刘冰[1]2004年在《前列腺干细胞抗原致敏树突状细胞诱导前列腺癌特异性免疫反应的实验研究》文中指出前列腺癌是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤。在美国,其发病率在肿瘤患者中占第1位,死亡率仅次于肺癌。我国目前尚无前列腺癌发病率和死亡率的精确统计资料,但随着人民生活水平的提高和人群普查的开展,发病率逐年增高。大约有30 %～50 %前列腺癌患者在初诊时已经有转移发生。早期的局限性前列腺癌可通过手术根治或放疗治愈,但是仍有超过1/3初诊为局限性前列腺癌并接受正规治疗的患者进一步恶化,出现全身转移。对于根治术后复发的或已有转移的晚期前列腺癌,可以通过施行内分泌治疗获得短期疗效,但最终肿瘤会表现为激素非依赖性,对于发展到这一时期的患者,至今没有一种疗效确切的治疗方法。免疫治疗是现代肿瘤综合治疗中的一种重要手段。随着肿瘤免疫理论的突破和分子生物学技术的发展,提出了肿瘤疫苗的概念,其基本的策略是通过诱导或激活肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)而诱发有效的抗肿瘤免疫反应。这一策略的主要局限在于高度特异性的肿瘤抗原的缺乏以及对有效递呈肿瘤抗原途径认识的不足。应用抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC)来直接促进抗原递呈是递呈肿瘤抗原的高效途径。近来,以树突状细胞(dendritic cell,DC)为基础的肿瘤疫苗治疗逐渐成为肿瘤治疗研究的热点。DC是功能最强的APC,也是目前发现的唯一能激活静息T细胞增殖,并能够调控天然免疫反应和获得性免疫反应的抗原递呈细胞。它能够识别、加工并递呈肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen, TAA),激活CTL,有效的启动机体特异性的抗肿瘤细胞免疫反应。肿瘤患者存在肿瘤浸润性DC数量减少和功能缺陷的特点。与正常的DC 相比,肿瘤浸润性DC缺乏刺激T 细胞增殖及产生细胞因子的能力,其递呈抗原的功能发生缺陷,这正是肿瘤
王莹[2]2013年在《IL-13Ra2抗原肽致敏树突状细胞对人脑胶质瘤及其肿瘤干细胞的杀伤效应研究》文中研究指明目的胶质瘤是中枢神经系统(central nervous system, CNS)最常见的恶性肿瘤,起源于神经胶质细胞,包括星形细胞系瘤,少突胶质细胞系肿瘤,混合性胶质细胞瘤,室管膜瘤等。据统计,胶质瘤约占颅内原发性肿瘤的35.26-60.96%(平均44.69%)。由于肿瘤分化不全呈侵袭性生长,手术切除不能够彻底,预后较差。即使进行放化疗也都很难有效根除,病人平均生存期约14.6个月,一般不到两年,极大威胁了人们的生命健康。因此,寻找新的胶质瘤治疗方式成为近20年来研究的热点。随着对中枢神经系统及胶质瘤免疫特性认识的逐渐深入,生物免疫治疗已成为第四种治疗模式,是治疗颅内肿瘤最有前景的新疗法。DC疫苗由于安全,有效及低毒,是胶质瘤免疫治疗的重点。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是目前发现的功能最强大的专职抗原呈递细胞,形态上具有树突状结构,主要组织相容性复合体及共刺激分子如CD86、CD80等的表达水平较高,能够有效摄取并行抗原处理,将之递呈与T淋巴细胞,从而具有启动作用,激发初次细胞免疫应答,引发一系列免疫反应。研究表明,多种方法制备的DC有一定的抗瘤效果。目前致敏DC的抗原有纯化的蛋白质、抗原肽、肿瘤细胞裂解物、肿瘤DNA或RNA等。由于胶质瘤抗原性较弱,且不同个体的胶质瘤间存在异质性,目前研究尚未发现其特异性公共抗原,使DC疫苗目前只能够行个体化治疗,无法实现疫苗的公共化。找到一种在胶质瘤中表达较为广泛的特异性蛋白成为目前脑胶质瘤疫苗研究急需解决的问题。IL-13Ra2是由380个氨基酸残基组成的膜受体,编码基因定位于xq24,属红细胞生成素受体家族。近年来,研究发现IL-13Ra2其在恶性肿瘤细胞尤其是胶质瘤中存在特异性高表达,且恶性程度越高其表达越强,而在正常组织及器官中几乎不表达,由此指出IL-13Ra2是恶性肿瘤的一种受体蛋白,作为一种可能的胶质瘤特异性标志物,有可能在胶质瘤的诊断及治疗方面做出贡献。国外研究已发现IL-13Ra2具有明显的免疫原性及抗原性,可应用于免疫疗法针对恶性胶质瘤细胞,在抗胶质瘤研究中极具潜力,使用IL-13Ra2蛋白致敏的DC疫苗可能同样具有杀伤肿瘤细胞的效果,为DC疫苗的公共化做出贡献。近年来研究发现胶质瘤中存在少部分具干细胞特征的细胞,其具备以下几种特点：无限增殖及自我更新能力、多向分化潜能及高致瘤性、表达干细胞特异性标记。该细胞被称为肿瘤干细胞,高表达多种抗凋亡基因及耐药基因,多处于细胞周期的相对静止期,对放化疗不敏感,不易杀灭。Ignatova发现该类细胞表达CD133及Nestin, Singh等则发现,小鼠颅内接种100个CD133+细胞即可成瘤。胶质瘤干细胞是肿瘤复发的根源。随肿瘤干细胞研究的深入,其作为DC抗原致敏物致敏DC疫苗,诱导出的T细胞抗肿瘤免疫反应明显强于传统DC制备方法得到的疫苗,证明肿瘤干细胞在免疫治疗中具有抗原性,为免疫治疗研究打开了新的视角。由于肿瘤干细胞是肿瘤复发的根源,针对肿瘤干细胞的免疫治疗为根治胶质瘤带来希望。本实验通过检测IL-13Ra2蛋白在脑胶质瘤及正常脑组织中的表达情况,使用IL-13Ra2抗原肽及胶质瘤干细胞的细胞裂解物致敏异体同血型树突状细胞制备DC疫苗,刺激T淋巴细胞,观察是否能有效的杀伤胶质瘤细胞,并与传统胶质瘤全细胞抗原致敏的DC疫苗效果相比较,从而探讨IL-13Ra2蛋白及肿瘤干细胞在胶质瘤免疫治疗中的重要性。采用统计学软件SPSS17.0进行数据统计学分析。方法本实验分为叁部分：第一部分IL-13Ra2蛋白在脑胶质瘤及U251细胞中的表达：收集取得的手术标本制成组织蜡块,u251细胞复苏培养制成细胞爬片,采用免疫组化SABC法(细胞免疫组化及组织免疫组化)检测59例脑胶质瘤5例正常脑组织及U251细胞系中IL-13Ra2蛋白的表达,并对其与肿瘤恶性程度的关系进行统计学分析。第二部分胶质瘤细胞及肿瘤干细胞的培养：收集术中取得的胶质瘤标本,剪切消化,在含血清培养基(DMEM高糖+10%人体血浆)条件下行胶质瘤细胞原代培养；原代胶质瘤细胞以无血清培养法在干细胞培养基(DMEM/F12+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF)条件下培养原代胶质瘤干细胞,生成肿瘤球后行肿瘤干细胞分化实验及流式细胞术检测CD133阳性细胞的表达率。U251细胞系细胞复苏及细胞培养(DMEM高糖+10%FBS)。第叁部分：DC诱导制备及DC疫苗诱导的细胞杀伤效应检测：取正常人外周血,淋巴分离液分离,离心机离心后吸取单个核细胞以1640培养基+10%人体血浆37。C,5%CO2的恒温培养箱内培养培养2小时,收集非粘附细胞后用含有粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)的培养基诱导培养,培养过程中倒置显微镜下观察形态,流式细胞仪检测DC表面标记物CD14、CD83、CD80、CDla、CD86及HLA-DR。