邓小燕[1]2003年在《抗寒基因表达载体构建及遗传转化研究》文中进行了进一步梳理抗寒是许多蔬菜和大田作物需要的一个重要农艺性状。利用导入冷应答转录因子基因(CBF)来从转录水平上促进植物自身的大量冷诱导基因表达，并结合导入1～2个高效抗寒基因的策略，是当前植物抗寒遗传改良的基本方向，可能成为有效改善植物抗寒性的重要途径。 本实验从探讨冷旱应答启动子P-RD29A冷诱导活性及冷诱导转录因子CBF3在常温下和低温下超表达时对转基因植株表型及抗寒性的影响等叁个方面考虑，构建了相关抗寒基因的叁个植物表达载体。通过将携有RD29A-GUS-Tnos基因表达盒的载体pBIN~+-RD29A-GUS转化黄瓜和小番茄外植体材料，检测GUS基因的瞬间表达活性，初步探讨了冷诱导启动子P-RD29A在这两种作物中是否具有冷诱导活性的问题。将植物表达载体pBIN~+-35S-CBF3对黄瓜和小番茄进行遗传转化，建立了黄瓜高频再生和遗传转化体系，获得了一株转基因黄瓜植株，并通过了植物基因组PCR检测；获得了两个具有Kan抗性的小番茄再生绿芽。主要研究结果如下： 1 冷诱导基因RD29A启动子片段P-RD29A的克隆、序列测定及分析 根据拟南芥菜RD29A基因启动子两端序列设计两个特异引物P_1(5’-ctgcaagaatctcaaacacg-3’)和P_2(5’-tccaatagaagtaatcaaacc-3’)，采用高保真的pfu-DNA聚合酶，从拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia生态型基因组DNA中，通过PCR扩增出目的片段。纯化的目标产物经Taq DNA聚合酶加A碱基后，采用TA Clonging方法克隆到pUCm-T载体中，得到重组质粒pP-RD29A，转化大肠杆菌XL_1-Blue，挑选白色的重组子菌落进行Colony PCR筛选和质粒的酶切验证。挑选有插入P-RD29A启动子片段的重组子单菌落，委托上海博亚生物工程有限公司测序。结果表明，该目的片段为890bp，与发表的拟南芥菜P-RD29A(D13044)相应序列一致。 2 转录因子CBF3基因的克隆、序列测定和分析 根据已发表的拟南芥转录因子CBF3基因序列设计两个特异性引物P_3(5’-agcaaaccataccaacaaaaa-3’)和P_4(5’-gtactaaaaatggaaataataatctgag-3’)，采用与P-RD29A相同的方法进行克隆、序列测定和分析。获得的重组质粒命名为pCBF3，委托上海生工生物工程有限公司测序。结果表明，所克隆的目的片段为760bp，编码216个氨基酸，与发表的拟南芥菜CBF3基因(AF076155)相应序列及编码的氨基酸一致。 3 植物表达载体的构建 质粒pP-RD29A经PstI+BamHI双酶切后回收P-RD29A启动子，替换质粒pSAU2006中的CaMV 35S启动子，建成携带RD29A-GUS-Tnos基因表达盒的中间载体pRD29A-GUS。pRD29A-GUS经SmaI+Ecl136双酶切后，回收大片段，平端线型DNA自环化，构建成携带RD29A一Tnos基因片段的中间载体 pVCT20ll。质粒 pCBF3经 Bgllll 单酶切后获得的目的基因片段 CBs正确的插入到 PVCT2011经 Bwhl单酶切后的线型载体中，构建成携带有RD29A－CBF3－Tnos基因表达盒的中间载体pVCT2012。质粒pSAU2006经Bwhl＋Hjndlll双酶切后回收 C洲 355 启动子，pVCT2012经 BglIll＋HjI7dlll双酶切后回收大片段，两片段经连接构建成携有355－CBF3－Tnos基因表达盒的中间载体pVCT2014。 质粒 nBINPLUS经 Ecdil＋Hindlll双酶切后回收大片段。质粒nRD29A－GUS、nVCT2012和 pVCT2014分别经 Ecdil＋Hjndlll双酶切后回收目的基因表达盒片段 RD29A－GUS－Tnos、RD29A－CBF3－Tnos和355－CBF3－Tnos，然后分别连接至线型pBINPLUS载体上，构建成植物表达载体出I卜RD29A－GUS、pBIN二RD29A－CBF3和咄I卜355－CBF3。4 冷诱导启动子PRD29A在黄瓜和小番茄中的冷诱导表达特性” 以1天龄的黄瓜子叶和小番茄试管苗真叶为无菌外植体材料，分别经活化的农杆菌LBA4404（PBIN乙RD29AAIUS＋PAL4404）菌液浸染后，暗培养32个小时，分另经5’C＊温诱导和 25oC常温处理后组织化学染色。结果表明，冷诱导启动子P－RD29A在黄瓜和小番茄中均具有冷诱导活性，受SC的低温诱导表达，而在25oC常温下不表达。