范毅[1]2002年在《医用电泳胶片图像检测系统的研究》文中研究表明利用特殊条件下、特殊技术手段获得的医学图像上载有的信息对患者进行病理分析，是临床医学中经常使用到的一种有效手段。它在现代医学领域中得到越来越广泛的应用。随着科学技术水平的不断提高和医疗手段的不断进步，医疗设备也在不断地向着自动化、现代化的方向发展。目前，我国在医学图像信息提取方面还存在诸多不足，医学图像信息的提取大部分仍靠人眼观察获得，可以想象，由于种种外界因素和人为主观因素的干扰，在这个过程中就很有可能带来一些错误，会给医疗诊断带来不利影响。为了改善这种情况，研制一种高效、稳定、精确、自动化的医学图像检测系统就成为一项具有现实意义的紧迫任务。 本文从实际出发，选择了一种在临床医学中常用到的电泳胶片为研究对象。通过理论分析并结合实际情况，确定了利用光学摄像系统，图像处理与图象识别技术，自动检测电泳胶片上几种重要参数的方案。研制出了一套集光电技术、计算机技术、图像处理和识别等多种技术手段于一体的电泳胶片自动检测系统。该系统测试精度和自动化程度高，较好地解决了电泳胶片图像检测手段的不足之处。同时，也为医学图像检测手段的现代化提供了一个切实可行的方案。
刘春毅[2]2015年在《基于冷阴极X射线源的脉冲式线扫描系统的研究》文中研究指明X射线成像技术在医疗诊断、安全检查和工业探伤等领域已经有了非常成熟的应用。现在X射线成像技术向着微焦点和低辐射剂量的方向发展。传统的X射线源采用的是灯丝的热电子发射,其在电子发射尺寸、电子发射温度以及电子发射的精确控制方面已经不能满足新一代X射线成像设备的要求。碳纳米管作为一种新型的电子发射源,其不需要加热、尺寸加工到很小以及场致发射的精确可控,使其成为替代热灯丝作为X射线源的理想材料。传统的热灯丝X射线源,由于需要对灯丝进行加热才能产生热电子发射,所以其在发射过程中一般处于持续工作模式。然而在X射线线阵扫描成像系统内,持续工作的X射线源产生了很多不必要的X射线辐射。利用碳纳米管作为阴极制作的冷阴极X射线源,可以通过控制栅极电压的方式来控制整个射线源处于快速脉冲式工作状态。这样,既可以减少不必要的X射线辐射,又能降低整体射线源能耗,延长X射线管寿命。为了搭建脉冲式工作的冷阴极X射线线扫描系统,本文首先研究并设计并制作了脉冲式工作的冷阴极X射线源,其中包括基于碳纳米管场发射的冷阴极X射线管以及栅极高压脉冲电源,最后整合成脉冲式冷阴极X射线源,并进行快速脉冲成像测试。利用此冷阴极X射线源,本文设计并搭建了脉冲式工作模式的冷阴极X射线线扫描成像系统。其中包括同步脉冲工作的X射线线阵探测电路设计以及脉冲式成像系统的搭建。在完成系统搭建之后,测试了系统的总体辐射剂量和成像效果并与热灯丝X射线源进行对比,结果表明基于脉冲式工作模式的冷阴极X射线线扫描系统的辐射剂量比持续工作的热灯丝X射线源的辐射剂量降低了70%左右。此结构可以应用到现在的X射线安检设备当中,同时也是经过改进可以应用到CT系统中,为冷阴极X射线源的应用奠定了基础。
张清玲[3]2008年在《嗜酸粒细胞性支气管炎与支气管哮喘气道炎症特征的比较及相互关系探讨》文中研究说明研究背景和目的:嗜酸粒细胞性支气管炎(eosinophilic bronchitis,EB)是慢性咳嗽的主要原因。诱导痰和气道粘膜病理检查表明,EB同样存在以嗜酸性粒细胞为主的多种炎症细胞浸润。但EB为何缺乏气道高反应性,EB是否会发展为气道高反应性或支气管哮喘(bronchial asthma)?本研究通过观察EB的临床特征及免疫病理特征,分析其与支气管哮喘患者的差异。同时,通过研究EB和哮喘支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)细胞蛋白质组双向电泳表达谱,找出表达差异蛋白,为筛选气道高反应性和气流可逆性阻塞相关的特异蛋白、探讨哮喘气道高反应性和气流可逆性的发病机制奠定基础。在此基础上,探讨建立缺乏气道高反应性的EB动物模型的可能性和途径,试图从动物实验进一步深入研究EB和哮喘的关系,为支气管哮喘的早期干预寻找新的靶点。结果及结论:1. EB和哮喘的气道炎症病理特点相似,涉及多种炎症细胞,包括嗜酸性粒细胞(eosinophil,Eos)、T淋巴细胞和肥大细胞等,但EB的气道炎症程度较哮喘轻,炎症范围更为局限。2.双向电泳图像对比分析表明,EB与哮喘之间BLAF细胞蛋白表达存在一定的差异。本研究成功鉴定了EB、哮喘之间的2个差异表达蛋白,其中谷胱甘肽-S-转移酶T1(glutathione-S-transferase T1,GSTT1)可能与气道反应性的发生机制密切相关。3.初步成功建立了具有明显的Eos气道炎症、但无气道高反应性的BALB/c小鼠EB模型,为进一步了解EB的气道炎症及气道高反应性的发生机制奠定了基础。第一部分:嗜酸粒细胞性支气管炎与支气管哮喘患者免疫病理特征的比较目的:了解EB气道的病理学特征,比较其与支气管哮喘气道炎症的异同。