取实验第二部分培养的原代胶质瘤细胞,胶质瘤干细胞及U251细胞,反复冻融裂解后离心,制备全细胞抗原。将IL-13Ra2蛋白及上述所得肿瘤全细胞抗原及肿瘤干细胞抗原分别与成熟DC混合,培养箱中培养24小时,获得不同DC疫苗。用人T细胞富集液孵育同源外周血后以淋巴细胞分离液分离并离心,取得T淋巴细胞,T淋巴细胞与DC疫苗共培养后行T细胞增殖实验及T细胞杀伤实验,比较不同DC疫苗的肿瘤的杀伤效果。统计学分析：结果以均值土标准差表示,多组分析采用单因素方差分析,两两比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果IL-13Ra2不在正常的脑组织中表达,而59例胶质瘤组织中有33例IL-13Ra2表达阳性(阳性率55.9%),差异显着。胶质瘤中IL-13Ra2的表达在高度恶性胶质瘤与低级别胶质瘤之间的差异有统计学意义。U251细胞系IL-13Ra2表达阳性。U251细胞及胶质瘤培养成功,在含血清培养基中显微镜下可见其细胞呈梭形,部分呈星形及多角形,胞质透亮,贴壁单层生长。生长迅速,约1周传代一次。4代后可见细胞突起较多,多角形占大部分。无血清干细胞培养基内培养1周多悬浮生长,形成悬浮肿瘤克隆球,折光性较好,流式检测细胞标记CD133阳性,当接种于含血清培养基后肿瘤细胞球逐渐贴壁,细胞逐渐迁出,贴壁分化的细胞形状与原代培养肿瘤细胞相似。在细胞因子GM-CSF和IL-4作用下可成功从人外周血单核细胞中诱导出DC,相差显微镜镜下可见单核细胞贴壁生长,悬浮细胞逐渐增多,体积增大不规则,有典型树突状形态突起,符合成熟形态。流式细胞仪检测可见PBMC-标志物CD14低表达,DCS表面标志物表达率增加,(特征性表面标记CD8387.1%、CDla81%,高表达功能相关抗原CD8078%、CD8684.2%及HLA-DR83%)提示人外周血中诱导到大量高纯度成熟DC。细胞体外杀伤实验结果表明,与单纯DC组相比,IL-13Ra2,肿瘤全细胞抗原及肿瘤干细胞抗原致敏的DC细胞均能明显刺激T细胞增殖,有效杀灭胶质瘤细胞。相比其他实验组,肿瘤干细胞抗原致敏的DC疫苗活化的CTL胶质瘤的杀伤效应更强(P<0.05), IL-13Ra2致敏DC组与肿瘤全细胞抗原致敏DC组相比效果无明显差异(P>0.05),在以脑肿瘤干细胞为靶细胞的体外杀伤实验中干细胞抗原裂解物对肿瘤细胞的杀伤力最强,与IL-13Ra2致敏DC组及单纯DC细胞组相比差异有显着的统计学意义(P<0.001)。而IL-13Ra2致敏DC组杀伤率较低,与单纯DC组相比无统计学意义。(P>0.05)。DC与T细胞比例1：10时刺激能力及杀伤活性最强。结论IL-13Ra2蛋白在正常脑组织中不表达,而在胶质瘤及U251细胞系中存在广泛表达,且表达与恶性程度有关,是一种理想的胶质瘤免疫治疗靶标；原代胶质瘤组织及U251细胞系在无血清培养条件下可成功培养出足够数量的胶质瘤干细胞；人类外周血来源单个核细胞在体外GM-CSF和IL-4联合诱导培养下可获得充足的成熟DC树突状细胞,为DC的肿瘤免疫治疗提供了细胞来源。肿瘤干细胞抗原致敏的DC疫苗能有效刺激抗原特异性CTL,杀伤胶质瘤细胞功能较IL-13Ra2致敏DC疫苗及肿瘤全细胞抗原致敏DC更强。而IL-13Ra2致敏DC疫苗与肿瘤全细胞抗原致敏DC疫苗也有明显的胶质瘤细胞杀伤效果,有潜在临床运用价值。
杨静悦[3]2007年在《腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究》文中进行了进一步梳理原发性肝癌是中国和部分亚洲地区最常见的恶性肿瘤之一,流行病学资料显示乙型肝炎表面抗原阳性人群肝癌发病率是其他人群的12-300倍。我国人群HBV的携带率在10%左右,而90%的原发性肝癌患者发现HBsAg阳性。尽管目前对原发性肝癌的治疗已取得一些进展,但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移效果仍不理想[1～3]。因此,有必要探索一种新的、有效治疗途径。随着人类肿瘤抗原以及肿瘤抗原基因的发现和确认,为肿瘤的免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段。直接作用于肿瘤特异性抗原或相关抗原的治疗性瘤苗是目前研究的热点。其抗肿瘤免疫的重要目的就是诱导针对肿瘤的特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytocoxic T lymphocyte,CTL)反应,而CTL的激活依赖于抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell,APC)提供的抗原多肽和共刺激信号。在抗原提呈细胞中,尤以树突状细胞(Dendritic cell,DC)的抗原提呈功能最强,可启动并调节免疫应答,有效刺激T、B淋巴细胞活化,在抗肿瘤、抗感染、移植排斥以及自身免疫性疾病发病过程中起重要作用。目前DC在抗肿瘤免疫治疗方面的研究已经取得一些进展,并且在肿瘤的临床治疗上已显示其良好的治疗效果。但是由于大多数肿瘤来说,肿瘤组织中仅部分肿瘤细胞表达一种肿瘤相关抗原,针对单一肿瘤相关抗原的免疫应答无法清除所有肿瘤细胞。并且肿瘤细胞本身存在多种肿瘤相关抗原,针对单一抗原的免疫治疗有时并不能发挥其应有的作用,激发的免疫效应弱。故近来为使DC能够负载更多肿瘤抗原,发挥更大免疫治疗效应,人们研究了DC负载多种抗原的制备方法,包括:经照射的肿瘤细胞与DC共培养,肿瘤细胞来源的RNA转染DC,腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC以及多种肿瘤相关抗原肽冲击致敏DC等方法。在这些方法中以肿瘤细胞来源的RNA转染DC以及腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC最为有效,但肿瘤细胞来源的RNA具有生物活性不稳定等缺点。因此,在本研究中,我们根据中国人原发性肝癌独有的流行病学特点,应用HBV相关性肝癌中HBV病毒特异性抗原,联合肝癌相关抗原AFP作为免疫治疗靶点,制备AFP、HBsAg基因的腺病毒载体,体外转染人树突状细胞,比较HBsAg- DC、AFP-DC以及AFP / HBsAg-DC瘤苗体外对HBsAg表达的人肝癌细胞株的杀伤活性。探讨腺病毒介导的HBsAg、AFP基因共感染较单基因感染DC能否增强其体外诱导的特异性抗肿瘤免疫效应,以期选择更为有效的DC肝癌瘤苗,为原发性HBV感染肝癌的治疗寻求新的途径。第一部分:HBsAg、AFP基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定目的构建能高效转导HBsAg、AFP基因的重组腺病毒,进行病毒扩增和滴度测定,并检测HBsAg、AFP抗原表达,以用于DC基因治疗的实验研究。方法应用Adeno-XTM腺病毒表达载体系统分别构建表达AFP、HBsAg的重组腺病毒和对照载体Ad-GFP。