5 植物表达载体 PB N＋35S七BF3对黄瓜的遗传转化研究 以1天龄的黄瓜子叶为外植体，以MS为基本培养基，通过加入不同浓度组合的BA和NAA，筛选到了试管苗生长最适培养基（l／ZMS附加 3％蔗糖的固体培养基）和根生长最适培养基（l／ZMS附加 0．sgg／L NAA的液体培养基）。 在最适培养基上研究了黄瓜子叶外植体对卡那霉素的敏感性、预培养天数、共培养时间及感菌时间等因素的影响，建立了黄瓜高频转基因再生体系，即取1天龄的黄瓜无菌子叶在芽分化培养基MSK（MS＋ling／L BA＋ling／L ABA＋Zing／L AgN03的固体培养基）上预培养二～2天，投入到活化的农杆菌 LBA4404（PBIN”－355－CBF3＋PAL4404）菌液中浸染 10分钟，在MSK培养基上暗培养 2～4天，在附加 300mg／L Carb的MSK培养基上延迟培养一周后，转入筛选培养基（MSK＋90mg／L Kan＋200mg／L Carb）中筛选抗性愈伤和抗性芽，每两周更换一次培养基，抗性芽转入试管苗生长培养基中培养1～2周，然后转入生根培养基中诱导生根，从而获得具有Kan抗性的黄瓜转基因再生苗。共获得4株转基因再生植株。取植株叶片用CTAB法
郝凤[2]2010年在《AFP、CBF2基因表达载体的构建及其对苜蓿遗传转化的研究》文中指出低温是限制植物分布与生长的重要因素,低温伤害是一种严重的自然灾害,全球每年因此造成农作物的损失高达数千亿美元。苜蓿(Medicago sativa)为暖温带重要的牧草,对温度反应敏感。低温是制约其生长的主要限制因子,如何提高苜蓿的抗寒性对提高其生产力有重要的意义,利用现代生物学技术进行植物抗冻性分子改良具有高效性和针对性。本研究成功地从胡萝卜和拟南芥中克隆了抗冻蛋白基因AFP和抗冻基因CBF2,并分别构建了植物表达载体并将其导入农杆菌中;还针对目前农杆菌介导转化法中存在的转化率低的问题,对苜蓿的遗传转化体系进行了优化;已通过农杆菌介导转化法,将构建好的AFP、CBF2抗冻基因植物表达载体分别转化到了优良苜蓿品种中。本研究主要成果如下:1.分别以胡萝卜和拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR方法,成功地克隆了全长1200bp的抗冻蛋白基因AFP和全长700bp的抗冻基因CBF2,转化大肠杆菌DH5α,采用IPTG诱导,使宿主菌重组子表达特异的抗冻基因。2.通过双酶切,将其分别连接到PBI121工程质粒上,成功地构建了含有卡那霉素抗性选择标记的植物表达载体P-T-AFP和P-T-CBF2,并通过直接转化法将其导入农杆菌EHA105中。3.遗传转化体系的建立。以培养7天的和田苜蓿的无菌苗子叶为外植体,以农杆菌菌株为介体,预培养3天,侵染时间为10min,菌液浓度OD600=0.3,共培养3天,Kan筛选浓度定为60mg/L,脱菌过程中使用400 mg/L的羧苄青霉素。4.通过叶盘法转化紫花苜蓿,分别将抗冻基因AFP和CBF2导入苜蓿基因组中,经Kan筛选及PCR检测,初步证明抗冻基因AFP和CBF2已整合入苜蓿基因组中。
徐春波[3]2016年在《转AtCBF1基因提高紫花苜蓿抗寒性研究》文中指出紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为豆科苜蓿属多年生草本植物,是世界上最重要的牧草资源,具有极高的饲用及生态价值。近些年,随着紫花苜蓿栽培面积的不断扩大,抗寒性弱成为限制紫花苜蓿向北方地区推广的主要因素,转入抗寒基因提高紫花苜蓿抗寒性是解决该问题的高效育种方法之一。本研究从拟南芥中克隆得到冷诱导转录因子AtCBFl基因,采用农杆菌介导法转入到优良紫花苜蓿品种中,通过转化植株分子检测、抗寒性及田间鉴定形成株系,筛选出了转AtCBFl基因抗寒高产的转基因紫花苜蓿新材料。主要研究结果如下：1.研究了紫花苜蓿品种、外植体以及激素组合配比等影响组培的再生因子,结果表明,组织培养最佳基因型为猎人河苜蓿；最佳外植体为下胚轴；最佳愈伤组织诱导培养基为SH+2.0mg · L-12,4-D+0.5 mg · L11 6-BA,愈伤组织继代培养基为MSO+0.5mg · L-1 NAA+1.0mg · L-1 6-BA+1.0mg · L-1 AgNO3和MS+0.3mg·L-1TDZ分化培养基为MS+0.2mg · L-1 KT。2.克隆了拟南芥冷诱导转录因子AtCBF1基因并构建了适于紫花苜蓿农杆菌遗传转化的植物表达载体PBI121-CBF1。3.紫花苜蓿遗传转化因子研究确定出最佳农杆菌抑制剂为350mg·L-1 Carb:最佳Kan筛选浓度为60mg·L-1；最佳受体基因型为猎人河苜蓿；最佳外植体为下胚轴；最适宜农杆菌菌液浓度OD600为0.4～0.6,侵染时间10min；AS最适浓度为10mg·L-1。4.利用农杆菌介导法将AtCBF1基因转入紫花苜蓿,获得了抗Kan的转基因紫花苜蓿植株。