方法:对20例EB、24例支气管哮喘和10例正常人进行诱导痰检查,分析诱导痰的细胞分类;经支气管纤维镜支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage,BAL),分析BALF的细胞分类;于隆突、左舌叶开口、右下叶前段取支气管粘膜活检,光镜下观察活检标本的病理结构特征,测量气道上皮粘膜的基底膜厚度,通过免疫组化技术,观察气道粘膜上皮层和上皮下层炎症细胞(Eos、肥大细胞、T淋巴细胞)的分布情况并计算其细胞分布密度。实验结果中的计量资料用中位数表示,组间比较采用非参数秩和检验。结果:1. EB组痰Eos百分率[10.13%(20.19)]显着低于哮喘组[26.00%(32.97)](P<0.05)。EB组和哮喘组诱导痰Eos百分率均显着高于对照组[0.25%(0.50)](P<0.001)。2. EB组BALF的Eos百分率[1.63%(3.81)]显着低于哮喘组[11.75%(15.70)](P<0.001),EB组和哮喘组BALF的Eos百分率均显着高于对照组[0.38%(1.00)(P<0.05)。3.哮喘组舌叶开口支气管粘膜基底膜厚度[4.73μm(2.61)]显着大于正常对照组[3.23μm(1.35)](P<0.001)和EB组[3.41μm(1.89)](P<0.01),但EB组和正常对照组之间无差异(P>0.05)。哮喘组右下叶前段支气管粘膜基底膜厚度[5.36μm(3.65)]显着大于EB组[3.53μm(3.18)](P<0.05)。)4.比较舌叶支气管粘膜上皮下层的Eos分布密度,哮喘组[8.91个/mm2 (52.88)]显着高于EB组[0.00个/mm2 (10.40)]和正常对照组[0.00个/mm2 (0.00)](P<0.05)。5.比较舌叶支气管粘膜上皮层的淋巴细胞分布密度,EB组[475.76个/mm2(244.75)]和哮喘组[583.29个/mm2(507.69)]显着高于正常对照组[260.71个/mm2(430.31)] ,而EB和哮喘组差异无显着性(P>0.05)。6.比较舌叶支气管粘膜的肥大细胞分布密度:在粘膜上皮层,EB组[168.80个/mm(2314.28)]和哮喘组[252.78个/mm(2545.68)]显着高于正常对照组[0.00个/mm2(13.61)];在粘膜上皮下层,EB组[218.44个/mm2(383.65)]和哮喘组[197.22个/mm2(208.54)]显着高于正常对照组[66.07个/mm2(45.92)];而EB和哮喘组差异无显着性(P>0.05)。结论:EB和哮喘的气道炎症病理特点相似,涉及嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞和肥大细胞等多种炎症细胞,但EB的气道炎症程度较哮喘轻,炎症范围更为局限。第二部分:嗜酸粒细胞性支气管炎与支气管哮喘分子生物基础差异的初步探讨研究背景和目的:在前面的研究中,我们发现EB和哮喘气道炎症病理尽管有很多相似的地方,但也有明显的差异。支气管肺泡灌洗液能够比较直接和客观地反映气道炎症的变化,被认为是蛋白组学研究气道炎症性疾病的理想样本。本实验的目的是利用比较蛋白质组学方法,探讨EB与支气管哮喘差异的分子生物学基础,以筛选鉴定与气道高反应性、气流可逆性阻塞相关的特异蛋白。方法:收集EB 5例、哮喘和正常人各6例,经纤维支气管镜于右中叶行支气管肺泡灌洗取得BALF,提取BALF细胞总蛋白质后,利用固相pH梯度(immobilized pH gradient, IPG),双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)对总蛋白进行分离,然后行硝酸银染色,予ImageMaster 2D Elite 5.0分析软件进行凝胶图像分析,寻找EB、哮喘和正常对照组差异表达的蛋白质。应用基质辅助电离解析飞行时间质谱(matrix-assitsted laser desorption / ionization time–of -flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)获得蛋白质的肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint, PMF),再通过MALDI-TOF/TOF-MS串级质谱对蛋白质进行序列分析,得到蛋白质二级质谱图。最后利用Mascot软件搜索NCBInr蛋白质数据库,将获得的肽段信息进行对比分析,明确是何种蛋白质。结果:双向电泳图像对比分析表明,EB、哮喘和正常对照组BLAF细胞蛋白表达有一定的差异。各蛋白斑点经质谱检测肽质量指纹谱与标准分子量、等电点对照分析鉴定出2个蛋白,分别为铁蛋白(ferritin, light polypeptide)和谷胱甘肽-S-转移酶T1(glutathione-S-transferase T1,GSTT1),其中铁蛋白在哮喘组表达上调。EB组中GSTT1高表达,而83.3%哮喘患者和33.3正常对照不表达GSTT1。