目的基因首先克隆到pShuttle形成穿梭载体,用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg、AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体Adeno-X连接,形成重组腺病毒质粒,再以PacⅠ酶切线性化,转染HEK293细胞包装为重组腺病毒。检测病毒滴度后,进一步对重组腺病毒分别感染HEK293和H1299细胞的结果进行IFA法检测目的基因在靶细胞中的有效表达。结果经酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒和重组腺病毒质粒插入片段为HBsAg、AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒。滴度测定结果为Ad-S 2.65×109 PFU/ml;Ad-AFP采用同样方法测定的滴度为3.16×109 PFU/ml。重组腺病毒感染H1299细胞后IFA法检测结果显示目的基因表达于感染细胞中,表明腺病毒介导的HBsAg、AFP基因感染的有效性。结论成功构建了复制缺陷型AFP、HBsAg重组腺病毒及对照重组腺病毒Ad-GFP;重组腺病毒Ad-S、Ad-AFP能高效介导基因在被感染细胞内有效表达。第二部分:树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定目的以经动员富集的肝癌患者外周血单个核细胞(Mono nuclear cell,MNC)为来源,建立体外诱导培养DC的方法;以健康供者MNC为对照,检测肝癌DC的形态、表型及功能;利用Ad-GFP作为研究对象,测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率。方法选择肝癌患者及正常人外周血,血细胞分离机分离富集外周血MNC,经淋巴细胞分离液梯度离心、聚苯乙烯细胞培养板贴壁纯化后,加入含GM-CSF和IL-4的X-VIVO 15培养液联合诱导DC分化,诱导d6加入TNF-α促进DC成熟。分别以倒置显微镜、电子显微镜观察DC形态变化,FCM检测细胞表型变化。利用Ad-GFP作为研究对象,测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率,MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。取培养第7天的DC,按不同的MOI将重组腺病毒加入培养孔中,FCM检测细胞感染前后的表型变化以及腺病毒的感染效率。结果肝癌患者DC鉴定:诱导后,患者DC显示出典型的形态及表型特征。诱导d8(加TNF-α活化48h),各抗原表达量明显升高,分别为:CD1a( 71.45士4.39)%、CD11c( 89.68士3.16)%、CD86(91.17士4.43)%、CD80 ( 91.37士4.12)%、HLA-DR( 94.03士3.01 )%,为典型DC表型;健康对照DC各抗原表达量为CD1a( 68.45士5.02)%、CD11c( 91.09士2.01)%、CD86(92.19士4.36)%、CD80 ( 90.81士3.15)%、HLA-DR( 93.49士4.18 )%,二者间无显着性差异(P>0.05 )。混合淋巴细胞反应结果显示,患者DC具有高效地刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,其刺激指数( SI)与健康对照DC的SI无显着差异(P>0.05 )。用Ad-GFP感染培养的DCs时,有较好的量效关系和时效关系。当感染增殖率(multiplicity of infection, MOI)为100时,感染24小时接近80.62%的DCs被转染。且转染后的DCs的形态与对照组相比无明显异常。当MOI为100,感染48小时后接近85.25%的DC被转染。并且DC经腺病毒感染DC 48小时后,FCM检测细胞表型为成熟DC表型特征。证明Ad-GFP能高效、安全感染培养的DC。结论以肿瘤患者经动员富集的外周血MNC为来源,联合应用GM-CSF、IL-4及TNF-α,在体外可诱导培养出具有典型形态、表型及免疫活性的DC。腺病毒介导的基因可感染人外周血MNC来源的DC可高效表达。第叁部分:重组腺病毒介导HBsAg和AFP基因修饰树突状细胞体外诱导抗HBV相关肝癌免疫实验的研究目的以腺病毒载体介导AFP基因与HBsAg基因修饰树突状细胞,使之作为抗原呈递细胞,同时呈递HBV肝癌相关抗原AFP和HBsAg,从而诱导更强的特异性CTLs,即可对恶性肿瘤细胞发挥杀伤效应,又可诱导抗HBV免疫的作用。并探讨AFP、HBsAg基因修饰树突状细胞较单基因修饰DC瘤苗作为HBV持续感染的肝癌免疫治疗是否更具优势。方法分别以Ad-S、Ad-AFP以及Ad-S和Ad-AFP转染DC,以IFA法检测叁组细胞抗原表达,以FCM检测感染后DC表型变化。以S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC作为刺激细胞,取患者外周静脉血单个核细胞(PBMC )中非贴壁细胞(淋巴细胞,L),调整细胞密度为1×106/mL,以含1L-2,10%FCS的RPMI1640培养;将S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC以5×104mL密度分别加入上述淋巴细胞中,共同孵育72h (设未致敏DC组和单独淋巴细胞组为对照),再次加入同剂量DC孵育72h,收获细胞分别称为S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L。以S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L作为效应细胞,肝癌细胞株HepG2.2.15,SMMC-7721和人肺腺癌H1299作为靶细胞,以不同效靶比接种于96孔板,4h后LDH法测定效应细胞对各肿瘤细胞的杀伤作用。结果IFA法检测结果显示目的基因均表达于转染的叁组细胞中。FCM结果显示共感染的DC细胞均高表达CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR,表现为成熟DC表型特征。CTL结果显示S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L组均显示对HepG2.2.15高效特异的杀伤活性,显着高于DC-L组和单纯L组,其杀伤能力与效应细胞数量成正比;在同一效靶比时S/AFP-DC-L对HepG2.2.15的杀伤率明显高于S-DC-L、AFP-DC-L组;而S-DC-L、AFP-DC-L组对HepG2.2.15的杀伤率无明显区别;S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L刺激的T细胞组IFN-γ分泌显著高于DC刺激的L细胞组和L细胞组;但S/AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌显著高于S-DC-L、AFP-DC-L组;而S-DC-L、AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌无明显区别;对照组DC-L和L组IFN-γ分泌亦无明显区别。结论腺病毒介导AFP和HBsAg基因修饰DC,能够在体外诱导特异性CTL效应,对表达HBsAg的肝癌细胞有明显的杀伤作用,而且对HepG2.2.15细胞杀伤率大于单独转基因者。