经PCR检测,部分转化植株扩增出了大小为650bp左右特异带,初步表明目的基因AtCBF1已经整合到紫花苜蓿基因组,进一步通过RT-PCR检测,结果显示外源基因AtCBF1在部分转化植株的转录水平上表达。5.抗寒性生理研究测定了转基因苜蓿相对电导率、脯氨酸含量、可溶性糖含量及丙二醛含量,结果显示转AtCBF1基因紫花苜蓿植株较对照抗寒性有所提高,转基因株系以T9、T11和T3的抗寒性相对较高,且T9株系抗寒性最强。6.研究了转基因苜蓿人工模拟冷冻天气抗寒性,叶片受害及恢复生长结果表明转基因紫花苜蓿植株表现出较强的耐低温胁迫能力,即过量表达AtCBF1基因的转基因紫花苜蓿的抗寒性获得了提高。7.转基因紫花苜蓿形态、产量、再生速度及品质方面研究显示,转基因株系与对照相比在形态上没有明显生长延缓、植株矮小等不良变化,只是叶片长度较对照植株稍短;在产量和再生速度上,转基因各株系有的高于对照,有的低于对照,T11和T9株系在产量及再生速度上均显着高于对照和其他株系；营养成分转基因株系均表现出高于对照的粗蛋白含量,营养品质有所提高。综合研究结果,T9和T11株系为表现最优的转基因株系。
许淼[4]2008年在《枳CBF与GFP融合基因的构建及其转化烟草与枳》文中提出温度是影响植物生长和分布的重要因素。周期性寒害往往引起柑橘果实产量降低、品质下降,甚至树体死亡,从而造成巨大的经济损失。迄今为止,全球的柑橘冻害问题仍然没有得到有效解决。因此培育柑橘的抗寒品种成为柑橘业中一个急需解决的问题。随着植物分子生物学的发展,转基因已成为农作物育种新的技术,植物的抗寒性状是复杂的数量性状,是低温下多基因共同协作的结果。若采用单一的抗寒基因转化植物,虽然能一定程度上提高转基因植物的抗寒性,但实际效果并不理想。CBF是一种调控一系列植物冷驯化相关基因表达的转录因子,在低温下迅速合成,与相应顺式作用元件CRT/DRE结合,诱导冷相关基因的表达,进而合成糖类、脯氨酸和膜稳定蛋白等物质,提高植物的抗寒性。因此,利用CBF转化柑橘有望成为培育柑橘抗寒新品种的有效途径。枳由于具有抗性强、树形矮小等特点,是柑橘的常用砧木。枳也是柑橘中抗寒性最强的品种,可以耐-20℃。所以研究柑橘的抗寒基因首先研究枳的抗寒基因。为了更好地利用所分离得到的枳CBF基因来提高柑橘的抗寒性,了解其功能特征与表达模式是必要的。研究基因的表达,必须选择合适的启动子。已有研究报道了枳CBF基因及其自身启动子的序列,本研究参考此报道克隆了枳CBF,在其自身启动子的启动下与报告基因GFP构建成融合基因,并构建融合基因表达载体,在农杆菌介导下转入到烟草及枳中,观察枳CBF的时空表达模式。主要试验结果如下:①构建融合基因CG。以枳DNA为模板,将枳CBF及其自身启动子作为一个完整的序列克隆出来,扩增产物5′端引入EcoRI酶切位点,3′端引入SalⅠ酶切位点。以PMV质粒为模板,扩增GFP,在5′端引入SalⅠ酶切位点,在3′端增加BstpⅠ酶切位点。将扩增的CBF与GFP序列分别用SalⅠ进行单酶切、连接。在此过程中注意融合基因移码问题,扩增产物经测序验证为目的融合基因,命名为CG。全长为2.4 kb,是一个由枳CBF基因自身启动子、枳CBF与GFP构成的融合基因。②构建融合基因表达载体CG2301。以表达载体pCAMBIA2301为基础载体,用EcoRⅠ、Bstp分别双酶切pCAMBIA2301与融合基因CG后,T4 ligase连接,构建成融合基因表达载体CG2301。此载体含枳CBF与GFP的融合基因CG,并由枳CBF自身启动子启动表达,为Kan抗性。③融合基因表达载体CG2301在农杆菌介导下采用叶盘法转化烟草,获得了43棵生根的抗性苗,经PCR鉴定,获得13株转基因烟草。④融合基因表达载体CG2301在农杆菌介导下采用上胚轴转化枳,取其中的14株抗性芽进行PCR鉴定,获得2株转基因枳。⑤研究融合基因CG在烟草中的表达模式。将转基因烟草在4℃与-5℃温度处理不同的时间后,通过荧光显微镜观察基因在不同的器官中的表达情况。结果表明,荧光首先在根系表达(在4℃下2h、-5℃下15min即可检测到),其次是在叶片(4℃下12h、-5℃下15min有少量荧光),茎中的表达最晚(4℃下48h、-5℃下30min有少量荧光)。在叶片中荧光首先出现在叶脉处,随着处理时间的增加,表达量也在增加,若叶片出现伤口,则伤口周围会检测到大量的荧光。在根和茎中同样随着低温处理时间的增加荧光量不断加强。