结论:1.电泳图像对比分析表明,EB与哮喘之间BLAF细胞蛋白表达存在一定的差异。2.成功鉴定了EB和哮喘之间的2个差异表达蛋白,其中GSTT1可能与气道反应性的发生机制密切相关。第叁部分嗜酸粒细胞性支气管炎动物模型的建立及其与哮喘动物模型的气道炎症的比较分题1小鼠气道反应性方法的建立目的:建立过敏性小鼠气道反应性检查的正确方法。方法:采用SPF级BALB/c雌性小鼠,通过OVA致敏和激发的方法建立过敏性气道炎症模型(下称OVA组,n=36),第0、7、14d分别给予10μg OVA+1.3mg Al(OH)3生理盐水混悬液200μl腹腔注射致敏,第28d予100ug OVA滴鼻激发。生理盐水作为正常对照(下称NS组,n=36)。根据肺功能检查方法的不同再细分为4组:无创OVA组,无创NS组,有创OVA组,有创NS组,每组18只。气道反应性检查采用Buxco公司有创肺功能检查系统(“RC”系统)及无创肺功能检查系统(“Penh”系统)。激发24小时(第29天)后,以吸入倍增浓度的乙酰甲胆碱(methacholine ,Mch)雾化液[浓度依次为0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50(mg/ml)检查小鼠的气道反应性。有创检查时,以肺阻力(lung resistance,RL)为观察指标,通过药物的剂量-反应曲线来评价动物的气道反应性。无创检查时,以Penh为观察指标,通过药物的剂量-反应曲线及Penh较基础值上升100%、200%的吸入Mch的浓度(Penh200、Penh300)来评价动物的气道反应性。检查BALF细胞学分类和上气道、肺组织病理改变。另予0.3mM,3.0mM和30mM组织胺对OVA和NS组进行鼻组胺激发试验,每次激发后,观察10分钟内小鼠的打喷嚏和擦鼻次数,通过药物的剂量-反应曲线比较两组的差异。结果:1.OVA组及NS组Penh%,RL%均有随Mch浓度升高而增加的趋势,吸入浓度为6.25、12.5、25mg/ml的Mch时,无创OVA组Penh%显着高于无创NS组(P<0.05 ),且Penh200、Penh300显着低于无创NS组(P<0.001)。而有创OVA组气道反应性与有创NS组无显着差异(P>0.05 )。2.OVA组BALF中性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分率显着高于NS组(P<0.01)。与NS组比较,OVA组肺组织炎症改变明显(P<0.01)。而无创OVA组BALF的Eos百分比[(27.06±12.05)%]和细胞总数[(2.69±0.55)×105/ml)]与有创OVA组[(25.33±10.79)%,(2.86±0.55)×105/ml)]无显着差异,两组下呼吸道组织病理评分亦无显着差异(P>0.05 )。3.鼻组胺激发试验显示,在30mM组织胺浓度时,OVA组擦鼻次数[(73.00±28.30)次]显着高于对照组[(43.40±34.07)次](P<0.05 )。OVA组上呼吸道病理检查显示上呼吸道轻度Eos炎症改变。结论:1.无创检查法较有创检查法对同一气道过敏疾病模型气道反应性的结果不相一致,其原因可能是模型气道炎症程度较轻,无创检查法受到上呼吸道阻力增加的影响所致。2.首次检查小鼠过敏性气道炎症模型气道反应性时,建议先用有创检查方法进行确定。分题2嗜酸粒细胞性气道炎症的小鼠模型的建立目的:通过调节抗原激发的时间、途径和剂量,建立无气道高反应性的BALB/c小鼠EB模型。方法:56只BALB/c雌性小鼠,分为4组:气道过敏雾化组(下称OVA-雾化组,n=8)、气道过敏1次滴鼻组(下称OVA 1次滴鼻组,n=12)、气道过敏2次滴鼻组(下称OVA 2次滴鼻组,n=8)、生理盐水对照组(下称对照组, n=28)。致敏方法同前。OVA-雾化组第28d予1%OVA雾化30分钟激发;OVA-1次滴鼻组第28天予100ug OVA滴鼻激发;OVA-2次滴鼻组第28d,第29天各予100ug OVA滴鼻激发。对照组因各模型组致敏、激发时间采用生理盐水进行致敏和激发。最后一次激发24小时后,有创检查法测定动物的气道反应性,并观察气道炎症情况。结果:1.气道反应性的测定:激发24小时后,各组RL%均有随Mch浓度升高而增加的趋势。在吸入浓度为0.39-50mg/ml的Mch时,OVA 1次滴鼻组和OVA雾化组RL%较对照组无显着性差异(P > 0.05);在吸入浓度为25mg/ml的Mch时,OVA 2次滴鼻组RL%显着高于对照组(P < 0.05)。2.各模型组巨噬细胞百分率显着低于对照组(P<0.05),而中性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分率和淋巴细胞百分率显着高于对照组(P<0.05)。