王福利[4]2007年在《TGF-β不敏感的树突状细胞疫苗对前列腺癌的免疫治疗作用研究》文中提出目的:树突状细胞(DC)是目前在肿瘤免疫中功能最强的一种抗原递呈细胞,以其为基础制成的肿瘤疫苗,可多途径诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫。但是肿瘤细胞分泌大量的转化生长因子(TGF-β)抑制DC递呈抗原和促进DC凋亡。我们采用前列腺癌TRAMP-C2细胞裂解产物作为抗原加载C57BL/6小鼠骨髓DC,诱导出前列腺癌特异性的DC。修饰TβRII基因,构建逆转录病毒载体,体外基因转染前列腺癌特异性的DC,检测转染后前列腺癌特异性DC的表面抗原、细胞增殖性、分泌功能变化,评价TGF-β不敏感的DC疫苗对TRAMP-C2前列腺癌荷瘤C57BL/6小鼠的免疫治疗作用。方法:1)构建含有显性负相TGF-βII型受体(TβRIIDN)质粒的逆转录病毒:含有TβRIIDN质粒的逆转录病毒转染293包装细胞,32℃下共转染12小时,10% DMEM培养基37℃下孵化过夜,PBS漂洗后同样条件再次转染293细胞24小时,收集上清,获得含有TβRIIDN重组逆转录病毒。2)负载前列腺癌抗原的DC细胞分离、培养及鉴定:将C57BL/6小鼠新鲜骨髓用红细胞去除法获取DC细胞,加入含rhIL-4(1000U/ml)、GM-CSF(1000U/ml)的完全培养基,隔日半量换液,在第6d梯度离心收获非粘附细胞为非成熟的DC细胞。反复冻融获得TRAMP-C2细胞裂解物,裂解物反复刺激非成熟的DC细胞获得负载前列腺癌抗原的成熟DC细胞。于光镜下形态学鉴定,用流式细胞仪检测细胞表型MHC class II,CD40,CD11c,CD80和CD86。3)DC细胞转染,获取TβRIIDN-DC细胞:含有TβRIIDN重组逆转录病毒转染负载前列腺癌抗原的DC细胞5%CO2、37℃下孵化48小时,获得表达TβRIIDN的DC细胞,流式细胞仪检测DC细胞表型变化。4)TβRIIDN-DC细胞体外实验:不同的DC细胞与TGF-β共同培养,流式细胞仪测定表面共刺激分子(CD80/CD86)变化,脱氧胸腺嘧啶苷核素掺入法进行增殖抑制实验,Western blot检测SMAD-2和磷酸化SMAD-2的表达。5)DC疫苗体内抗肿瘤评价:建立前列腺癌TRAMP-C2细胞皮下荷瘤C57BL/6小鼠模型,皮下荷瘤小鼠40只,随机分为4组,每组10只,分别皮下注射TβRIIDN-DC细胞、负载前列腺癌抗原的DC细胞、GFP-DC细胞和磷酸盐缓冲液(PBS),15天后重复注射,酶联免疫吸附(ELISA)测定细胞因子IFN-γ和IL-12变化,观察各组荷瘤小鼠的生存期和肿瘤的体积改变。6)体内CTL活性检测:最后一次疫苗免疫后5 d取其脾脏,分离、活化T淋巴细胞,Cr51释放实验测定肿瘤特异性杀伤T细胞(CTL)对TRAMP-C2细胞的细胞毒作用。黑色素瘤细胞B16-F1作为对照靶细胞。结果:1)流式细胞仪分析CD11c表达,小鼠骨髓来源的DC细胞纯度为90.8%。含有TβRIIDN和GFP的逆转录病毒转染效率分别为92.7%和90.6%。2)流式细胞仪检测不成熟DC细胞、负载前列腺癌抗原的成熟DC细胞、TβRIIDN-DC细胞、GFP-DC细胞的CD86、CD80、CD40、CD11c及MHC-II分子表型改变,成熟DC细胞、TβRIIDN-DC细胞、GFP-DC细胞表型表达明显高于不成熟DC细胞(P<0.01),成熟DC细胞、TβRIIDN-DC细胞、GFP-DC细胞之间细胞表型无明显差别(P>0.05)。说明表达TβRIIDN不影响DC细胞的分子表型。3)负载前列腺癌抗原的成熟DC细胞、TβRIIDN-DC细胞、GFP-DC细胞与5 ng/ml的TGF-β孵育后,Western blot在各组中均可以检测到Smad-2, TβRIIDN-DC细胞中却没有检测到磷酸化的Smad-2。表明TβRII显性负相表达阻断了DC细胞的TGF-β信号通路。4)与TGF-β共同培养72小时后,非转染的成熟DC细胞、GFP-DC细胞和TβRIIDN-DC细胞的脱氧胸腺嘧啶苷核素摄入抑制率分别为62.5%、65.5%和15%,TβRIIDN-DC细胞的脱氧胸腺嘧啶苷核素摄入抑制率与其他各组比较差异有显着统计学意义(P<0.05)。在给予TGF-β的正常条件下,非转染的成熟DC细胞、GFP-DC细胞不能增殖并且15天之内死亡,然而,TβRIIDN-DC细胞继续正常增殖和生长,表明TβRIIDN-DC细胞对TGF-β的抗增殖作用不敏感。5)非转染的成熟DC细胞、GFP-DC细胞和TβRIIDN-DC细胞与TGF-β及肿瘤抗原共同培养7天,流式细胞仪测定表面共刺激分子(CD80/CD86),在TGF-β作用下CD80和CD86在TβRIIDN-DC细胞的表达明显高于其他各组(P<0.01)。6)成功地构建了前列腺癌TRAMP-C2细胞皮下荷瘤C57BL/6小鼠模型,接种非转染的DC细胞、GFP-DC细胞和TβRIIDN-DC细胞的荷瘤小鼠与对照组相比能明显抑制肿瘤生长(P<0.01,P<0.05 and P<0.05,vs.对照组),其中TβRIIDN-DC组抑制效果更明显,有2例肿瘤完全消失。这表明TβRIIDN-DC疫苗有更强的抗肿瘤效果。50天后接种PBS、非转染的DC细胞、GFP-DC细胞和TβRIIDN-DC细胞的荷瘤小鼠生存率分别为0%、20%、30%和80%。Mantel-Haenszel log-rank统计分析表明:TβRIIDN-DC细胞与其他2组相比差别有统计学意义(P<0.01)。这些结果说明TGF-β不敏感的DC细胞能有效提高TRAMP-C2皮下荷瘤小鼠的生存率。7)接种PBS的荷瘤小鼠体内测出IFN-γ和IL-12基础水平,接种非转染的DC细胞、GFP-DC细胞的荷瘤小鼠体内IFN-γ和IL-12水平明显升高,接种TβRIIDN-DC细胞的荷瘤小鼠体内该两种细胞因子水平升高更明显。8)标准的Cr51释放实验测定CTL杀伤活性,非转染的DC细胞、GFP-DC细胞和TβRIIDN-DC细胞处理的荷瘤小鼠CTL对TRAMP-C2细胞有较高的杀伤活性,其中,TGF-β不敏感的DC细胞诱导出最强的CTL杀伤活性(E/T比率为100:1时杀伤活性为85%),对无关的黑色素瘤B16-F1细胞没有杀伤作用。结果表明阻断的TGF-β信号通路能增加肿瘤特异性杀伤活性,提高DC疫苗的效能。结论:1)成功构建了含有TβRIIDN质粒的逆转录病毒;2)采用前列腺癌TRAMP-C2细胞裂解产物作为抗原加载C57BL/6小鼠骨髓DC,诱导出了前列腺癌特异性的DC;3)首次使用修饰后TβRII基因转染前列腺癌特异性的DC,使TβRII显性负相表达,阻断TGF-β信号通路;4)TβRIIDN并不影响转染DC细胞的表型,在TGF-β作用下TβRIIDN-DC表面共刺激分子表达增高;5)TGF-β不敏感的DC细胞能明显提高TRAMP-C2皮下荷瘤小鼠的生存率,明显抑制肿瘤生长,而且有2例肿瘤完全消失。TGF-β不敏感的DC细胞处理的荷瘤小鼠体内IFN-γ和IL-12水平明显升高;6)TGF-β不敏感的DC细胞诱导出最强的CTL杀伤活性,E/T比率为100:1时杀伤活性为85%,CTL具有肿瘤特异性,对无关的黑色素瘤B16-F1细胞没有杀伤作用。
