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摘要：为了解不同浓度的重金属Cu2+对水生动物的超氧化物歧化酶（SOD)、过氧化氢酶（CAT）活性和脂质过氧化的影响，以文蛤为研究材料，采用室内模拟实验的方法，依据Cu2+对文蛤96h半致死浓度（LC50），设置四个Cu2+胁迫组，胁迫浓度分别为96h LC50的1/8(0.015mg/L)、1/4(0.03mg/L)、1/2(0.06mg/L)和0.1mg/L，并设置对照组，每组三个平行。研究了不同浓度的Cu2+对文蛤鳃组织SOD、CAT活性和MDA含量的影响。结果显示：文蛤鳃组织中SOD活性在不同浓度的Cu2+胁迫下，都呈现诱导－抑制趋势，肝脏组织中SOD活性变化幅度不大；两种组织中CAT活性均呈现诱导－抑制效应，Cu2+对MDA的诱导作用显著且存在剂量-效应关系。
关键词：生态毒理学；Cu2+；文蛤鳃组织；SOD；CAT ；MDA
0 引 言
Cu2+是水环境中主要重金属污染物之一，可通过多种途径进入生物体细胞，直接或间接参加生物体内的生化反应，造成机体器官的病变和功能的丧失[1]，严重威胁着水生动物生存和繁衍。Cu2+等重金属离子进入机体后，可以诱发机体产生大量活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)，攻击生物膜上较易氧化的多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)，引起脂质氧化，改变膜的通透性和流动性，最终导致细胞损伤和死亡[2]。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是细胞脂质过氧化的一个重要的生物学指标，能够间接地反应细胞损伤程度[3]。SOD、CAT与MDA活性或含量由于环境污染的胁迫会发生改变，因而可间接反映环境中氧化胁迫的存在，作为环境胁迫的指标[4]。
国内外关于持久性有机污染物对鱼类和贝类抗氧化酶活性影响研究较多[7-8]，而关于重金属对文蛤抗氧化酶活性及脂质过氧化的影响研究尚未见报道。文蛤（Meretrix meretrix）是我国沿海地区一种重要的经济贝类，分布广泛，具有很高的经济价值和研究价值。本文在急性毒性实验的基础上，通过研究不同浓度的Cu2+对文蛤鳃组织中SOD、CAT活性和MDA含量影响，探讨Cu2+对文蛤鳃组织抗氧化酶的毒性影响及作用机制，寻求以文蛤鳃组织中SOD、CAT和MDA作为监测重金属污染生物标志物的可行性，为海洋重金属污染早期预警监测提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
文蛤采自山东省东营市近岸海域，经室内玻璃水族箱(60cm×50cm×40cm)暂养7天，期间定期投喂三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和小新月菱形藻(Nitzschia closterium)等饵料，持续充气，每日换水一次，实验前一天停止喂食。选择个体均匀、健壮、壳长53.11±7.96mm，湿体重45.73±6.45g的文蛤进行实验。
1.2 实验环境及药品
实验用海水经砂滤、净化、曝气处理。盐度31.76±0.25，pH 8.0±0.2，水温 18±2℃，溶解氧7.45±0.14mg/L，实验期间微量充气。药品CuSO4·5H2O(AR) 为国药集团化学试剂有限公司产品，用超纯水配制成Cu2+质量浓度为10g/L母液。SOD测试盒、CAT测定试剂盒（可见光法）、蛋白定量测试盒（考马斯亮蓝法）和微量MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.3 实验方法
1.3.1 实验设计
根据静态急性毒性实验结果， Cu2+对文蛤96h半致死浓度（LC50）为0.12mg/L。依据LC50的1/8、1/4、1/2和0.1mg/L，设置4个浓度组和1个对照组，每个实验组设置3个平行。胁迫时间为24h、48h、72h、96h。
实验在60cm×50cm×40cm玻璃水族箱中进行。实验之前，先用相应的镉离子溶液浸泡水族箱24h，实验时每个水族箱加入40L海水和不同浓度的Cu2+母液，使各组的Cu2+浓度达到相应的胁迫浓度，对照组加过滤的海水。各实验组均随机放入文蛤30个，期间不投饵，微量充气，严格控制实验环境，避免外界因素强烈刺激。胁迫24h、48h、72h、96h时，分别从各个实验组中取出两个文蛤，迅速取出鳃组织放入1.5ml的塑料管中，每个文蛤取两个平行试样，做好标记，密封保存在-20℃的冰箱中。
1.3.2 组织酶液制备
试样在4℃环境下解冻，用4℃生理盐水（含0.7%Nacl和0.03%Kcl）冲洗一遍，吸干表面水分，称重。按照1：9（m:v）比例加入生理盐水，在冰水浴中手工研磨，制成组织匀浆液。将制备好的组织匀浆液在4℃环境条件下、4000rP离心10min，取上清液进行测定。