3. OVA雾化组巨噬细胞百分率显着高于OVA1次滴鼻组和OVA 2次滴鼻组(P<0.01,P<0.001),而嗜酸性粒细胞百分率[(7.40±3.41)%]显着低于OVA 1次滴鼻组[(25.33±10.79)%]和OVA 2次滴鼻组[(39.73±6.02)%](P<0.01,P<0.001)。结论:通过调节抗原激发的时间、途径和剂量,本实验初步成功建立了具有明显的Eos气道炎症、但无气道高反应性的BALB/c小鼠EB模型,为进一步研究EB的气道炎症及气道高反应性的发生机制奠定了基础。分题3嗜酸粒细胞性支气管炎动物模型的气道炎症及其与哮喘动物模型的比较目的:观察BALB/c小鼠EB模型的气道炎症特征并比较其与哮喘动物模型的气道炎症的差异。方法:80只BALB/c雌性小鼠,分为3组:EB模型组(下称EB组,n=28)、哮喘模型组(下称哮喘组,n=12)、生理盐水对照组(下称对照组,n=40)。致敏方法同前。EB模型组第28d予100ug OVA滴鼻激发;哮喘组第28,29,30d予100ug OVA滴鼻激发(每天1次)。对照组因每组致敏、激发时间采用生理盐水进行致敏和激发。在末次激发24小时后,各组(n=12)分别检测小鼠的下列指标:有创检查法测定气道高反应性,支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数及细胞分类,支气管及肺组织炎症程度。此外,在末次激发12、48小时后,分别观察EB组和对照组气道高反应性、BALF细胞分类的变化情况(每组n=8)。结果:1.气道反应性的测定:激发12小时、24小时及48小时后,EB组气道反应性与对照组均无显着差异(P>0.05 )。而哮喘组在末次激发24小时后,在吸入浓度为12.5、25、50mg/ml的Mch时,RL%均显着高于对照组(P<0.05)。2.气道炎症:EB组滴鼻激发12小时、24小时、48小时后BALF的Eos百分比呈逐渐增加的趋势(P<0.05)。激发24小时后,EB、哮喘模型组BALF巨噬细胞百分率显着低于对照组(P<0.05),而中性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分率和淋巴细胞百分率显着高于对照组(P<0.05)。哮喘组BALF的Eos百分比[(42.15±13.35)%]和细胞总数[(7.59±1.33)×105/ml)]明显高于EB组[(25.33±10.79)%,(2.86±0.55)×105/ml)] (P<0.05),而中性粒细胞百分比[(11.14±6.61)%]显着低于EB组[(23.89±23.67)%](P<0.05)。激发24小时后,哮喘组支气管肺部炎症组织病理评分显着高于EB组(P<0.05)。结论:1.随着激发后时间的增加,EB模型的Eos气道炎症有逐步加重趋势,但并未观察到气道反应性的变化。2.本研究建立的EB模型的气道炎症程度轻于哮喘模型组。
徐在品[4]2005年在《抑制血管内膜增生的血流动力学和血液流变学机理研究》文中提出目前，医学界普遍采用动脉旁路搭桥术以改善血液供应，它是血管外科治疗心血管疾病的重要手段和基本方法。然而，术后的血管内膜增生所引起的再狭窄已成为中、小血管手术后期失败的一个主要原因。统计表明，术后5年的畅通率仅为33％。因此，抑制血管内膜增生具有重要的理论和临床意义。 自体静脉作为移植血管时，其所处的动脉系统力学环境与其原来所处的静脉系统力学环境有着本质的不同，从而会引起静脉组织结构的重建和内膜增生(intimal hyperplasia，IH)。 除移植静脉本身动脉化而发生的血管内膜增生外，吻合口(包括吻合口对应面)也发生内膜增生。就手术方法而言，目前血管搭桥多采用上游的side-to-end(STE)、下游的end-to-side(ETS)的吻合方式。虽然IH可同时发生于植入血管的上、下游两个吻合口处，但对side-to-end、end-to-side这样的搭桥术而言，下游处所产生的IH远较上游处明显。而下游end-to-side吻合处血管内膜增生又主要发生在两个部位：血管吻合口以及吻合口对应面的主体动脉，且后者是导致手术后期失败的主要部位。 血管搭桥后，血管吻合口的内膜增生主要是手术时的机械损伤以及搭桥血管与主体血管的顺应性失谐所引起，这是血管的愈合与重构现象。然而，远心端吻合口对应面虽然没有受到手术时的机械损伤，但却发生内膜增生，而且是导致手术后期失败的主要部位。因此，搭桥术后远心端吻合口对应面的血管内膜增生不能用纯粹的生物学愈合反应加以解释；同样，要抑制该处的内膜增生，也不能仅仅考虑生物学因素，还应考虑其它因素可能也会起着重要作用。 本文从血流动力学和血液流变学角度出发，采用不同吻合角度血管搭桥和钳夹损伤血管的方法制作血管内膜增生动物模型，探索不同吻合方法和中药紫苏对血管内膜增生的抑制作用。 ①流场测试。用显微外科技术行犬颈外静脉重建颈总动脉，搭桥血管和主体血管分别呈30°、45°、60°和S型(移植血管恢复血供后呈S型，但搭桥血管和主体血管的吻合角度为45°)，术后1小时收获搭桥模型(包括主体血管和搭桥血管)进行叁维固定以及透明化处理，得到的搭桥模型用于流场测试，观察不同吻合角度对血流动力学参数的影响。 ②不同吻合角度对血管内膜增生的影响。用上述方法制作不同吻合角度血管搭桥的实验动物模型，术后2个月，收获搭桥血管，组织切片，HE和V／G染色，