王媛花[5]2008年在《农杆菌介导水稻RdreB1BI基因转化草莓的研究》文中进行了进一步梳理草莓(Fragaria ananassa Duch)属于蔷薇科草莓属多年生草本植物,是一种重要的经济浆果,在世界范围内广泛种植。然而草莓安全越冬和耐寒品种的缺乏成为生产上的突出问题。生物技术的飞速发展为解决这一问题提供了新的途径。水稻转录因子RdreB1BI是一个调控植物发育且与植物胁迫抗性相关的转录因子。已有研究证明将RdreB1BI基因转化拟南芥,拟南芥植株的抗早性和耐寒性有很大提高。到目前为止还未见有RdreB1BI基因转化草莓的研究。因此本试验目的是用根癌农杆菌介导的转化方法将水稻RdreB1BI基因导入草莓细胞,获得抗寒的转基因植株。主要研究结果有以下几点:1.以草莓‘丰香'、‘雪蜜'、‘鬼怒甘'的叶片和叶柄为外植体,建立了高效离体再生体系。‘丰香'叶片和叶柄的最佳不定芽再生培养基为:MS+TDZ(2.0mg/L)+IBA(0.2mg/L)+2,4-D(0.1mg/L)和MS+B5+TDZ(2.0mg/L)+IBA(0.2mg/L)+2,4-D(0.1mg/L)。‘雪蜜'叶片和叶柄的最佳不定芽再生培养基为:MS+TDZ(1.5mg/L)+IBA(0.2mg/L)和MS+B5+TDZ(2.0mg/L)+IBA(0.2mg/L)。‘鬼怒甘'叶片和叶柄的最佳不定芽再生培养基为:MS+BA(2.0mg/L)+IBA(0.1mg/L)和MS+BA(2.0mg/L)+IBA(0.1mg/L);‘丰香'、‘雪蜜'暗培养时间为14天,‘鬼怒甘'暗培养时间为7天;‘丰香'、‘鬼怒甘'叶片不定芽再生的最佳叶龄为10-30天,‘雪蜜'叶片不定芽再生的最佳叶龄为20天以下。叁个草莓品种叶柄不定芽再生的最佳叶龄都是20天以下;叶片放置方式对叁个草莓品种的叶片不定芽再生没有影响,叶柄刻伤向上放置有利于叁个草莓品种叶柄不定芽再生。2.克隆了rd29A启动子,通过对比分析,与已公布的序列有98.72%的同源性,主要调控区域也一致。构建了两个植物表达载体pYH4215-rd29A和pYF7713-Rdre。3.通过研究影响遗传转化的因素,建立了农杆菌介导的‘雪蜜'草莓遗传转化体系:菌液浓度为OD600=0.4;侵染时间为9min;选用200mg/L的Cb作为抑菌抗生素,20mg/L的Kan作为筛选抗生素;共培养时间3天;共培养培养基:MS+TDZ(2.0mg/L)+IBA(0.2 mg/L);筛选培养基:MS+TDZ(2.0mg/L)+IBA(0.2mg/L)+Kan(20mg/L)+Cb(200mg/L);伸长培养基:MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+Kan(20mg/L)+Cb(200mg/L);生根培养基:MS+IBA(0.1mg/L)+Kan(20mg/L)+Cb(200mg/L)。4.获得了Kan抗性的含有RdreB1BI基因的草莓转基因株系15株,PCR以及RT-PCR检测证明,有4个株系外源基因已经成功的导入和整合到草莓基因组中。脯氨酸含量的测定和低温处理表明,转基因的植株较非转基因植株抗寒性有所提高。
林士杰[6]2007年在《柽柳冷适应蛋白（CAP）基因的功能验证》文中研究表明本研究将从极度抗旱、耐盐、抗寒木本植物柽柳(Tamarix androssowii)中克隆得到的冷适应蛋白(cold acclimation protein，cap)基因，构建到酵母表达载体pYES2和植物表达载体pROKⅡ中，进一步在真核细胞中验证cap基因的功能。主要实验结果如下：(1)将cap基因与酵母表达载体pYES2连接，获得了pYES2-cap重组质粒。将pYES2-cap转化酵母菌INVSc1。随机挑选10个INVSc1(pYES2-cap)单菌落，经PCR检测证明cap基因已构建到pYES2载体上。对1NVSc1(pYES2-cap)和INVSc1(pYES2)菌株进行诱导，研究外源基因在酵母中的的表达情况。Northern杂交结果表明，cap基因已经在重组酵母INVSc1(pYES2-cap)中表达。(2)重组酵母INVSc1(pYES2-cap)的NaCl、Na_2CO_3、NaHCO_3、干旱、紫外线等胁迫，实验表明，INVSc1(pYES2-cap)酵母的抗逆性明显高于对照INVSc1(pYES2)菌株，说明在酵母受到逆境胁迫时，cap基因表达的冷适应蛋白对酵母细胞起到了保护作用，同时也证实了柽柳的cap基因具有提高真核生物抗逆性的功能。(3)对山新杨进行遗传转化，获得卡那霉素抗性芽，从中随机选出8个株系，进行PCR和Southern斑点杂交，证明cap基因已整合到山新杨基因组中；进一步对8个株系进行RT-PCR和Northern杂交检测，结果表明外源基因能够在转录水平上表达。(4)分别对7个转基因山新杨移栽苗进行了低温胁迫试验，测定并分析了胁迫后叶绿素含量、相对电导率、丙二醛(MDA)含量，结果显示，随着低温胁迫时间的加剧，非转基因山新杨叶绿素含量明显下降，胁迫1d后转基因山新杨叶绿素含量平均高于对照20.49％；在冷胁迫下，转基因山新杨相对电导率平均值低于对照山新杨的33.88％；对照山新杨MDA含量为34.18μmoL.g~(-1)，而转基因山新杨MDA含量大多在18.86～33.14μmoL.g~(-1)左右，低于对照山新杨，上述指标均说明cap基因的导入提高了山新杨的抗低温能力。