河北中医学院 河北石家庄 050200
【摘要】目的：观察消痰化瘀中药对NAFLD大鼠脂质代谢和肝脏LXRα和CYP7A1mRNA表达的的影响，探讨其治疗NAFLD的作用机制。方法：将60只雄性SD大鼠随机分正常组、模型组、东宝肝泰对照组以及消痰化瘀中药高、中、低剂量组，一边造模一边灌胃给予相应药物，用药8周后，检测各组大鼠血清TC、TG、HDL、LDL、FFA和肝组织中TC、TG的含量改变，并观察肝组织LXR和CYP7A1mRNA表达变化以及肝组织形态学的变化。结果：消瘀化痰中药能降低模型大鼠TC、TG、FFA、ALT、AST的含量或活性，促使LXRα和CYP7A1mRNA的表达上调，改善肝组织的病变程度。结论：消痰化瘀中药治疗NAFLD的作用机制可能与增强LXRα和CYP7A1mRNA的表达，促进脂质转运和胆固醇代谢、排泄有关。
【关键词】 消瘀化痰中药 非酒精性脂肪肝 肝X受体 胆固醇7α羟化酶
研究表明，肝X受体（LXRs）对胆固醇的吸收、输出、转运和分泌等诸多过程具有调控作用，LXRs信号通路在NAFLD的发生和发展中具有重要的作用，并有望成为治疗NAFLD的重要靶点[1]。CYP7A1所诱导的胆汁酸代谢途径是胆固醇的主要代谢途径[2]。前期临床研究表明，消痰化瘀中药具有良好的调节血脂和治疗NAFLD作用[3]。为了进一步探讨其作用机制，本研究采用高脂饮食复制NAFLD大鼠模型，观察了消痰化瘀中药对模型大鼠LXRα和CYP7A1表达的影响。
1.实验材料
1.1实验动物 SD大鼠60只，雄性，清洁级，体重180±20g，购于河北省实验动物中心，合格证号：1403039。
1.2实验用药 消痰化瘀中药由制半夏、丹参、泽泻、海藻、郁金、柴胡、决明子、生大黄、生黄芪、炒白术等组成，购自石家庄乐仁堂医药股份有限公司，经鉴定均符合2010年版《中华人民共和国药典》标准，水煎浓缩成所需浓度。东宝肝泰片：通化东宝药业股份有限公司出品，批号为H22024764，用羧甲基纤维素钠配制成符合要求的混悬液。
1.3实验试剂 甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、游离脂肪酸（FFA）试剂盒均购于北京中生生物工程高技术公司提供，一抗ERK1兔抗IgG多克隆抗体，二抗山羊抗兔（武汉博士德生物技术有限公司）；SP9001试剂盒及DAB显色剂（北京中山生物技术有限公司）；Trizol（Invitrogen公司）、DEPC（Sigma公司）、RT Reagents、PCR Reagents、DNA Marker（TaKaRa公司）。
1.4 主要仪器 Humalyzer2000半自动生化分析仪、高速冷冻离心机、VANOX AHB-LB型OLYMPUS万能显微镜、PE9600型PCR扩增仪、Motic6.0数码医学图象分析系统、凝胶图象分析系统（法国VL公司BIO-PROFIF）等。
2 实验方法
2.1 动物分组与模型制备 大鼠60只，随机分6组，每组10只，分别是正常组、模型组、阳性药（东宝肝泰）对照组和消痰化瘀中药高剂量组、中剂量组、低剂量组。正常组予以普通饲料喂养，其余各组均参照相关文献[4]喂饲高脂饲料（胆固醇、猪油、猪胆酸钠、甲基硫氧嘧啶、普通饲料的比例分别为1.5％、10％、0.5％、0.2%、87.8％）造模。
2.2 给药方法 自大鼠喂饲高脂饲料的同时即给予相应的药物灌胃，对照组东宝肝泰和消痰化瘀中药高、中、低剂量组的给药剂量标准分别为：0.9g/kg、43.34g/kg、32.50g/kg、21.67g/kg，正常组、模型组均灌服和治疗组同容量的蒸馏水，每天灌胃给药一次，每次灌胃用药的体积各组之间均为1ml/100g，共用药8周。
2.3 标本采集 实验最后一天给药后所有禁食12小时后，药物麻醉，股动脉采血，离心机分离血清；取血后迅速剖取肝脏，分别取少许肝组织置于冷冻管液氮保存和冰箱内冷冻保存；同时切取适宜大小的肝和小肠组织，用4％多聚甲醛溶液固定。
2.4 检测方法
2.4.1血脂和肝内脂质测定 血清TG、TC、HDL、LDL和FFA的含量以比色法用半自动生化分析仪测定；称取冷冻的肝组织，制成10%的匀浆，吸取上清液，用722型光栅分光光度计检测TC和TG的含量。
2.4.2 肝组织形态学观察 将用4%多聚甲醛固定的肝组织，常规脱水处理后石蜡包埋，切片，HE方法染色，显微镜下观察肝组织形态变化。
2.4.3 RT-PCR法测定大鼠肝脏LXR和CYP7A1mRNA的表达 细胞总RNA提取采用Trizol一步法。引物序列由primer 5.0软件设计。GAPDH：上游引物 5'- TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG-3 '；下游引物 5'-GGAACCGCTCATTGCCGAT AGT-3 ' 扩增片段为576bp。LXRα:上游引物 5'- ACAACCCTGGGAGTGAGAG -3'；下游引物 5'-TAGCATCCGTGGGAACAT-3' ,扩增片段为308bp。CYP7A1：上游引物 5'- CAGCCGAGTCCCTTAGCA-3' 下游引物 5'- CCATCACCGCACAAGAATA -3' 扩增片段为331bp。应用RT-PCR方法检测，实验重复3次，以GAPDH作为内对照，计算相对含量。