傅士龙[5]2014年在《人上皮性卵巢癌相关成纤维细胞促癌作用的研究》文中研究指明上皮性卵巢癌是女性生殖系统叁大恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫内膜癌,居第二位,而病死率一直高居各类妇科恶性肿瘤的首位。大约75%的卵巢癌患者在诊断时已是手术无法救治的晚期;因此,探索上皮性卵巢癌发生、发展的细胞外机制,以期达到预防和治疗卵巢癌的目的,成为迫切需要解决的重要课题。卵巢癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs),作为卵巢癌间质微环境中最主要的细胞成份之一,对肿瘤的生长、浸润、转移发挥重要的调节作用,对肿瘤微环境内的其他非肿瘤细胞,如细胞外基质、其他间质细胞也产生重要影响,在维持肿瘤微环境的动态平衡中发挥着重要作用。CAFs是一种有着多种来源的细胞群体,具有广泛的异质性,是各肿瘤研究的热点,人上皮性卵巢癌相关CAFs也需进行深入的研究。第一部分上皮性卵巢癌相关成纤维细胞与卵巢癌临床病理特征的相关性研究[目的]探讨上皮性卵巢癌中癌相关成纤维细胞与临床病理特征间的相关性。[方法]平滑肌肌动蛋白(α-SMA)为CAFs特异性标志物,α-SMA表达的数量与强度可代表CAFs的存在数量,因此采用免疫组化通用型二步法检测45例非癌卵巢组织中α-SMA表达和145例上皮性卵巢癌组织中α-SMA和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达,并分析两者的相关性及其临床意义。[结果]①正常卵巢组织除卵巢间质血管外,α-SMA不表达;在良性肿瘤间质中少部分阳性表达,且表达较弱;而在交界性肿瘤中,α-SMA表达强度介于良性肿瘤和恶性肿瘤之间。而在145例上皮性卵巢癌中,α-SMA均阳性表达,代表阳性的CAFs细胞在癌组织中的分布有3种方式;且Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌间质α-SMA阳性表达强度明显高于Ⅰ～Ⅱ期(P = 0.016);有淋巴结转移的卵巢癌明显高于无淋巴结转移卵巢癌(P=0.049)。②正常卵巢组织中MMP-9不表达;而上皮性癌中癌细胞MMP-9阳性率为95.2%(138/145)。MMP-9在Ⅲ～Ⅳ期组明显高于Ⅰ～Ⅱ期组(P=0.028),有淋巴结转移组强阳性率高于无转移组(P=0.033)。③α-SMA在上皮性卵巢癌间质强阳性表达与癌细胞MMP-9的表达呈正相关(p = 027)。[结论]α-SMA和MMP-9两者的共同强阳性表达主要集中于Ⅲ～Ⅳ期癌患者和有淋巴结转移的患者中,CAFs的存在与数量增多提示疾病预后不良。第二部分癌相关成纤维细胞与正常卵巢成纤维细胞分离、培养及鉴定一、癌相关成纤维细胞的分离、培养及鉴定[目的]通过分离、纯化、培养及鉴定,获得人上皮性卵巢癌组织中肿瘤相关成纤维细胞。[方法]采用酶消化法获得原代细胞,再通过酶消化+反复贴壁法,传代获得第4代纯化细胞,并绘制细胞生长曲线,通过形态学观察和细胞免疫化学染色,对所得细胞进行鉴定。[结果]获得典型卵巢癌相关成纤维细胞。形态学上,细胞呈长梭形,胞核不明显,细胞大小不一致。其生长潜伏期较肿瘤细胞长,生长相对缓慢。免疫细胞化学上,肿瘤相关成纤维细胞中,成纤维细胞特性蛋白-1、波形蛋白、结蛋白及α-平滑肌动蛋白均表达阳性,而血管内皮细胞、间充质细胞标志均表达阴性。细胞角蛋白在较早传代的细胞中少量表达,通过纯化后基本消失。[结论]本方法可获得典型上皮性卵巢癌相关成纤维细胞,为进一步研究该细胞自身生物学特性及其与卵巢癌间的相互作用提供了必要的细胞学基础。二、正常卵巢成纤维细胞的分离、培养及鉴定[目的]通过分离、纯化、培养及鉴定,获得典型人卵巢成纤维细胞。[方法]采用酶消化+反复贴壁法,获得纯化成纤维细胞,通过形态学观察和免疫细胞化学染色,对所得细胞进行特征性标志及生物学特性的检测,进一步阐述细胞特征,并绘制细胞生长曲线。[结果]形态学上,正常卵巢成纤维细胞形态多样,大部分为梭状型、条索形,还有叁角型、多角型和不规则型等,并具有伪足样外形;其生长潜伏期较长,12-14天可传代;免疫细胞化学上,波形蛋白(Vimentin)表达强阳性,结蛋白(Desmin)、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP-1)表达弱阳性;在较早期传代的细胞中,CK-7及CK-P呈少量阳性,随着细胞的纯化,其阳性表达渐行减少直至完全消失;肌动蛋白α(α-SMA)部分细胞表达阳性。