质瘤中的CDl33、CD34的表达情况，并将结果与临床预后随访结果进行综合分析。结果：CDl33总阳性表达率为68.2%，其中强表达14例（22.2%），中度表达13例（20.3%），弱表达16例（25.3%），不表达20例（31.7%），有显著性差异（ P < 0.01）。CDl33表达水平与胶质瘤恶性程度相关（P < 0.01）。胶质瘤I级、II级、III级- IV级CD34标记的平均微血管密度（micro vessels density, MVD）分别为（34±13）、（67±31）、（121±48），有显著性差异（ P < 0.01）。CD34表达与CDl33表达水平相关（ P < 0.01）。CDl33表达与生存时间负相关（ P < 0.01）。结论：CD34和CDl33表达有一定相关性，CD34与脑胶质瘤新生血管生成有关。CD34、CDl33联合检测可准确判断患者的预后。
【关键词】CDl33；CD34 ；胶质瘤 ；免疫组化；预后
【中图分类号】R739.4 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）6-0535-02
CDl33最初被发现选择性表达在人胎肝、骨髓、脐血及外周血CD34+造血细胞中，被作为造血干细胞标记物被人们认识，迸一步研究发现CDl33也表达于神经干细胞以及神经前体细胞上。近年来有研究表明，CDl33阳性表达的肿瘤干细胞是一种具有肿瘤再生潜能的细胞，具有自我更新和多向分化的特性，是肿瘤侵袭性生长、复发及转移的根源。CD34在肿瘤间质小血管的表达作用已得到证实，目前普遍认为它是血管内皮细胞的首选标记物，能清晰显示肿瘤微血管[3]。本研究选取63例人脑胶质瘤患者的瘤组织标本，对CDl33表达及其与血管生成及与其临床预后的关系进行了研究，现报告如下。
1 资料与方法
1.1病例资料
研究对象为河北省河北医科大学第二医院神经外科和沧州中西医结合医院神经外科2006 年8月～2010 年5 月住院手术切除且保存完好的胶质瘤组织的石蜡包埋标本，临床资料完整，男性33例，女性30例，脑胶质瘤组织学分析根据2000年修改的WHO神经系统肿瘤分级标准对其进行组织学的分类分级，其中I级23例， II级23例， III-IV级17例。另取沧州中西医结合医院神经外科因颅脑损伤行内减压术患者6例正常脑组织作对照，所有胶质瘤患者术前均未接受过化疗或放疗等辅助治疗。所有标本经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4微米厚切片编码备用。
1.2 主要试剂
兔抗人CD133单克隆抗体（浓缩型）购自博士德公司， SP免疫组化染色试剂盒购自河北博海生物公司，CD34单克隆抗体、DAB试剂盒、PBS缓冲液和柠檬酸盐抗原修复液，均购自北京中杉生物技术有限公司。
1.3 免疫组织化学染色
石蜡切片常规脱蜡水化，蒸馏水漂洗3min，切片置0.01mol/L,枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min）进行抗原修复，自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温。取出切片，蒸馏水冲洗两次，每次3min，用0.01 mol/LPBS液冲洗2次共5min。使用3%双氧水阻断灭活内源性过氧化物酶， CDl33一抗稀释度1:200，按照试剂盒说明进行操作（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照），甩去PBS液，每张片滴加2滴新配制的DAB溶液（按说明书配制），3-5min后显微镜下观察显色情况。蒸馏水充分冲洗，苏木精轻度复染1min，常规脱水，透明，干燥，封片。
CD34染色步骤：石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(PH值7.4)冲洗3次，每次3min,切片加入装有150ml0.01%枸橼酸150ml微波抗原修复8 min,凉至室温30 min，3%过氧化氢室温孵育5 min，一抗室温孵育90 min，生物素化二抗室温孵育10 min，DAB孵育5 min,复染、透明、封片。
1.4 结果判定
CD133为跨膜蛋白，定位于细胞膜及细胞浆，以细胞膜和细胞浆出现棕黄色为阳性，低倍和高倍镜下观察并在高倍镜（400X）下随机选择5个视野，计算出阳性细胞所占的百分率。结果判定标准：阴性（-）：肿瘤组织完全不着色或阳性细胞数小于5%；弱阳性（+）：肿瘤组织阳性细胞数6%—25%；阳性（++）：肿瘤组织阳性细胞数25%—50%；强阳性（+++）：肿瘤组织阳性数大于50%。
平均微血管密度（micro vessels density, MVD）的判定和MVD值计数 CD34染色阳性为血管内皮细胞膜或细胞质呈棕黄色或棕褐色。新生血管通常以肿瘤内MVD来表示，具体参照Weidner报道的方法。每张切片记录5个高倍视野下微血管数目，取其平均值作为该标本的MVD（个/视野），用MVD值表达CD34表达数量。
随访：手术之日即为随访开始时间。术后3个月内死亡者或随访期内死于脑胶质瘤以外原因者不计入统计资料。
1.5 统计学方法
全部实验数据均采用SPSS17.0统计软件分析处理。根据比较对象的不同，分别使用χ2 检验和Sperman相关性分析等方法。
2 结果
2.1 CDl33表达与胶质瘤临床病理级别的关系