田子农[5]2009年在《IL-15基因联合肿瘤抗原修饰树突状细胞抗前列腺癌的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:1.构建携带mouseIL-15基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-GFP-mIL-15)并大量制备。2.建立从小鼠骨髓前体细胞中分离、培养和扩增树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法;将Ad-GFP-mIL-15和RM-1小鼠前列腺癌细胞裂解产物上清(Lysate)共同修饰DC,构建新型前列腺癌DC疫苗(IL-15/lysate-DC),评价其免疫生物学特性。3.通过体外、体内实验证实IL-15/lysate-DC疫苗抗前列腺癌免疫治疗作用,为以DC为基础的前列腺癌免疫治疗和基因转染治疗提供新的策略。方法:1.以小鼠肾脏cDNA为模板,用pfx DNA ploymerase扩增mIL-15目的基因,扩增得到的目的基因片段克隆到pGEM-T Easy Vector上,得到mIL-15-T克隆载体;从mIL-15-T克隆载体上EcoRI双酶切得到mIL-15基因,连接到pShuttle-GFP-CMV载体上,得到pShuttle-GFP-mIL-15;将pShuttle-GFP-mIL-15转移到pAdxsi载体上,得到Ad-GFP-mIL-15病毒质粒,并完成了腺病毒的大量扩增和纯化。2.从小鼠骨髓分离DC前体细胞,在细胞因子GM-CSF和IL-4联合作用下,大量制备骨髓源性DC(bone marrow derived DC,BM-DC)。采用形态学(光镜)、免疫细胞化学和免疫生物学等方法研究DC的免疫生物学特性。将Ad-GFP-mIL-15病毒转染联合RM-1小鼠前列腺癌细胞的裂解产物上清(Lysate)共同修饰DC,制备IL-15/lysate-DC前列腺癌疫苗。3.体外实验检测IL-15/lysate-DC刺激同基因型T细胞增殖能力、刺激T淋巴细胞亚群表型分析,刺激同基因型小鼠T细胞增殖反应中淋巴细胞培养上清IFN-γ、IL-10水平,诱导CTL能力及杀伤活性。4.建立RM-1前列腺癌细胞荷瘤小鼠动物模型,观察IL-15/lysate-DC疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用,并分析其可能的作用机制;ELISA方法检测荷瘤小鼠治疗后血清中IFN-γ和IL-10表达水平。结果:1.所构建的Ad-GFP-mIL-15病毒质粒,经酶切电泳、测序及RT-PCR鉴定,证实重组腺病毒载体构建正确,插入片段包含mIL-15基因序列。2.在细胞因子GM-CSF和IL-4诱导下,体外培养5天后,可从每只小鼠骨髓DC前体细胞中获得5～10×106个DC。早期未成熟DC表达很低的表面共刺激分子、黏附分子和MHC分子,刺激T细胞增殖能力极弱;5天的DC在转染Ad-GFP-mIL-15 48小时后,表面共刺激分子、黏附分子和MHC分子明显上调,混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)强烈;将Ad-GFP-mIL-15联合RM-1小鼠前列腺癌细胞的裂解产物上清(Lysate)共同修饰DC,制备IL-15/lysate-DC前列腺癌疫苗,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测其表面共刺激分子、黏附分子和MHC分子明显上调。3. IL-15/lysate-DC前列腺癌疫苗刺激同基因型小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力明显升高;刺激同基因型小鼠脾脏T淋巴细胞亚群表型分析,证实IL-15/lysate-DC可使T淋巴细胞中CD8+T亚群比例细胞明显升高;刺激同基因型小鼠T细胞增殖反应中淋巴细胞培养上清IFN-γ、IL-10的检测,证实IL-15/lysate-DC组淋巴细胞上清中IFN-γ水平明显增高,IL-10水平最低;在诱导CTL能力及杀伤活性检测实验中,四氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium ,MTT)还原法显示IL-15/lysate-DC组对RM-1前列腺癌细胞的特异性细胞杀伤率最高;上述实验中,IL-15/lysate-DC组与GFP/lysate-DC组、Lysate-DC组相比,差异有显着性意义(P<0.05)。4. RM-1细胞前列腺癌荷瘤小鼠模型构建成功,成瘤率100%。IL-15/lysate-DC治疗组荷瘤生长减缓,生存期延长。接种RM-1前列腺癌细胞10周后,IL-15/lysate-DC组仍有50%的小鼠存活,上述实验中,IL-15/lysate-DC组与GFP/lysate-DC组、Lysate-DC组、PBS组相比,差异有显着性意义(P<0.05)。5. ELISA检测显示,荷瘤小鼠经免疫治疗2次后,IL-15/lysate-DC组血清IFN-γ水平明显增高,IL-10水平最低,与GFP/lysate-DC组、Lysate-DC组、PBS组相比,差异有显着性意义(P<0.05);组织学检查发现,IL-15/lysate-DC治疗组的荷瘤鼠,瘤体内、瘤周有大量炎性细胞(淋巴、单核细胞)浸润,肿瘤组织局部坏死明显。GFP/lysate-DC组、Lysate-DC组也可见瘤体内部分组织坏死及炎性细胞浸润,但明显少于IL-15/lysate-DC组,PBS组几乎无肿瘤坏死及炎性细胞浸润。结论:1.成功构建了Ad-GFP-mIL-15病毒质粒。2.在细胞因子GM-CSF和IL-4诱导下,可从小鼠骨髓前体细胞中获得足够数量DC;转染Ad-GFP-mIL-15能促进DC成熟、上调MHC-Ⅱ类分子、表面共刺激分子和黏附分子的表达,MLR检测示刺激T细胞增殖能力明显提高。3.IL-15/lysate-DC疫苗能激发同基因型T淋巴细胞增殖,诱导IFN-γ因子分泌能力强,使T淋巴细胞中CD8+T细胞亚群比例明显升高;所诱导的特异性CTL对RM-1前列腺癌细胞有显着的杀伤作用。4.观察IL-15/lysate-DC疫苗治疗荷瘤小鼠,发现有明显的抗肿瘤作用,能减缓肿瘤生长速度,使荷瘤小鼠生存期延长;治疗后血清IFN-γ水平明显增高,肿瘤组织出现明显坏死和淋巴细胞浸润,能诱导强烈的全身和局部肿瘤免疫应答。