(5)分别对8个转基因株系进行了NaCl胁迫，分析逆境胁迫条件下转基因山新杨与非转基因对照山新杨的丙二醛(MDA)含量、相对电导率等指标的变化。结果表明，NaCl胁迫处理后，各株系的相对电导率、MDA含量都逐渐增大，各转基因株系相对电导率平均值低于对照山新杨的15.34％，MDA平均含量低于对照的23.21％，综上说明，盐胁迫条件下，转基因山新杨受害程度明显小于对照。重组酵母的胁迫实验及转基因山新杨的低温、耐盐实验说明，cap基因的表达能够提高真核酵母细胞的抗逆性；cap基因的组成型表达能够不同程度提高转基因山新杨逆境胁迫下的耐受能力，证实cap基因具有提高植物抗低温、耐盐的功能。
刘慧春[7]2012年在《红掌‘阿拉巴马’低温相关基因AOX、CAT和APX的表达分析、功能验证及遗传转化体系的构建》文中指出红掌(Anthurium andraeanum)是天南星科花烛属高档室内观赏盆花,属佛焰花序类植物。红掌由于花型奇特、颜色鲜艳多彩而深受人们喜爱,是居家装饰和馈赠亲友的最好选择,在盆花市场特别是年宵花市场上占了很大比例,因此在浙江省的种植面积正在迅速扩增。而且随着人们生活水平的不断提高,消费理念的转变,对高档盆花的需求越来越大,市场还有着巨大潜力。然而由于红掌原产热带,对温度较为敏感,生长温度要求15℃以上,低于12℃容易产生冷害,低温是限制红掌生长发育的重要逆境因子。在我省种植存在高能耗、高成本的问题,降低了市场竞争力,影响了红掌盆花产业的持续、健康的发展。要解决这个问题的最根本途径就是采用育种手段从根本上提高红掌的抗寒性,对于我省的花卉产业的做大做强则显得十分必要和紧迫。本研究采用PCR结合RACE技术,以红掌‘阿拉巴马’为材料,从其叶片中克隆得到交替氧化酶AOX,过氧化氢酶CAT和抗坏血酸过氧化物酶APX3个基因全长,并对其进行生物信息学分析；运用实时定量PCR技术分析各基因在红掌不同组织器官和不同低温胁迫下的表达情况：构建了红掌抗坏血酸过氧化物酶基因的植物表达载体,并转化烟草进行功能验证；最后,将脂肪酸去饱和酶基因转化红掌并获得了抗性植株。取得的研究结果如下：1、红掌交替氧化酶基因AnAOX全长基因的克隆与序列分析从红掌叶片中克隆与低温胁迫相关的基因AOX,其全长序列为1170bp,命名为AnAOX (GenBank登录号：JX163297),该基因含有1038bp的开放阅读框,编码345个氨基酸,AnAOX编码蛋白预测的等电点(pI)为8.51,分子量大小约为38.0kD。利用DNAMAN5.2.2软件,分析AnAOX基因编码的氨基酸序列,认为该基因具有完整的3’和5’末端,是花烛属红掌交替氧化酶基因的全长序列。红掌AOX推测的氨基酸序列与马铃薯(Solanum tuberosum)、水芭蕉(Lysichiton camtschatcensis)、羽叶蔓绿绒(Philodendron bipinnatifidum)和肾叶臭菘(Symplocarpus renifolius)的AOX的同源性分别为82%、80%、78%和77%。所有的序列中都存在完全保守的铁离子结合区域和组氨酸残基,它们可能与AOX基因在植物中的功能密切相关。2、红掌过氧化氢酶基因AnCAT基因的克隆与序列分析以红掌‘阿拉巴马’品种叶片提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个1704bp的过氧化氢酶(Catalase, CAT)基因的cDNA序列,其基因编码区共1476bp,编码492个氨基酸,命名为AnCAT(GenBank登录号：JX163298)。AnCAT编码蛋白预测的等电点(pI)为6.89,相对分子量约为57.1kD。红掌CAT推测的氨基酸序列与与马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、油棕(Elaeis guineensis)、小果野蕉(Musa acuminata)和籼稻(Oryza sativa Indica)的CAT的同源性分别为91%、87%、87%和81%。3、红掌抗坏血酸过氧化物酶基因AnAPX基因的克隆与序列分析以天南星利花烛属红掌‘阿拉巴马’品种叶片提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个888bp的抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)基因的cDNA序列,其基因编码区共750bp,编码250个氨基酸,命名为AnAPX(GenBank登录号：JQ8385071)。