而雌、孕激素受体ER、PR以及基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-3、MMP-9)、卵巢粘液性细胞标志CK-20、血管内皮细胞标志CD31、间充质细胞标志CD90、肿瘤标志物(CA125、CA199、CEA)、成纤维细胞激活蛋白α(FAP-α)、血小板衍生生长因子受体α(PDGFR-α)均阴性。[结论]成功获得人卵巢成纤维细胞,为研究卵巢癌及其相关成纤维细胞提供了必要的细胞学工具。第叁部分癌相关成纤维细胞对卵巢癌细胞生物学行为影响[目的]进一步验证CAFs对卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭特性的影响,为研究肿瘤-微环境的相互作用提供必要的细胞学基础。[方法](1)采用细胞共培养体系,通过MTT实验、细胞迁移实验、细胞浸润实验以及流式细胞仪方法检测CAFs对卵巢癌细胞SKOV3、OVCAR3的增殖、迁移、浸润和凋亡的影响。[结果](1)CAFs对卵巢癌细胞具有明显增殖作用;(2)CAFs影响卵巢癌细胞的凋亡;(3)CAFs共培养后促进卵巢癌细胞系的迁移;(4)CAFs共培养后增强卵巢癌细胞系的侵袭能力。[结论]CAFs可明显增强卵巢癌细胞的恶性生物学行为,为进一步研究肿瘤-微环境的相互作用提供了必要的理论基础。第四部分癌相关成纤维细胞与卵巢癌细胞共培养上清因子的检测[目的]为深入了解上皮性卵巢癌细胞与CAFs间发生相互作用后所产生的效应因子,进一步研究间质对肿瘤细胞生物学行为的影响提供必要的研究基础。[方法]采用蛋白芯片 RayBioTM Human Cytokine Antibody Array Ⅱ series Ⅰ(含有507个细胞因子)检测9份细胞培养上清中细胞因子的含量,其中CAFs培养上清3份,OVCAR-3培养上清3份,CAFs+OVCAR-3共培养上清3份;将所测定的因子含量与OVCAR-3所分泌的基础状态因子含量作比较,定义比率升高大于等于2.0或下降小于等于2.0(≥2.0或≤-2.0)者为差异有显着性。[结果]共获得差异表达因子57种,44种表达上调,13种表达下调。其中与细胞增殖相关因子17种,与肿瘤基质形成相关因子11种,与肿瘤趋化及前炎症因子相关因子19种,与肿瘤血管生成和抑制相关因子10种。[结论]肿瘤相关成纤维细胞通过与肿瘤细胞相互作用,可产生一系列细胞因子,或促进肿瘤的进展,或调节肿瘤-微环境的动态平衡,为进一步研究CAFs对卵巢癌的促进作用提供了研究资源。第五部分癌相关成纤维细胞对小鼠移植瘤促进作用的初步研究一、可视化小鼠移植瘤模型的建立[目的]建立可重复观察并且可客观定量的卵巢癌动物模型,为卵巢癌其他领域研究提供基础模型工具。[方法]采用含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体转染人卵巢癌细胞株,获得稳定表达GFP的卵巢癌细胞株GFP-Ovcar3接种裸鼠皮下或腹腔,利用小动物活体成像仪系统动态观察裸鼠移植瘤的生长情况,并对移植大小、轮廓进行定量测定。[结果](1)获得稳定表达绿色荧光蛋白的GFP-Ovcar3细胞;(2)通过接种裸鼠皮下或腹腔,成功获得带有绿色荧光蛋白的小鼠皮下和腹腔移植瘤模型。[结论]建立可视化小鼠模型,可更加直观、明确地获得肿瘤的大小和轮廓,为卵巢癌其他领域研究提供了基础模型工具。二、癌相关成纤维细胞对小鼠皮下移植瘤的促进作用[目的]通过体内实验,进一步证实CAFs在体外实验中所观察到的现象和结论。[方法]通过将前述获得的能稳定表达绿色荧光蛋白的不同浓度GFP-Ovcar3细胞,与CAFs细胞混合接种裸鼠皮下,建立可视化小鼠皮下移植瘤模型,观察成瘤率、测量肿瘤生长情况及远处转移情况。[结果](1)混合接种肿瘤细胞和CAFs细胞的裸鼠,成瘤率明显高于单纯接种肿瘤细胞的裸鼠,CAFs可促进卵巢移植瘤的发生,尤其当接种瘤细胞浓度较低时,促进作用显着;(2)混合接种肿瘤细胞和CAFs细胞的裸鼠,肿瘤生长明显快于单纯接种肿瘤细胞的裸鼠,CAFs可明显促进移植瘤的生长。[结论]通过体内、体外研究证实,CAFs对卵巢癌的发生和生长具有明显促进作用,为探索针对CAFs的卵巢癌新的治疗途径提供了理论依据。叁、人源性卵巢环境小鼠模型的建立[目的]将“人源性”因素加入小鼠模型,为精确模拟肿瘤发生、发展的临床病理过程提供临床前研究工具。[方法]尝试将正常人卵巢组织移植于SCID小鼠皮下,待明确移植物存活并伴有新生血管形成后,通过免疫组化分析卵巢移植物属性;将带有绿色荧光蛋白的肿瘤细胞,接种于卵巢移植物内,形成新的皮下移植瘤,观察新的移植瘤生长及转移情况。[结果](1)卵巢移植物在小鼠皮下生长良好,未见明显感染或组织排斥反应,移植物可见典型血管形成;(2)组织学检查表明:植入SCID小鼠后存活的人卵巢组织形态与植入前的原始人卵巢组织形态相似;(3)免疫组化分析表明:移植物标本为ER阳性和PR部分阳性,抗人CK-7阳性,抗人CD34阳性,表明移植物组织来源于人卵巢,有新生血管形成,仍为雌激素和孕激素依赖型;α-SMA的表达,类似于原始人卵巢组织;(4)接种于卵巢移植物的皮下肿瘤生长良好,并可见1只小鼠腹腔内转移瘤病灶。