本研究63例脑胶质瘤组织中CDl33总阳性表达率为68.2%，其中强表达14例（22.2%），中度表达13例（20.3%），弱表达16例（25.3%），不表达20例（31.7%）。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆CDl33表达在不同分化程度组织有显著性差异（χ2=35.67，P < 0.01），CDl33表达水平与脑胶质瘤病理级别成正向强相关（r=0.711, P < 0.01），见表1。随着胶质瘤级别的升高，CDl33阳性细胞表达明显增高，见图1。 正常脑组织CDl33阴性表达。
2.2 CD34免疫组化结果
脑胶质瘤组织微血管内皮细胞均呈CD34抗体反应阳性。胶质瘤I级、II级、III-IV级微血管密度（MVD）分别为（34±13）、（67±31）、（121±48）。3组组间比较有显著性差异（ P < 0.01），见表2。CD34-MVD值与胶质瘤病理级别成正相关性，随着两者的表达增高，MVD的表达也明显增高，见图2。
表1 CDl33、CD34的表达与胶质瘤分级的关系
Table 1 the expression of CDl33, CD34 and glioma grading relationship
组别n CDl33表达（例）合计[例数(%)]MVD
--++++++
I级23166107(30.4)34±13
II级23477519(82.6) 67±31
III-IV级17035917(100.0)121±48
图1 CDl33在胶质瘤中的表达 (SP 400X) A WHO I级 B WHO II级C WHO III—IV级
Fig.1 Expression of CDl33 in Glioma (SP 400X)A Grades I B Grade II C Grade III—IV
图2 CD34在胶质瘤中的表达 (SP 400X) A WHO I级 B WHO II级C WHO III—IV级
Fig.2 Expression of CD34 in Glioma (SP 400X)A Grades I B Grade II C Grade III—IV
2.3 临床资料随访结果
胶质瘤I级、II级、III-IV级患者生存时间（月）分别为（49.7±12.9）、（32.1±9.4）、（18.5±6.5）。3组组间比较有显著性差异（ P < 0.01）。
2.4 CDl33与CD34、生存时间的关系
本研究显示CDl33表达与CD34呈正相关（ P < 0.01）；患者生存时间与CDl33表达呈负相关（ P < 0.01）；CD34表达与患者生存时间呈负相关（ P < 0.01），见表2。
表2 CDl33表达水平对CD34表达及生存时间的影响
Table 2 the level of expression of CDl33 on CD34 expression and survival time of mice
表达程度 nMVD生存时间（月）
CDl33（—）20149±5849.6±11.1
CDl33（+）16276±89 35.2±8.6
CDl33（++）13451±142 31.0±14.1
CDl33（+++）14578±151 19.6±5.8
3 讨论
近几年胶质瘤研究领域的热门话题为肿瘤干细胞（ tumor stem cell，TSC）理论，该理论认为肿瘤组织中存在一种具有无限增殖、自我更新和多向分化潜能的干细胞，其为肿瘤的侵袭性生长、复发及转移提供种子。CD133是目前公认的脑肿瘤干细胞的表面标志物。Nelson等发现只需将100个CD133阳性的脑肿瘤干细胞移入NOD-SCID鼠脑内就可产生具有亲代肿瘤细胞表型的肿瘤，而移植上千倍的CD133阴性的普通肿瘤细胞也未见肿瘤生成。有研究表明，从恶性脑肿瘤中分离获得的肿瘤干细胞球均显示CD133染色阳性。国内学者朱玉德等研究发现在胶质瘤细胞系和胶质瘤组织中均存在CDl33+的脑肿瘤干细胞，具有自我更新和多向分化潜能。本研究在低级别胶质瘤的免疫组化镜下图像中可见较多病理标本无阳性细胞，即便是有也是少许、散在的CD133阳性细胞，而在高级别胶质瘤的图像中无阳性细胞表达的阴性病理标本数量较少，但表达CD133阳性细胞的标本可见明显的聚集、巢状分布现象。结果分析显示CDl33在胶质瘤中的表达与胶质瘤病理分级呈正相关，即胶质瘤级别和恶性程度越高，CDl33的表达越强。
肿瘤组织的生长、转移与血管生成具有比较密切联系。肿瘤的平均微血管密度即可反映肿瘤诱导新生血管形成的能力，又可作为反映肿瘤具有快速转移性的重要标志。CD34是血管内皮细胞标记物中较敏感的指标，其在新生血管内皮中表达远大于非新生血管内皮。CD34在肿瘤间质小血管的表达作用已得到证实。本实验发现胶质瘤内CD34-MVD均显著高于正常脑组织，胶质瘤恶性程度越高，微血管密度越高。提示肿瘤组织新生血管生长明显强于正常组织，表明肿瘤在向外浸润生长过程中，其血管新生、血管同化与肿瘤生长协调进行。
CDl33与CD34的关系的研究目前少见报道，其相互作用分子机制尚不清楚。本研究表明CD34与患者临床预后有关，CDl33表达水平与肿瘤患者的预后呈负相关。因此联合检测CDl33、CD34可作为判断胶质瘤患者的预后的指标。
参考文献：
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[5]黄强，董军，朱玉德，等．人脑胶质瘤组织中分离与培养肿瘤干细胞．中华肿瘤杂志，2006，28：331-333．
论文作者:孔令军,夏清岫,刘,刚,潘,亮
论文发表刊物:《河南中医》2015年6月供稿
论文发表时间:2015/10/19
标签：肿瘤论文; 阳性论文; 胶质瘤论文; 细胞论文; 组织论文; 干细胞论文; 血管论文; 《河南中医》2015年6月供稿论文;