根据Protparam在线软件预测红掌抗坏血酸过氧化物酶蛋白的理化性质,结果表明推测APX蛋白的分子式为C1232H1904N330O363S7,相对分子量约为27.4kD,等电点(pI)为5.40；理论推导半衰期约30h,不稳定参数为32.55,属于稳定蛋白。红掌APX推测的氨基酸序列与马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、华东葡萄(Vitis pseucdoreticulata)、棉花(Gossypium hirsutum)、油棕(Elaeis guineensis)和玉米(Zea mays)的APX的同源性分别为93%、87%、87%和86%。4、红掌inAOX、AnCAT和AnAPX基因的表达分析通过定量PCR研究上述叁个基因在转录水平上表达与红掌叶片低温胁迫之间的关系发现,6℃处理后,,红掌叶片AnAOX, AnCAT和AnAPX基因均上调表达。其中AnAOX基因在低温处理12h后上调表达不明显,处理24h后开始明显上调表达,且处理24h表达量显着高于12h；低温处理超出24h后,表达量略有下降,36～48h之间表达量没有明显差异。AnCAI基因在低温处理12h后表达明显上调,超过12h表达量开始下降,当低温处理时间达到48h时,表达量与对照接近甚至略低于对照；AnAPX基因在低温处理12h明显上调表达,且随着低温处理时间的延长,上调表达逐渐上升,当处理48h后上调表达达到顶峰。由此推测,红掌AnAPX基因表达量的变化与低温及低温持续时间关系最密切,其次是AnAOX基因、AnCAT基因。5、红掌AnAPX植物表达载体的构建根据AnAPX基因全长序列设计特异引物,以红掌‘阿拉巴马’叶片为试材,得到AnAPX基因完整的开放阅读框。将扩增到的片段与pMD18-T载体连接并进行序列测定,表明插入片段正确、克降片段经双酶切消化插入到植物表达载体pCAMBIA2300中,构建了AnAPX基因的表达载体。在成功构建AnAPX表达载体后,采用电击法将重组质粒转化到根癌农杆菌菌株中,为后续AnAPX功能验证莫定了基础。6、汀掌基因转化采用根癌农杆菌介导法,以红掌愈伤组织为侵染材料,将绿色荧光蛋白基因GFP和脂肪酸去饱和酶基因FAD3转化红掌,通过G418和卡那霉素筛选,获得了转基因红掌植株。用PCR反应对具卡那霉素抗性的转基因红掌植株进一步鉴定,结果表明目的基因FAD3已经整合到部分转基因植株的基因组中,成功地获得了转FAD3基因的红掌植株。
吴晨炜[8]2009年在《抗寒基因AtCBF的克隆及在百子莲与狗牙根中的遗传转化研究》文中提出本试验以野生型拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR反应分别克隆了AtCBF1和AtCBF3的全长基因,然后分别将其插入克隆载体pMD18-T中,并分别转入大肠杆菌DH5α菌株中保存。经测序检测后,两个目的基因分别被插入到植物表达载体pCAMBIA 1304中位于CaMV 35S启动子和Nos终止子间的Nco I和Bgl II酶切位点间,分别构建AtCBF1和AtCBF3的植物表达载体,然后分别将两个表达载体转入农杆菌EHA105中。为了建立狗牙根高效的愈伤诱导体系,我们采用L16(43)的均匀正交设计,对NAA、6-BA和2,4-D叁种生长调节剂的浓度进行了优化。通过极差分析和方差分析,同时结合他人的实验数据,确定了狗牙根愈伤组织诱导的最优培养基为:2,4-D 2.0mg/L+BA0.1 mg/L+NAA 2mg/L。愈伤组织在愈伤诱导培养基上继代培养2周后可形成致密的淡黄色愈伤组织,转入不定芽分化培养基(MS培养基+ 3mg/L 6-BA+4mg/L KT),进行光培养,可分化出绿色的不定芽,诱导率为100%。不定芽在生根培养基(MS培养基+0.3mg/L NAA)诱导不定根,诱导率可达100%。百子莲的体细胞再生体系由试验室的另一位同学建立。为了确定转化试验中潮霉素的筛选浓度,我们设计了百子莲抗生素敏感性试验。在百子莲的分化培养基和生根培养基中分别添加不同浓度的潮霉素(0,5mg/L,10mg/L,15mg/L,20mg/L和25mg/L)。根据百子莲的胚性愈伤组织和不定芽在这些培养基中的生长状况,分别统计了死亡率和生根率,从而最后确定了百子莲愈伤分化和幼苗生根的潮霉素筛选浓度分别为20 mg/L和15 mg/L。狗牙根的筛选浓度根据文献确定为5 mg/L。利用农杆菌介导法转化百子莲和狗牙根的胚性愈伤组织,在不含抗生素的愈伤继代培养基中暗培养5至7天后,分别转入含有20mg/L和5mg/L潮霉素的分化培养基上进行筛选。待分化出不定芽后,将其分别转入含有15mg/L和5mg/L潮霉素的生根培养基上进行筛选。