[结论]植入“人源性”卵巢组织形成新的皮下移植瘤,可模拟人卵巢癌细胞生长的人源性卵巢微环境,有利于肿瘤的生长和转移,较既往的小鼠模型更准确地模拟了卵巢癌发生、发展的临床病理过程。第六部分癌相关成纤维细胞通过PI3K/AKT/XIAP信号通路影响顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡[目的]本研究拟通过CAFs和卵巢癌细胞共培养的方法,阐明CAFs通过影响PI3K/AKT/XIAP信号通路,影响卵巢癌化疗效果。[方法]采用流式细胞术观察共培养组及非共培养组DDP诱导卵巢癌细胞的凋亡改变;应用RT-PCR、Western-blot观察共培养组及非共培养组DDP诱导卵巢癌细胞内PI3K、AKT、XIAP传导通路中mRNA水平及蛋白水平的变化,以及通路抑制剂LY294002对CAFs引起的化疗耐药的逆转作用。[结果](1)通过流式细胞仪检测,DDP对卵巢癌细胞作用的最佳时间和浓度分别为48h,5.0μ g/ml;(2)卵巢癌细胞与CAFs共培养后,DDP诱导的癌细胞凋亡显着减少(p<0.05);(3)Real-timePCR检测卵巢癌细胞内PI3K mRNA的表达共培养组明显高于未共培养组,XIAP mRNA的表达较未共培养组也显着升高(p<0.05),AKT mRNA表达有所升高,但无统计学意义;(4)PI3K/XIAP蛋白表达共培养组明显高于非共培养组,差异有统计学意义(p<0.05),总AKT蛋白共培养组和非共培养组无明显变化,但磷酸化AKT(P-AKT)蛋白表达有显着差异,差异有统计学意义(p<0.01)。加入通路抑制剂LY294002后,共培养组XIAP蛋白表达明显降低。[结论]CAFs与卵巢癌细胞共培养后,CAFs分泌的某种生长因子可使PI3K/AKT/XIAP信号转导通路上调,影响了 DDP诱导的卵巢癌细胞的凋亡。
马志明[6]2017年在《CaMKKβ抑制剂STO-609诱导胃腺癌细胞凋亡的机制研究》文中研究说明研究背景:胃癌是在世界范围内常见的恶性肿瘤,具有非常高的肿瘤相关的死亡率。胃癌的预后较差,在疾病的早期阶段,病人的临床症状不特异的症状,因此我国大部分的胃癌于临床诊断时已处于进展期,整体的预后及生存率远不如早期病例占多数的日本、韩国。在我国胃癌已经成为重要的卫生负担,虽然临床及基础的研究取得了长足的进步,但总体而言我国胃癌治疗的效果仍不满意。故此,对胃癌的早期诊断及与肿瘤的演进相关的信号通路及激酶等的研究,一直是胃癌基础研究的一个重要的方向。Ca MKKβ是钙调蛋白激酶家族成员,最初的研究多集中在其作为全身及具体的器官能量平衡的调控因子的作用,在诸如自身免疫性疾病、慢性炎症、神经系统退行性变、炎症等系统性疾病等方面;而最近的研究提示包含消化系统肿瘤在内的多种肿瘤,存在了Ca MKKβ的异常,但关于Ca MKKβ与胃癌的研究较少。目前已知的Ca MKKβ的下游激酶主要有AMPK、Ca MK及Akt,但在胃癌发生发展过程中Ca MKKβ究竟扮演着何种的角色,是学者们关心但尚未明确的问题。STO-609是Ca MKKβ的选择性抑制剂,研究已经发现在多种肿瘤,STO-609可以抑制肿瘤细胞的活力等。但STO-609抑制肿瘤的具体机制不详,只有零星的报道探讨了STO-609与Ca MKKβ的下游分子靶标的作用关系,而STO-609能否成为胃癌治疗潜在的药物的前提,则是对其作用机制及耐药机制的探讨。目的:1.探讨Ca MKKβ在胃癌组织及非癌组织中的表达是否存在差异,如果存在差异,则进一步探讨胃癌组织的Ca MKKβ的表达与临床病理学特征及预后的相关性。2.探讨Ca MKKβ的特异性抑制剂STO-609对胃腺癌细胞活力、凋亡及侵袭能力的影响,探讨STO-609对Ca MKKβ的相关下游通路活化的影响。3.利用sh RNA抑制Ca MKKβ和AMPK,探讨STO-609诱导胃腺癌细胞凋亡的作用及与Ca MKKβ下游信号通路的关系。方法:1应用免疫组织化学的方法检测胃癌组织与癌旁组织及正常组织的Ca MKKβ的表达。2应用统计学软件综合分析胃癌的Ca MKKβ表达与胃癌的组织分型、肿瘤直径、Lauren分型及淋巴结转移等临床病理学特征及预后进行分析。3通过台盼兰染色探讨STO-609的对胃腺癌细胞存活率的影响。4通过Western Blot检测STO-609对胃腺癌细胞Ca MKKβ下游AMPK、Akt、ERK的表达水平。5通过凋亡-坏死定量检测试剂盒及Western Blot检测STO-609的对胃腺癌细胞凋亡率的影响。6通过Trans-well侵袭室检测STO-609的对胃腺癌细胞侵袭能力的影响。7通过sh RNA抑制Ca MKKβ和AMPK,检测STO-609对胃腺癌细胞活力、凋亡及侵袭能力的影响,及AMPK、Akt、ERK的表达水平变化。8通过IBM SPSS 24.0对数据进行统计学分析。