郑瑞英[1]2000年在《抗多囊蛋白-1单克隆抗体的制备及在ADPKD发病机理研究中的应用》文中提出多囊蛋白-1(polycystin-1)是多囊肾病1(polycystic kidney diseasel，PKD1)基因的编码蛋白，85%的常染色体显性遗传 型多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease， ADPKD)的发生系多囊蛋白-1异常所致。据PKD1 基因的核 苷酸序列推算，多囊蛋白-1为一跨膜大分子蛋白，由胞外区、 跨膜区以及胞内区三部分组成。 迄今为止尚未得到完整分子的多囊蛋白-1，因多囊蛋白-1 胞内区为 PKD1基因单拷贝区所编码，不存在与其它蛋白具有 同源性的问题，且此区具有重要功能，所以我们选择了胞内 区作为研究对象。本研究首先克隆出 PKD1基因编码胞内区 cDNA片段，然后在原核细胞中表达该蛋白片段，并以重组蛋 白为抗原，制备了该蛋白的单克隆抗体，最后利用该抗体研 究了多囊蛋白-1在组织和细胞中的表达及分布情况，结合细 胞外基质在ADPKD中的变化，初步探讨了ADPKD可能的发 病机理。本研究由四部分内容组成。 一、多囊蛋白-1胞内段的重组表达及纯化 设计 DNA引物片段，并于引物两端添加 EcoR I和 Sal I 酶切位点，采用 PCR法扩增PKD1基因编码多囊蛋白-1胞内 段cDNA片段后，连接到pGEM-T载体上，再经双酶酶切后， 插入到融合蛋白表达载体pProEX Hta 中，构建多囊蛋白-1胞 内段表达载体，DNA测序证实该表达载体含PKD1基因。cDNA 第12473至13120核苷酸序列，编码多囊蛋白-1胞内段第4088 3至 4302位氨基酸，共 215个氨基酸，阅读框架正确。表达载体经大肠杆菌表达后，蛋白电泳显示其编码的融合蛋白以可溶形式存在，蛋白薄层扫描发现融合蛋白占菌体总蛋白的23．9％。菌体裂解液经NiNTA亲和层析柱纯化后，纯化产物在聚丙烯酚胺凝胶电泳上表现为一分子量为 26 kDa的单一条带，蛋白质兔疫印迹法证明该蛋白为多囊蛋白1 胞内段。至此，我们成功地表达、纯化了多囊蛋白l 胞内段，为研究多囊蛋白l和制备抗多囊蛋白刁单克隆抗体提供了基础。二、抗多囊蛋白＜单克隆抗体的制备 将纯化的融合蛋白常规免疫Balb屹 小鼠，取脾细胞在聚乙二醇叩00的诱导下与肥刀0骨髓瘤细胞融合，＊AT选择性培养系统筛选出融合细胞，用酶联免疫吸附试验(间接法)检测分泌抗多囊蛋白刁 胞内段抗体的杂交瘤细胞，取阳性者以多次有限稀释法进行克隆化培养，得到稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株4株，兔疫双扩散法测得单克隆抗体亚型均为IgG。。型。将杂交瘤细胞接种于同系小鼠腹腔，诱生腹水。用间接ELISA法测得杂交瘤细胞的培养上清抗体效价为 1：10’左右，腹水抗体效价为 1：10＼ 小鼠血清抗体效价为 1：10＼ 至此我们得到了能稳定分泌抗多囊蛋白4 胞内段单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为研究ADPKD提供了一个有用的工具。三、多囊蛋白l在组织和细胞中的分布 用自制的抗多囊蛋白4 单克隆抗体，采用标准EnVision兔疫组织化学方法，检测多囊蛋白J 在胎肾组织、正常成人肾组织、多囊肾组织和原代培养的囊肿衬里上皮细胞中的表达及分布情况。结果发现多囊蛋白4 亚细胞分布为胞浆性，不存在细胞极性，这进一步证实多囊蛋白4 的C末端为胞内段。同时发现多囊蛋白4 的表达在胎肾中表达明显，在正常 4成人肾组织表达量降低，提示多囊蛋白l 可能参与发育调节；在胎肾组织中仅表达于肾小管，正常成人肾组织表达见于近端小管、远端小管、集合管和肾小囊部分壁层上皮细胞，多．囊蛋白l 的表达与肾囊肿的发生部位一致。在多囊肾组织的囊肿衬里上皮细胞以及体外培养的囊肿衬里上皮细胞中多囊蛋白J表达高于正常成人肾小管上皮细胞，可能是多囊蛋白上受负反馈机制影响表达上调的结果。四、ADPKD中细胞外基质的变化 采用标准EnVision法，分别检测I型胶原、IV型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白在胎肾、正常肾脏和 ADPKD中的表达。结果发现细胞外基质在胎肾中表达最高，正常成人肾组织表达降低。与正常成人肾组织相比，多囊肾组织中，I型胶原、IV型胶原、纤连蛋白、层连蛋白的表达均显著增加，I型胶原主要分布于囊肿与囊肿之间的间质中，IV型胶原、纤连蛋白。层连蛋白分布于围绕囊肿的基底膜中，这说明在ADPKD中，细胞外基质发生了改变。提示多囊蛋白4介导的转录因子AP－1调节途径失调引起细胞外基质的异常，影响了肾小管上皮细胞的增生、分化、粘附、迁徙和基因表达，引起并促进了肾囊肿的发生和发展。值得一提的是，我们还发现波形蛋白在ADPKD囊肿上皮细胞中的表达增加，说明囊肿上皮细胞分化不良。 综上，本研究重组表达和纯化了多囊蛋白l胞内段，制备成功抗多囊蛋白l单克隆抗体，利用兔疫组织化学方法观察了多囊?
关天俊[2]2006年在《多囊蛋白-1氨基段融合蛋白对大鼠肾小球系膜细胞增殖与凋亡作用的研究》文中进行了进一步梳理目的 多囊蛋白-1(PC-1)的功能异常在ADPKD的发病中起重要作用，本文观察PC-1氨基段多肽(PC-1NF)融合蛋白对大鼠系膜细胞增殖和凋亡的影响。方法 应用的技术包括BrdU-ELISA、Annexin V／PI染色、透射电镜、实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术、免疫细胞化学和Western blot等。结果PC-1NF融合蛋白可通过PKCa信号转导通路，抑制细胞周期调控基因Cyclin D1、促进P21~(wafl)的表达，抑制细胞通过G_1-S期调控点，从而抑制大鼠系膜细胞增殖及细胞外基质合成；PC-1NF融合蛋白可通过上调促进凋亡基因Bax和下调抑制凋亡基因Bcl-2而诱导大鼠系膜细胞凋亡并上调促进细胞外基质降解的MMP2和抑制细胞外基质降解的TIMP1之间的比值，促进细胞外基质降解。结论PC-1NF融合蛋白能抑制大鼠系膜细胞增殖、诱导细胞凋亡及减少细胞外基质合成。
参考文献：
[1]. 抗多囊蛋白-1单克隆抗体的制备及在ADPKD发病机理研究中的应用[D]. 郑瑞英. 第二军医大学. 2000
[2]. 多囊蛋白-1氨基段融合蛋白对大鼠肾小球系膜细胞增殖与凋亡作用的研究[D]. 关天俊. 第二军医大学. 2006