张晗[9]2008年在《棉花CBF调控因子在逆境条件下的表达调控及沙冬青CBF基因的克隆》文中提出低温和干旱是严重影响植物生长和作物产量的环境限制因子,农业生产上每年都发生因为低温干旱导致的大面积减产。作物的抗寒性状是由多基因控制的,只有成簇抗性相关基因的转录激活,才能有效提高作物的抗寒能力。CBF(C-repeat binding factors)转录因子可以同时调控多个逆境诱导基因的表达,通过促使多个功能基因发挥作用,广泛地参与耐逆的生理生化过程,从而提高植物耐逆性。因此CBF转录因子在逆境胁迫应答机制中处于中心地位。在模式植物拟南芥中,CBF转录因子通过与CRT/DRE元件结合,激活COR基因(Cold-regulated genes)表达,促进逆境胁迫相关基因转录,从而增强植物体的耐逆性。CBF基因在高等植物中广泛存在,不同植物中CBF基因的表达模式各不相同。我国是产棉大国,低温寒害在我国北方棉区特别是新疆棉区的危害十分严重。前期低温可导致播种期推迟;后期低温会影响纤维品质。低温和干旱是棉花生产品质和产量的制约因素,十分有必要开展针对棉花CBF及其耐逆性研究。沙冬青是我国荒漠地区独有的常绿灌木,具有极强的耐寒和耐旱能力,是进行植物耐逆性研究和耐逆植物基因工程的理想材料。本研究用实验室已克隆的源于海岛棉7124的GbCBF1基因为研究对象,对它在棉花中的表达谱研究表明,该基因受寒冷、干旱、盐和ABA诱导表达。将GbCBF1基因分别构建到CaMV35S强启动子和NOS弱启动子驱动的植物表达载体,以叶盘法转化烟草,对转基因烟草中GbCBF1检测表明,GbCBF1基因在烟草中能够表达。对转基因烟草的生理指标进行了研究,与野生型烟草相比,在冷处理后转基因烟草叶片的电解质渗漏率明显降低,脯氨酸含量、可溶性糖含量都有明显提高,证明耐寒性增强。同时耐旱性实验表明转基因烟草的干旱耐受能力也有很大提高。这表明在烟草中GbCBF1能够响应逆境信号并发挥作用。采用RACE策略,我们克隆并鉴定了一个沙冬青CBF全长基因(AmCBF),半定量RT-PCR实验证明该基因受低温诱导,在冷处理1h开始有表达,2h后表达量达最高。经过生物信息学分析,AmCBF基因编码蛋白具有AP2结构域和CBF家族中保守特征多肽序列,属于AP2/EREBP类转录因子家族中的CBF家族。根据蛋白比对和蛋白二级和叁级结构预测结果,AmCBF与GbCBF1在AP2结构域存在个别氨基酸位点的差异,推测可能会影响CBF转录因子与DNA的结合能力。进一步的功能鉴定正在进行中。
刘德春[10]2010年在《枳PtrICE1、PtrHOS1和PtrLOS2基因克隆及PtrICE1遗传转化研究》文中研究指明柑橘的周期性冻害在世界范围内时有发生,造成了巨大的经济损失。采用转基因技术将抗寒基因导入柑橘栽培品种中表达是缩短育种周期,快速获得柑橘抗寒品种的有效途径之一。但是目前有关柑橘抗寒基因克隆的研究很少,这种情况严重限制了柑橘抗寒分子育种的进展。本研究从柑橘的抗寒近缘种枳(Poncirus trifoliata (L.) Raf.)中克隆出了柑橘冷响应基因表达调控途径中的3个关键基因PtrICE1、PtrHOS1和PtrLOS2,同时对它们进行了详细的生物信息学分析,研究了它们在不同环境胁迫下在枳中的时空表达模式。通过转基因技术鉴定了其中一个编码上游转录因子的基因PtrICE1的功能,证明了在模式植物烟草中超量表达PtrICE1能够提高转基因烟草的抗寒性。然后克隆出了PtrICE1的上游启动子序列,并且通过转基因技术初步证明该启动子具有一定的冷响应和机械损伤响应活性。本研究为最终通过转基因技术获得抗寒性强的柑橘栽培品种提供了新的基因资源和理论基础。本研究获得的主要结果如下：1.从枳中克隆出了一个bHLH (basic Helix-Loop-Helix)家族基因PtrICE1,该基因长1933 bp,包含一个1464 bp的开放阅读框(ORF),编码487个氨基酸,蛋白质分子量为53.6 kDa,等电点为5.30。PtrICE1蛋白与其它植物ICE1家族蛋白的氨基酸序列一致性很高,并且具有保守的SUMO (small ubiquitin-related modifier)结合结构域、bHLH结构域和C-末端区域。系统进化树的分析结果表明,植物ICE1家族蛋白可分为双子叶植物类和单子叶植物类两大类,PtrICE1属于双子叶植物类。2.在正常的生长条件下,PtrICE1在枳根、茎、叶中都有一定程度的表达。冷处理之后,枳叶和茎中PtrICE1表达先上调后下调,在根中表达先下调后上调。ABA处理之后,枳叶、茎、根中PtrICE1表达都是先上调后下调。这些结果说明冷处理和ABA处理都能影响枳不同器官中PtrICE1的表达。3.构建了PtrICE1的超量表达载体pMVICE1,并通过根癌农杆菌介导的叶盘法将pMVICE1导入模式植物烟草中,使PtrICE1在烟草中超量表达。通过PCR检测获得了17个阳性T0代转基因烟草植株。