1.3.3 酶活性和MDA含量测定
按照试剂盒说明书规定的操作方法进行测定。SOD酶活性单位定义：在反应体系中，每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）；CAT酶活性单位定义：在反应体系中，每毫克组织蛋白每秒钟分解1μmol的H2O2的量为一个活力单位（U）。MDA含量测定方法为TBA[9]法。
1.4 数据处理
实验数据用统计学方法进行分析处理，选用SPSS17.0软件对同一胁迫时间内胁迫组与对照组间的差异显著性进行单因素方差分析，P<0.05为显著性差异；P<0.01为极显著性差异，结果用“平均数±标准差”表示。
2 实验结果
2.1 不同浓度的Cu2+对文蛤鳃组织中SOD活性影响
注：“*”表示处理组与对照组差异显著（P<0.05）；“**”表示处理组与对照组差异极显著（P<0.01） 下同
Note: “*” means spike group is significantly different from control group（P<0.05）; “**” means spike group is very significantly different from control group（P<0.01） the same below
图1 铜离子溶液与文蛤鳃组织SOD酶活性的剂量-时间效应
Fig .1 Dose-time effect between SOD activity in gill tissues of Meretrix meretrix and Copper ion fluid
图1显示了文蛤鳃组织SOD活性在不同浓度Cu2+胁迫下变化趋势。在胁迫24h后，各胁迫组文蛤鳃组织SOD活性均受到诱导作用，其中中浓度组（0.06mg/L）和高浓度组（0.1mg/L）鳃组织SOD活性显著升高(P<0.05)。在胁迫48h时，中浓度组（0.06mg/L）和高浓度组（0.1mg/L）鳃组织SOD活性受到极显著性诱导作用（P<0.01）。在胁迫后期（48h-96h），各胁迫组鳃组织SOD活性均受到抑制效应，其中中浓度组（0.06mg/L）和高浓度组（0.1mg/L）与对照组呈现显著性差异（P<0.05）。
2.2 不同浓度的Cu2+对文蛤鳃组织CAT活性的影响
图2.铜离子溶液与文蛤鳃组织CAT酶活性的剂量-时间效应
Fig.2. Dose-time effect between CAT activity in gill tissues of Meretrix meretrix and Copper ion fluid
图2显示了各个实验组在96h内，为文蛤鳃组织CAT活性在不同浓度Cu2+胁迫下变化趋势。胁迫24h后，各胁迫均呈现出诱导效应，其中中浓度组（0.06mg/L）受到诱导作用较为显著（P<0.05）。在胁迫72h后，中浓度组（0.06mg/L）和高浓度组（0.1mg/L）则受到抑制作用，CAT活性降低，当胁迫时间达到96h时，高浓度组（0.1mg/L）鳃组织CAT活性急剧降低，且与对组呈现显著性差异（P<0.01）。
2.3 不同浓度的Cu2+对文蛤鳃组织MDA含量的影响
图3.铜离子溶液与文蛤鳃组织MDA含量的剂量-时间效应
Fig.3. Dose-time effect between the content of MDA in gill tissues of Meretrix meretrix and Copper ion fluid
图3显示了文蛤鳃组织MDA含量在不同浓度Cu2+胁迫下变化趋势。在胁迫24h后，各胁迫组鳃组织MDA含量没有明显的升高；在胁迫48h-96h期间，各胁迫组鳃组织MDA含量均升高，其中中浓度组（0.06mg/L）和高浓度组（0.1mg/L）鳃组织MDA含量在Cu2+持续胁迫下，显著升高并与对照组有显著性差异（P<0.01）。
3 讨论
重金属污染物进入水生动物体内，在生物体内能够直接或间接诱导产生活性氧自由基，这些活性氧自由基可以攻击生物体内的大分子，引起蛋白酶失活、DNA的损伤、脂质过氧化等一系列的细胞伤害。在正常的生理条件下，生物体内产生的活性氧自由基可以由生物体内抗氧化防御系统控制，其在体内的浓度极低，并具有一定的生理作用，但在外界环境刺激下（如重金属离子的氧化胁迫），活性氧自由基大量生成，导致其产生和消除失去平衡[10]。这必然会引起抗氧化酶系统中相关酶活性敏锐的变化，酶活性被认为是一种能够快速而灵敏的反应环境胁迫对生物体影响的生化指标[11-12]。这在理论上，为我们提供了一种利用抗氧化酶活性来监测环境中各种污染物的可能性。