鲍传庆[6]2010年在《大肠癌患者自体树突状细胞免疫治疗技术临床应用研究》文中研究指明大肠癌包括结肠癌和直肠癌,是最常见的消化道恶性肿瘤之一。在世界范围内,大肠癌发病率居恶性肿瘤第4位,已占全身恶性肿瘤的12%-15%,每年有102万新发病例和53万死亡病例。自上世纪70年代以来,我国大肠癌发病率和死亡率有不断上升趋势(以结肠癌上升为主),并且青年期(<30岁)大肠癌发病率高是我国大肠癌的一个显着临床特点。因大肠癌早期症状不明显,多数患者就诊时已发生区域或远处转移,单纯手术治疗不能显着改善患者预后,因此综合治疗成为目前治疗大肠癌的重要方法。生物治疗作为大肠癌综合治疗的组成部分,即可以独立运用,又可与手术及放、化疗结合,具有疗效高、特异性强、副作用小等优点,已成为研究的热点之一。树突状细胞(DC)是目前已知功能最强大的专职抗原递呈细胞,是机体T细胞特异性免疫应答的直接启动和调控者。它最大的特点是能够显着刺激初始型T细胞的增殖,在免疫反应的诱导中具有独特的地位。DC在外周组织中摄取抗原,加工分解成抗原肽与MHC-I/II类分子结合,然后移行到周围淋巴器官通过MHC分子递呈抗原给T淋巴细胞,激发特异性抗肿瘤免疫反应。与其他抗原递呈细胞相比,DC表达MHC-I/II类分子、共刺激分子和粘附分子的水平更高,因此在刺激T细胞增殖,抗肿瘤免疫中起重要作用。早在1995年国外学者就开展了DC治疗肿瘤的I期临床试验,以DC为载体开发的DC肿瘤疫苗在前列腺癌、恶性黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、脑胶质瘤、肾细胞癌等恶性肿瘤患者治疗中取得了显着的疗效。DC肿瘤疫苗用于结直肠癌的研究也表明其安全有效,不仅可降低结直肠癌患者癌胚抗原(CEA)水平,甚至可使肺部转移病灶消失。以DC为载体开发的DC肿瘤疫苗已成为现今最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗方法之一。由于大肠癌是一种免疫原性较弱的肿瘤,且肿瘤细胞缺乏共刺激分子或某些粘附分子,并可通过抗原调变、下调MHC分子表达等机制介导肿瘤免疫逃逸,从而影响免疫治疗效果。另有研究表明,肿瘤患者体内DC数量减少及功能缺陷,使其无法有效递呈肿瘤抗原,亦是肿瘤免疫逃逸的主要原因之一。因此,提高肿瘤患者体内DC的数量并维持其强大的抗原识别、呈递功能是实施抗肿瘤免疫治疗的关键措施之一。正因为此,应用足够数量和功能正常的DC细胞进行细胞免疫治疗或基于DC细胞的抗肿瘤疫苗研究工作越来越受到重视。对肿瘤患者提供外源性DC细胞进行细胞免疫治疗的方法现已经历了以下阶段的发展:早期多采用已知肿瘤相关抗原肽或肿瘤细胞mRNA修饰致敏DC,但疗效不佳。随着研究的深入,改用肿瘤全抗原致敏DC的方法,即,将肿瘤细胞与DC融合或用肿瘤细胞裂解物负载DC制成杂交疫苗,用于胃癌、肝细胞癌及大肠癌治疗的临床研究取得较好的抗肿瘤效果。而最近研究发现,DC表面表达多种热休克蛋白(HSP)受体(如CD91,CD40,TLR2/4或LOX1),HSP可作用于DC或单核细胞,刺激其产生细胞因子(IL-12,TNFa,IL-6等),增强机体非特异性免疫反应。2004年免疫学权威杂志《Immunity》报道,与多肽负载的DC相比,HSP70-抗原肽复合物负载的DC在体外激发CD8+ T的能力远远高于前者(1000倍)。提示如果将HSP与DC进行有机结合,发挥二者各自的优势,将会产生更强的免疫激发作用。有鉴于此,本研究对大肠癌患者热休克凋亡自体的大肠癌细胞抗原制备、自身的树突状细胞体外诱导、以及抗原负载方法等进行了初步探讨,并比较了分别负载热休克诱导凋亡大肠癌细胞株和肿瘤细胞裂解物两种不同抗原的DC对大肠癌细胞的杀伤效果,并探讨了热休克凋亡的人自体大肠癌细胞致敏自体的树突状细胞疫苗对大肠癌患者术后免疫功能的影响,为制备大肠癌细胞肿瘤疫苗研究提供技术基础。研究共分为叁个部分:第一部分自体大肠癌细胞负载树突状细胞的方法研究目的:建立自体热休克凋亡大肠癌(包括结肠、直肠癌)细胞抗原制备、树突状细胞体外诱导、以及抗原负载方法,为制备树突状细胞肿瘤疫苗提供技术基础。方法:采用酶消化法从手术切除的14例大肠癌新鲜组织获得单细胞悬液,热休克处理后用桦脂酸诱导其凋亡制备成细胞抗原;采集外周静脉血,分离单个核细胞,经GM-CSF与IL-4体外诱导成未成熟树突状细胞,负载细胞抗原后制备成DC肿瘤疫苗;苔盼蓝染色进行细胞总数及活细胞计数,计算细胞活率;用FITC-Annexin-Ⅴ和PI标记细胞,流式细胞仪检测,计算细胞凋亡率。软琼脂克隆法检测细胞体外成瘤能力;按《中华人民共和国药典》2005版第叁部规定的方法进行内毒素检测。结果: (1)肿瘤细胞抗原得率:(11.81±0.65)×106/g组织;平均凋亡率:(93.16±2.31)%;(2)imDC平均得率为(9.75±0.82)×106(/121.64)×106个PBMC,细胞活率>95%;imDC表型分析:CD11c+CD14-、CD11c+HLA-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+、CD11c+CD86+表达率分别为(87.58±2.56)%、(87.97±0.98)%、(2.21±0.69)%、(4.85±1.22)%、(5.02±0.95)%;(3)DC平均得率为(6.76±0.98)×106/(9.75±0.82)×106个imDC,细胞活率>95%,DC表型:CD11c+CD14-、CD11c+HLA-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+、CD11c+CD86+表达率分别为( 93.45±1.25 ) %、(89.79±1.35)%、(87.85±1.62)%、(70.74±6.45)%、(95.54±2.18)%。内毒素检测均合格(≤5 IU/mL)。结论:本方法稳定、安全、可靠,可制备出成熟DC。第二部分两种不同方式负载大肠癌细胞株的树突状细胞体外刺激淋巴细胞抗肿瘤活性的比较目的:比较树突状细胞以两种不同方式负载大肠癌细胞株体外刺激淋巴细胞的抗瘤活性。方法:分离30例大肠癌患者外周血单核细胞体外诱导DC,分别负载热休克诱导凋亡大肠癌细胞株和肿瘤细胞裂解物,以此刺激淋巴细胞作为效应细胞,大肠癌细胞株为靶细胞,MTT法测定效应细胞对靶细胞的杀伤作用。结果:负载热休克大肠癌细胞的DC与负载肿瘤细胞裂解物的DC都显示对靶细胞的杀伤活性,但前者的杀伤率显着高于后者(P<0.05)。结论:负载热休克肿瘤细胞的DC是一个更为有效的负载方式。第叁部分自体DC治疗对大肠癌患者术后免疫功能的影响目的:探讨热休克凋亡的人自体大肠癌细胞致敏的树突状细胞疫苗对大肠癌术后免疫功能的影响。方法:从大肠癌患者外周血单个核细胞中诱导DC,并用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4刺激活化,经热休克凋亡自体大肠癌细胞致敏制备DC疫苗。将28例大肠癌术后患者随机分为DC疫苗治疗组14例,化疗对照组14例。对两组病例治疗前后免疫功能、临床疗效进行观察比较。结果:DC疫苗组治疗后外周血CD3+、CD4+/CD8+及NK细胞比率较治疗前明显升高(P<0.05),且明显高于对照组化疗后的CD3+、CD4+/CD8+及NK细胞比率(P<0.05);DC疫苗治疗后患者血清IL-2、IL-12、IFN-γ水平较治疗前明显升高(P<0.05),且明显高于对照组(P<0.05),生存时间明显延长。结论:大肠癌术后行热休克凋亡自体大肠癌细胞致敏的DC疫苗治疗,可提高患者的细胞免疫水平。