2.5统计方法 实验结果采用均数±标准差（±S）表示，运用SPSS17.0软件处理有关数据，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验。
3.结果
3.1 消痰化瘀中药对NAFLD大鼠血清TG、TC、HDL、LDL与FFA含量的影响 模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C和FFA的含量高于正常组(P＜0.01)，而HDL-C的含量则低于正常组（P＜0.01）。各用药组大鼠血清TC、TG、LDL-C和FFA的含量均低于模型组（P＜0.01），HDL-C的含量高于模型组(P <0.01)；其中消痰化瘀中药高、中、低剂量组TC、TG、LDL-C和FFA的含量均低于阳性药对照组(P<0.05或P<0.01)。结果详见表1、表2。
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3.2 消痰化瘀中药对NAFLD大鼠肝组织TC、TG含量的影响 模型组大鼠肝组织TC、TG的含量高于正常组(P＜0.01)；各用药组大鼠肝组织TC、TG的含量均低于模型组（P＜0.01），其中，消痰化瘀中药高、中、低三个剂量组肝组织TC、TG的含量均低于阳性药对照组（P<0.05或P<0.01)。结果详见表2。
3.3 消痰化瘀中药对NAFLD大鼠肝组织形态学的影响 正常组大鼠肝小叶和肝血窦结构清晰，肝细胞排列整齐，围绕中央静脉呈放射状，细胞核形态正常，胞浆均匀。模型组大鼠肝细胞排列可见明显的紊乱，大多呈现气球样的改变，胞浆比较疏松，多数肝细胞的胞浆内可见大小不一、数目较多的脂滴空泡，呈现出明显的肝脏脂肪变性。各用药组大鼠肝细胞的气球改样变明显的减轻，脂滴空泡相应也明显减少，肝小叶和肝血窦结构比较清晰，肝脂变的程度较用药前均有明显的改善。
3.4 消痰化瘀中药对NAFLD大鼠肝脏LXRα和CYP7A1mRNA表达的影响 与正常组相比，模型组大鼠肝脏LXRαmRNA的表达明显升高(P<0.01)；各治疗组肝脏LXRαmRNA的表达水平均明显降低 (P <0.01)。结果详见表3。
4 讨论
NAFLD 是一种隐匿性肝病，已成为发达国家第一大肝病，但导致肝脏脂肪变性的确切机制尚不清楚，目前认为脂质代谢异常、胰岛素抵抗、氧应激及脂质过氧化、免疫反应损害等因素均可能参与 NAFLD 的发病。现在比较接受的是Day[5]提出的二次打击学说，初次打击主要是脂质代谢紊乱及胰岛素抵抗，导致肝细胞脂肪蓄积，引起单纯性脂肪肝；二次打击主要是氧化应激及炎症因子的浸润，从而引起脂肪性肝炎和肝纤维化。 由此可见脂质代谢异常是 NAFLD 发病机制中最关键也是最基础的环节之一。
LXRs是氧化性固醇激活的核受体超家族成员，LXRα是LXRs的亚型，LXRα被称为胆固醇的感受器，与机体脂质代谢密切相关，在肝脏高表达。CYP7A1是LXRs的靶基因之一。
CYP7A1是胆固醇转化为胆汁酸过程的重要限速酶[6]，体内近50%的胆固醇通过CYP7A1的催化转化为胆汁酸排出体外，CYP7A1的表达可以反映出胆固醇被清除的能力[2]。当胆固醇及其代谢物在细胞中累积，LXRα被配体激活，可诱导CYP7A1基因的表达，从而促进胆汁酸的合成[7]，加速胆固醇的排泄。
消痰化瘀中药为笔者经过临床反复筛选组成的治疗NAFLD有效方药，选用制泽泻、半夏利水除湿、消散痰浊；丹参、郁金活血通络；生大黄泻腑导滞，降浊祛脂；生山楂活血祛瘀，降脂；柴胡、决明子疏利肝胆，并能降脂；黄芪、炒白术益气健脾，以助痰浊瘀血的运除。诸药配用，具有消痰祛浊，活血化瘀之功。上述药物作用于高脂饮食诱导的NAFLD大鼠后发现，消痰化瘀中药能够显著降低血清TG、TC、HDL、LDL、FFA和和肝组织TC、TG的含量；减轻肝脏脂肪变性的程度；促进肝组织LXRα和CYP7A1mRNA的表达。研究结果提示，消痰化瘀中药对NAFLD的治疗作用可能是通过对LXRα/ CYP7A1这一通路的调控来改善脂代谢紊乱而实现的。
参考文献
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2.查火龙,孙泽群,李彩丽,等.化石利胆汤对胆总管结石ERCP术后患者CYP7A1和B-UGT的影响.中医药导报,2015,21(7):56-59
3.刘连臣，徐晶，梁晓莉，等.消痰化瘀法治疗痰瘀互结型高脂血症52例临床观察[J].河北中医药学报，2013,28（3）：20-21
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7宋鑫,高南南,杨润梅.豚鼠高脂血症模型 BKBFA 代谢紊乱的机制研究,中国 药理学通报,2012,28(3)342-346.
论文作者:吴中秋
论文发表刊物:《临床医学教育》2017年9月
论文发表时间:2017/10/27
标签：大鼠论文; 中药论文; 肝脏论文; 化瘀论文; 胆固醇论文; 含量论文; 组织论文; 《临床医学教育》2017年9月论文;