SOD是生物体内唯一一种以活性氧自由基为底物的抗氧化酶，其底物是O2－，其生化反应方程式：2O2－+2H+→H2O2+O2[4]。生物体合成SOD往往受到O2－浓度的影响[13]。当生物体受到较弱的环境胁迫时，SOD活性有所升高，而当环境胁迫超过限度时，SOD活性会急剧下降。这与本实验的结果很相似。本实验中，两个低浓度组在实验前期阶段（24h-48h），SOD的活性不同程度地有所升高，特别是低浓度组，在48h时显著高于对照组。而随着胁迫时间的延长，在胁迫72h后，SOD活性迅速下降；中浓度组和高浓度组中，SOD活性在整个胁迫实验过程中，一直处于下降状态。Cd2+胁迫，诱导产生活性氧自由基，激活了文蛤机体抗氧化酶系统，低浓度（0.41mg/L）前期毒性效应在机体的抗氧化系统和解毒机制的作用没有显现，反而诱导产生的活性氧自由基在一定程度上诱导了各种抗氧化酶活性，如SOD活性在实验48h后，显著升高。当外界环境中Cd2+浓度达到1.65mg/L时，文蛤机体内抗氧化酶系统和解毒机制无法迅速解除面临的氧化胁迫压力，导致抗氧化酶活性受到抑制。0.41mg/LCd2+持续的胁迫，造成文蛤鳃组织中活性氧自由基动态平衡长时间失衡，活性氧自由基过量累积，同样会造成SOD活性的下降。在实验前期，低浓度诱导，高浓度抑制的现象在很多相关研究中都出过。江天久等[14]研究重金属胁迫对近江牡蛎（Crassostrea rivularis）SOD活性影响时发现，低浓度组Cu2+、Pb2+和Zn2+在设定试验时间内都对SOD酶活性有诱导作用，相反地，高浓度组有抑制作用。国外也有相关的研究，Rashmi Chandran等[15]研究重金属Cd2+和Zn2+对褐云玛瑙螺（Achatina fulica）抗氧化酶活性影响时报道，低浓度组对消化道组织中SOD有微弱诱导作用，高浓度组有显著抑制效应。出现这一规律的理论依据，至今还没有定论，但有些研究人员[17]提出的“毒物兴奋效应”和“毒物抑制效应”的理论已被广泛接受。他们认为低剂量的毒物进入体内，诱导产生活性氧自由基，这些自由基加速了生物体内SOD的合成，导致其活性相应地升高；而当生物体内活性自由基的量超过SOD清除能力时，活性氧自由基开始攻击生物大分子以及细胞结构组织，造成SOD活性的下降，甚至失活。此外，SOD活性下降可能存在其他的原因，SOD存在多种同工酶，但实验测定时，主要是Cu-Zn SOD，Cd2+可以置换SOD活性中心的金属离子或者结合相关巯基基团，导致其失活[18]。
CAT是在抗氧化防御系统内与SOD紧密联系的抗氧化酶，SOD催化活性氧自由基生成H2O2，如果没有CAT，H2O2将在生物体内大量聚集，最终依然会形成氧化胁迫，造成机体伤害[19]。CAT可以将H2O2转化成H2O和O2，解除H2O2形成的氧化胁迫。因此，CAT活性与SOD活性的变化趋势有一定的相关性[12]。本实验中，在实验前期，中高浓度组中CAT活性受到诱导，低浓度组中CAT活性下降，而在同一浓度组同一时间段内，SOD活性却逐渐上升到最大值，随暴露时间的继续延长，CAT活性持续上升，并达到最大值。造成这种低浓度开始阶段抑制，接着呈现诱导效应的现象，主要有两方面的原因，一方面是由于生物体内存在CAT的代偿机制[20]。研究表明，活性氧自由基的歧化反应不是H2O2的唯一来源，H2O2还可以由氨基酸或细胞色素P450氧化酶所催化的生化反应中产生；一方面由于SOD活性升高，催化分解的H2O2浓度短时间突然增高，抑制了CAT活性。随着胁迫时间的延长，各个实验组CAT活性逐步下降。CAT与SOD的分子结构有所不同，两者的中毒机制不尽相同。造成CAT活性下降的作用机制可能是高浓度活性氧自由基的缘故。
本实验中，Cu是生物体必须的一种微量元素，在机体代谢过程中起到重要的作用，但当其浓度超过一定的限度时，会对机体造成毒害作用。在双壳贝类体内，鳃组织是Cu2+聚积的主要位置。因此，Cu污染胁迫首先可能会对文蛤鳃组织各种机能造成影响。在本次Cu2+胁迫试验中，鳃组织中SOD活性首先受到影响，高浓度组（0.1mg/L）和中浓度组（0.06mg/L）中鳃组织SOD活性显示诱导—抑制的过程。在低浓度组（0.015mg/L）和次低浓度组（0.03mg/L）胁迫下，文蛤组织的MDA含量没有明显升高，主要由于0.015mg/L和0.03mg/L的Cu2+引起的氧化胁迫，没有对文蛤免疫系统造成严重损伤。在中浓度组（0.06mg/L）和高浓度组（0.1mg）胁迫下，文蛤两种组织中MDA含量呈现极显著的升高。这说明浓度为0.06mg/L和0.1mg/L的Cu2+可以造成文蛤两种组织严重的脂质过氧化。
4 结论
研究表明，Cu2+各实验浓度，均对文蛤鳃组织中SOD、CAT活性和MDA产生影响。在0.06mg/L和0.1mg/L的Cu2+胁迫下，文蛤组织中SOD、CAT活性受到显著影响，MDA含量显著升高，Cu2+浓度越高，MDA含量达到最大值的时间就越短。文蛤鳃组织的MDA作为指示水环境Cu2+污染的生物标记物具有潜在的可行性。
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论文作者:张宜奎
论文发表刊物:《防护工程》2019年第6期
论文发表时间:2019/7/1
标签：文蛤论文; 活性论文; 浓度论文; 组织论文; 活性氧论文; 诱导论文; 自由基论文; 《防护工程》2019年第6期论文;