邵斯亮[7]2006年在《前列腺癌细胞裂解物致敏树突状细胞诱导特异抗瘤作用研究》文中指出研究目的：从小鼠骨髓前体细胞中分离、培养和扩增树突状细胞(dendritic cell，DC)：研究DC发育、分化和成熟过程中形态学和免疫学的变化；RM-1前列腺癌细胞裂解物冲击DC，构建前列腺癌DC瘤苗，初步研究该瘤苗在小鼠体内外抗前列腺癌作用。 研究方法：分离C57BL／6小鼠骨髓前体细胞，在GM-CSF和IL-4联合作用促进前体细胞向DC分化，大量制备DC。光镜观察DC形态学特征，混合淋巴细胞实验、辣根过氧化物酶(HRP)吞噬实验研究DC生物学特性。RM-1前列腺癌细胞裂解物产物致敏DC，酶联免疫反应(ELISA)法检测致敏DC培养液上清IL-12，检测该瘤苗体外诱导特异性CTL的杀伤作用。建立小鼠RM-1前列腺癌模型，观察致敏DC瘤苗对荷瘤小鼠的治疗作用。 结果：1．在GM-CSF或GM-CSF联合IL-4诱导下，体外培养7天，可从小鼠骨髓前体细胞中获得成熟DC，且GM-CSF联合IL-4组DC得率高。培养4天的DC为未成熟DC，突起少而短，胞内囊泡多，刺激T细胞增殖能力弱，吞噬能力强；培养7天的DC为成熟DC，突起多而长，胞内囊泡少，刺激T细胞增殖能力强，吞噬能力弱。 2．体外试验显示，RM-1肿瘤细胞裂解物致敏DC分泌IL-12能力强于DC(p＜0.05)，用致敏DC免疫的小鼠，其脾脏T细胞经RM-1细胞诱导后，对RM-1细胞具有特异性杀伤作用，同DC组比较差异有显着性(p＜0.05)。 3．致敏DC治疗组的RM-1前列腺癌荷瘤小鼠肿瘤生长缓慢，生存期延长同PBS组及DC组比较差异明显(p＜0.05)，PBS同DC组之间无显着差异；且肿瘤坏死明显，瘤体内及肿瘤周围有大量炎细胞浸润。 结论：1．小鼠骨髓单核细胞在GM-CSF和IL-4诱导下可转化为DC，且
贾军[8]2005年在《AFP与突变型P53融合基因转染CD34～+造血干细胞来源的树突状细胞诱导抗肝癌细胞特异性免疫反应》文中研究表明目的:1) 以RT-PCR方法构建AFP基因真核表达载体pEGFP-AFP并进行鉴定;2) 以RT-PCR方法克隆含真核表达元件Kozak序列、启始密码子但不含终止密码子的AFP基因cDNA,连接AFPcDNA与mtP53基因构建融合基因真核表达载体pEGFP-AFP-mtP53并进行鉴定;3) 采集肝癌患者外周血CD34~+细胞,体外诱导培养DC并进行鉴定;4) 将AFP-mtP53融合基因转染DC,诱导DC产生针对AFP和mtP53抗原的特异性CTL反应,并与AFP和mtP53单基因转染诱导的特异性CTL反应比较,观察其对不同肝癌细胞株的杀伤抑制效果,评价以AFP和mtP53双抗原致敏DC诱导的针对AFP和mtP53双靶点的特异性抗肝癌CTL活性。 方法:1) 体外培养人肝癌细胞HepG2,Trizol裂解细胞,提取总RNA。设计含有特定酶切位点Bgl Ⅱ、真核启动元件Kozak序列和起始密码子ATG的PCR正向引物;含有特定酶切位点Sal Ⅰ和终止密码子TAA的PCR反向引物。采用RT-PCR法克隆AFP全长cDNA,使用BglⅡ+Sal Ⅰ双酶切载体pEGFP-mtP53和AFP cDNA,将AFP cDNA连接载体pEGFP,构建新的真核表达载体,命名为pEGFP-AFP。并对真核表达载体pEGFP-AFP进行测序,保存测序正确克隆。采用脂质体转染技术将真核表达载体pEGFP-AFP转染
徐丹枫[9]2004年在《PSA特异性树突状细胞瘤苗治疗前列腺癌的实验研究》文中研究说明目的:1.构建PSA真核表达质粒pcDNA3.1/His-Myc(-)B/PSA并大量制备和纯化蛋白。2.建立从小鼠骨髓前体细胞中分离、培养和扩增树突状细胞的方法;研究DC发育、分化和成熟过程中形态以及免疫生物学特性的改变;PSA融合蛋白冲击DC,构建前列腺癌DC瘤苗(PSA-DC),以癌组织裂解产物(lysate)、无关蛋白以及无抗原刺激的DC分别作阳性、阴性对照和空白对照。探讨影响DC瘤苗的体外功能活性及影响因素。3.实验观察瘤苗体内抗前列腺癌免疫治疗作用及免疫保护机制。方法:1.提取临床前列腺癌标本中癌细胞总RNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增PSA基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B/PSA,转化、抽提、扩增和纯化PSA。2.分离骨髓前体细胞,在联合加入GM-CSF和IL-4的条件下,大量制备骨髓DCs(bone marrow derived DC,BMDC),研究DC的生物学、免疫学特性。3.将PSA、癌细胞裂解产物冲击DC制备前列腺癌DC瘤苗、全细胞抗原瘤苗;检测前列腺癌DC瘤苗生物学活性,观察瘤苗刺激抗原特异性T细胞增殖活性和诱导抗原特异性CTL杀伤活性。4.建立前列腺癌LNCaP裸鼠、RM-1小鼠模型,观察该瘤苗对荷瘤小鼠的免疫治疗和免疫保护作用和保护机制。结果:1.将PSA基因插入真核表达载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B中,构建pcDNA3.1(-)B/PSA表达载体。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示,扩增出1条特异的核酸片段(711bp),大小与预期一致。PSA基因的扩增片段纯化后与cDNA3.1/myc-his(-)B载体连接,经XhoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳显示切出大小约700bp的目的片段和载体片段,表明系阳性克隆。pcDNA3.1/myc-his(-)B载体插入片断的测序结果经Blastn比对,与GenBANK登陆序列一致。RT-PCR电泳分析和Western blot方法证实从mRNA、蛋白水平证明转染成功。对阳性克隆进行CHO细胞大规模培养,最大细胞密度可达(3～9)×10~7cells/ml,重组蛋白产量200～800mg/L/d。经Ni2+螯合亲和层析,纯化得到电泳纯PSA融合蛋白,纯度可达90%。2.骨髓前体细胞在细胞因子GM-CSF加IL-4诱导下,体外经加入TNF-α培养7天后,可获得成熟DC。通过FACS分析,与正常第7天的DC相比,不同抗原成分冲击致敏和受到TNF-α刺激后CD40、CD80、CD86和Ia表达均可见上调。用CD11c作为检测DC纯度的标志,发现DC的纯度可以达到>95%。用ELISA法检测各实验组DC培养液上清中细胞因子的变化,PSA-DC和lysate-DC和OVA-DC组细胞因子IL-12p70和IL-1β均较non-DC组有明显的增加(P<0.05)。OVA特异性MF2.2D9肿瘤细胞检测抗DC提呈OVA可促进针对OVA增殖的肿瘤细胞明显增殖,而无关抗原并不能刺激OVA增殖克隆活化,清晰的说明DC抗原提呈功能存在抗原特异性。3.DC与CD4+T淋巴细胞混合淋巴细胞培养(MLR)显示,PSA-DC、lysate-DC组DCs刺激CD4+T细胞增殖的能力明显优于负荷无关抗原OVA-DC和non-DC组(P<0.01)。测定MLR反应中培养上清中细胞因子IL-2、IFN-r水平明显升高(p<0.01);IL-10和IL-4水平下调(p<0.05)。