T0代转基因烟草的生长速度比野生型烟草慢,开花时间比野生型烟草推迟10d左右,开花以后两者的表型差异不大。4.T0代转基因烟草果实成熟后收集种子,经Km抗性筛选后获得阳性T1代转基因烟草。通过比较T1代转基因和野生型烟草在冷处理后的相对电导率、成活率以及表型后发现,与野生型烟草相比,T1代转基因烟草的相对电导率更低,成活率更高,并且常温处理之后能够恢复生长,说明转基因烟草的抗寒性比野生型更强,因此我们认为在植物中超量表达PtrICE1能够提高植物的抗寒性。5.本研究克隆出了PtrICE1基因的DNA序列。通过比较PtrICE1编码区的DNA和cDNA序列发现,PtrICE1含有四个外显子和叁个内含子。采用pMD18-T载体介导的接头PCR方法克隆了PtrICE1基因的上游启动子序列,并采用PLACE程序对PtrICE1启动子上可能存在的顺式作用元件进行了分析,结果找到一些与植物抗逆性相关的顺式作用元件,其中包括冷响应元件(CRT/DRE、MYC)、光响应元件(GT1、GATA)、脱水和ABA响应元件(ABRE、MYB)和各种激素响应元件(ARF、ASF、GARE、WBOX等)。6.本研究构建了能够检测PtrICE1启动子活性的表达载体pBIPROICE1:GUS.通过根癌农杆菌介导的叶盘法将pBIPROICE1:GUS导入模式植物烟草中,并通过PCR检测获得了阳性的To代转基因烟草。To代转基因烟草叶片的GUS组织化学染色结果表明,野生型烟草叶片未出现蓝色斑点,而未经冷处理时转基因烟草叶片表面只出现了少量的蓝色斑点,但在叶片切口处染色较深。4℃冷处理之后,转基因烟草叶片上蓝色斑点的数量增加,且在叶片伤口处染色较深,说明PtrICE1启动子具有冷响应和机械损伤响应活性。7.从枳中克隆出了PtrHOS1基因,该基因长3434 bp,包含一个2922 bp的开放阅读框,编码974个氨基酸,蛋白质分子量为110.2 kDa,等电点为5.55。PtrHOS1蛋白与其它植物HOS1类似蛋白的氨基酸序列一致性很高,并且在PtrHOS1蛋白的N末端含有一个高度保守的环指结构域(RING finger domain)。植物HOS1类似蛋白可分为双子叶植物类和单子叶植物类两大类,PtrHOS1属于双子叶植物类。在正常的生长条件下,PtrHOS1在枳根、茎、叶中表达强烈,冷处理和ABA处理之后,在枳的根、茎、叶中PtrHOS1的表达都出现了暂时的下调,说明在枳的根、茎、叶中PtrHOS1的表达都受冷处理和ABA处理的下调调控。8.从枳中克隆出了PtrLOS2基因,该基因长1662 bp,包含一个1338 bp的开放阅读框,编码445个氨基酸,蛋白质分子量为47.79 kDa,等电点为5.54。PtrLOS2蛋白与拟南芥LOS2蛋白及其它植物烯醇酶的氨基酸序列一致性很高(超过86%),说明PtrLOS2很可能编码一种烯醇酶。PtrLOS2含有两个高度保守的结构域,它们分别是DNA结合结构域和转录抑制结构域。在正常的生长条件下,PtrLOS2在枳根、茎、叶中都有表达,枳根和茎中PtrLOS2的表达量要高于叶中。从总体上来说,经过冷处理后,枳叶片和茎中PtrLOS2的表达是先上调后下调,而在根中PtrLOS2的表达是下调的。ABA处理之后,枳叶片中PtrLOS2的表达总体上是上调的,而在茎和根中PtrLOS2的表达是先下调后再上调。这些结果说明冷处理和ABA处理都能影响枳不同器官中PtrLOS2的表达。
参考文献：
[1]. 抗寒基因表达载体构建及遗传转化研究[D]. 邓小燕. 西南农业大学. 2003
[2]. AFP、CBF2基因表达载体的构建及其对苜蓿遗传转化的研究[D]. 郝凤. 甘肃农业大学. 2010
[3]. 转AtCBF1基因提高紫花苜蓿抗寒性研究[D]. 徐春波. 内蒙古农业大学. 2016
[4]. 枳CBF与GFP融合基因的构建及其转化烟草与枳[D]. 许淼. 华中农业大学. 2008
[5]. 农杆菌介导水稻RdreB1BI基因转化草莓的研究[D]. 王媛花. 南京农业大学. 2008
[6]. 柽柳冷适应蛋白（CAP）基因的功能验证[D]. 林士杰. 东北林业大学. 2007
[7]. 红掌‘阿拉巴马’低温相关基因AOX、CAT和APX的表达分析、功能验证及遗传转化体系的构建[D]. 刘慧春. 浙江大学. 2012
[8]. 抗寒基因AtCBF的克隆及在百子莲与狗牙根中的遗传转化研究[D]. 吴晨炜. 上海交通大学. 2009
[9]. 棉花CBF调控因子在逆境条件下的表达调控及沙冬青CBF基因的克隆[D]. 张晗. 中国农业科学院. 2008
[10]. 枳PtrICE1、PtrHOS1和PtrLOS2基因克隆及PtrICE1遗传转化研究[D]. 刘德春. 华中农业大学. 2010
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