PSA-DC、lysate-DC组可产生针对PSA和肿瘤裂解物的DTH反应,而对无关抗原则无DTH效应。与OVA-DC, non-DC对照组相比,lysate-DC、PSA-DC组体外诱导的杀伤性T细胞对LNCaP细胞显示出较强的杀伤活性(p<0.05),且具有抗原特异性。4.建立裸鼠LNCaP前列腺癌模型。各组裸鼠皮下接种LNCaP细胞后第15天时将non-DC、OVA-DC、lysate-DC及PSA-DC各组体外诱导的CTL细胞经尾静脉过继输入,7天后重复治疗一次。治疗30天后,non-DC、OVA-DC、lysate-DC及PSA-DC各组瘤体大小分别为:152.3±7.4、45.4±6.5mm2、78.8±5.4和75.3±4.7 mm~2,存在明显差异(P<0.01)。治疗后第45天,各组瘤体大小分别为547.6±23.2、537.4±18.2、180.3±10.4和171.9±8.9 mm2,具有统计学意义(P<0.001)。non-DC、OVA-DC、lysate-DC及PSA-DC组平均生存时间分别为:44.9±5. 7、43.0±7. 2、85.6±12.1、93.5±8.9d,经log-rank分析表明,lysate-DC及PSA-DC组与对照组相比,生存时间明显延长(P<0.001)。5.建立RM-1前列腺癌小鼠模型。树突状细胞瘤苗先于7天尾静脉注入C57BL/6小鼠,导致RM-1细胞100%清除。树突状细胞瘤苗先于0天尾静脉注射,清除了50～60%(2～3/5)原发肿瘤。于0天尾静脉注射树突状细胞瘤苗,RM-1细胞接种15天后,non-DC、OVA-DC和Lysate-DC治疗组小鼠的瘤体平均直径分别为23.7±5.4mm, 22.1±4.9mm,4.3±2.6mm,说明与non-DC、OVA-DC相比,Lysate-DC能抑制肿瘤生长,统计学分析显示有显着性差异(P<0.01)。non-DC、OVA-DC组C57BL/6小鼠平均生存期分别为:15.8±2.6和16.6±3.2天,而于0天尾静脉注射Lysate-DC组平均生存期39.0±5.6天,统计学分析显示有显着性差异(P<0.01)。6. RM-1前列腺癌小鼠模型实验中采用了单抗+补体免疫去除CD4, CD8,或NK(NK1.1)细胞方法分析瘤苗治疗作用机理。实验证实去除了NK(NK1.1)细胞后,对RM-1肿瘤抑制作用降低了60%(2/5),去除CD4+T细胞RM-1抑制作用降低了20%(4/5),提示CD8+T、NK细胞在RM-1抗肿瘤免疫发挥重要作用,CD4+T细胞通过辅助CD8+T细胞而发挥作用。通过本试验证实RM-1全细胞抗原DC瘤苗可诱导保护性T细胞反应。结论:通过真核表达质粒PSA/pcDNA3.1/His-Myc(-)B的构建,可大量制备纯化的PSA蛋白。利用纯化的重组PSA蛋白冲击DC,制作DC瘤苗,体外实验证实了此种DC瘤苗具有体外抗原特异性保护功能。利用LNCaP前列腺癌裸鼠模型,验证了此种DC瘤苗体外产生的抗原特异性CTL经过继传输治疗,具有明确的抗前列腺癌作用;同时利用RM-1小鼠前列腺癌模型,验证了lysate-DC瘤苗体内抗前列腺癌的免疫治疗作用及免疫保护机制。本研究证明PSA特异性树突状细胞瘤苗具有治疗前列腺癌的潜在价值,为临床治疗提供了新选择。
才志刚[10]2004年在《冻融抗原冲击致敏的树突状细胞诱导产生肺癌特异性免疫应答的实验研究》文中提出据 1996 年世界卫生组织(WHO)报告,肺癌居各类恶性肿瘤死亡率首位。美国2001 年统计肺癌占当年所有癌症死亡率的 25%及新发癌症病例的 13%。1998 年上海市恶性肿瘤流行病学调查显示,男性和女性肺癌发病率达到 52.6/10 万和 18.2/10 万,分别占第一和第叁位。近几十年来在肺癌预防和治疗领域各国均进行了深入研究,但传统的治疗的手段仍为手术,化疗和放射治疗。尽管部分患者能通过这些疗法得到一定程度的治疗,但其缺陷仍十分明显,从总体情况看肺癌的治愈率仍较低,鉴于此,研究和发现新的治疗方法十分必要。 生物疗法的发展给肿瘤治疗带来了新的希望,在众多肿瘤的生物疗法中,免疫治疗由于能发挥患者机体自主的抗肿瘤免疫功能而备受重视,也最有希望。近年来,随着多种学科的交叉渗透,免疫学研究取得了重要进展,其中最突出的进展是对体内抗原递呈细胞(APC)研究有了深入认识。机体能对抗原异物(包括肿瘤抗原)产生免疫反应以清除这些抗原,必须通过 APC 去识别、加工、处理并将此信息提供给体内的效应细胞,因此,APC 在体内的免疫应答过程中处于极其关键的环节。以往对于哪些细胞是APC,哪些 APC 作用最关键一直存在模糊认识,这导致了肿瘤免疫和免疫治疗研究难以取得突破。近年来,对树突状细胞(DCs)研究的深入不仅使基础免疫研究取得重要进展,而且给肿瘤的免疫治疗带来了希望。树突状细胞是目前发现的最强的抗原递呈细胞,具有诱导初始免疫应答和免疫记忆应答的能力。以 DCs 为基础的肿瘤疫苗研制更成为目前研究热点之一。现有制备 DCs 肿瘤疫苗的方法很多,包括:体外肿瘤抗原直接致敏或肿瘤抗原肽基因修饰的树突状细胞疫苗;肿瘤细胞与树突状细胞融合疫苗等,这些DCs 疫苗各有特色并陆续在临床治疗中得到应用。最新临床研究显示 DCs 肿瘤疫苗在治疗黑色素瘤,B-cell 淋巴瘤,多发性骨髓瘤,肾癌,前列腺癌等肿瘤方面具有良好的临床效果。可惜的是肺癌至今未发现特异性肿瘤抗原,现有的抗原成分免疫原性低,所以相关基础与临床研究较少。本实验试图采用一些简便,安全及有效的方法对此开展研究,并希望能验证该方法具有一定的临床应用价值。考虑肺癌至今没有明确的肿瘤特异性抗原,我们采用全部肿瘤细胞的抗原负载树突状细胞;因为已证明树突状细胞可以有 第 3 页
参考文献：
[1]. 前列腺干细胞抗原致敏树突状细胞诱导前列腺癌特异性免疫反应的实验研究[D]. 刘冰. 第二军医大学. 2004
[2]. IL-13Ra2抗原肽致敏树突状细胞对人脑胶质瘤及其肿瘤干细胞的杀伤效应研究[D]. 王莹. 华中科技大学. 2013
[3]. 腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究[D]. 杨静悦. 第四军医大学. 2007
[4]. TGF-β不敏感的树突状细胞疫苗对前列腺癌的免疫治疗作用研究[D]. 王福利. 第四军医大学. 2007
[5]. IL-15基因联合肿瘤抗原修饰树突状细胞抗前列腺癌的实验研究[D]. 田子农. 苏州大学. 2009
[6]. 大肠癌患者自体树突状细胞免疫治疗技术临床应用研究[D]. 鲍传庆. 苏州大学. 2010
[7]. 前列腺癌细胞裂解物致敏树突状细胞诱导特异抗瘤作用研究[D]. 邵斯亮. 山东大学. 2006
[8]. AFP与突变型P53融合基因转染CD34～+造血干细胞来源的树突状细胞诱导抗肝癌细胞特异性免疫反应[D]. 贾军. 第四军医大学. 2005
[9]. PSA特异性树突状细胞瘤苗治疗前列腺癌的实验研究[D]. 徐丹枫. 第二军医大学. 2004
[10]. 冻融抗原冲击致敏的树突状细胞诱导产生肺癌特异性免疫应答的实验研究[D]. 才志刚. 第二军医大学. 2004
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