结果:1.93例胃癌组织中61例Ca MKKβ表达阳性为,21例癌旁组织中10例表达阳性,17例正常组织中6例表达阳性,阳性率分别为81.7%、46.6%、54.5%,差异具有统计学意义;2.在胃腺癌组织的Ca MKKβ表达评分上,T2期及以下肿瘤组织的评分为1.03±0.79,T2期以上肿瘤组织的评分为1.93±1.05,差异有统计学意义。多因素分析显示Ca MKKβ的强阳性表达是预后的独立危险因素,与弱阳性组相比强阳性组在总生存率上的差异有统计学意义;3.STO-609可以抑制胃腺癌SUN-1细胞及N87细胞的活力。4.STO-609对胃腺癌SUN-1细胞及N87细胞的AMPK、Akt、ERK的活化有抑制作用。5.STO-609对胃腺癌SUN-1细胞及N87细胞的凋亡有诱导作用。6.STO-609对胃腺癌SUN-1细胞及N87细胞的侵袭能力有抑制作用。7.与对照组相比,Ca MKKβsh RNA对STO-609引起的胃腺癌SUN-1细胞的凋亡存在抑制作用,但AMPK sh RNA无明显抑制凋亡的作用。8.与对照组相比,AMPK sh RNA对STO-609引起的胃腺癌SUN-1细胞的活力抑制及凋亡诱导无抑制作用;AMPK sh RNA对STO-609引起的SUN-1细胞的Akt及ERK活化无抑制作用。结论:1.胃癌组织的Ca MKKβ的表达明显高于癌旁组织及正常组织,Ca MKKβ的表达与肿瘤的浸润深度相关且强阳性表达提示预后不良,可能成为潜在的分子标志物;2.STO-609抑制胃腺癌细胞活力的作用,可能是与其诱导细胞凋亡有关;STO-609诱导胃腺癌细胞凋亡的作用,与其对Ca MKKβ的下游信号AMPK、Akt、ERK的激活抑制有关。STO-609抑制对胃腺癌细胞的侵袭能力有抑制作用,提示Ca MKKβ抑制剂STO-609可能作为一种新型的抗癌药物。3.我们进一步研究发现,AMPK特异性沉默,并没有影响Ca MKKβ抑制剂STO-609诱导胃癌细胞凋亡作用,提示诱导凋亡的作用可能与Ca MKKβ下游的信号其一的AMPK途径的机制无关。4.最后,结合我们的整体实验结果,我们推测:STO-609诱导胃癌细胞凋亡的机制,可能与抑制Ca MKKβ下游信号Akt、ERK及信号途径之间的交互调控有关。
郑琳[7]2015年在《基于E-cadherin调控的雷公藤红素抗肿瘤作用研究》文中研究说明研究目的：天然来源的雷公藤红素对NF-κB具有显着的抑制作用,并且表现出良好的抗肿瘤活性,但明显的毒副作用限制了其临床应用。HDAC抑制剂SAHA已被美国FDA批准上市,但其单药治疗实体瘤的疗效不佳,主要原因与其激活NF-κB通路相关。本论文第一部分旨在研究雷公藤红素与SAHA的协同抗肿瘤活性及其机制,在此过程中发现了雷公藤红素的抗肿瘤活性与E-cadherin相关。第一部分研究中还发现雷公藤红素具有调控E-cadherin的作用,鉴于E-cadherin参与了细胞上皮间质转化、粘附、转移等多个过程,因此第二部分旨在进一步考察雷公藤红素对E-cadherin的调控作用及其生物学效应。研究方法：一、(1)通过SRB法测定细胞存活率、克隆形成实验、凋亡的检测来评价联合用药的体外抗肿瘤活性；(2) Western blot和双荧光素酶检测系统考察NF-κB活性；(3)建立对SAHA耐药的SK-OV-3细胞株；(4) siRNA技术/质粒转染技术对E-cadherin基因进行特异性沉默/高表达,考察E-cadherin对雷公藤红素的抗肿瘤活性的影响；(5)建立人肺癌细胞95-D的裸鼠异种移植瘤模型,考察雷公藤红素和SAHA的体内抗肿瘤协同作用。二、(1)Western blot分析雷公藤红素对E-cadherin蛋白表达水平的影响；(2)siRNA对p38特异性沉默,考察p38对雷公藤红素调控E-cadherin作用的影响；(3)以TGF-p诱导EMT模型,观察细胞形态变化,采用Western blot分析雷公藤红素对上皮／间质标记物蛋白水平的影响,考察雷公藤红素对EMT的影响；(4)采用Western blot、RT-PCR及双荧光素酶报告系统检测雷公藤红素对SnaiL Slug的蛋白／转录表达水平以及Smad信号通路的影响；(5)采用细胞粘附实验、划痕修复实验及Transwell法分别评价雷公藤红素对细胞粘附、迁移及侵袭能力的影响；(6)采用B16-F10-GFP细胞C57BL/6小鼠实验性肺转移模型,检测雷公藤红素的体内抗肿瘤转移活性；(7)采用SRB法、PI染色法、Western blot法检测雷公藤红素与EGFR抑制剂的合用效果。研究结果：一、雷公藤红素和SAHA在多种肿瘤细胞上均表现出较强的协同抑制细胞增殖作用,同时两药合用能够显着增加Caspase介导的凋亡发生。雷公藤红素与SAHA合用能够显着抑制NF-κB活性,进而增强SAHA的抗肿瘤活性。然而雷公藤红素与SAHA的合用效果优于特异性NF-κB抑制剂与SAHA的合用效果,提示还有其他因素参与了两药合用的协同抗肿瘤作用。进一步实验结果发现雷公藤红素的抗肿瘤活性受到细胞内E-cadherin表达的影响,而雷公藤红素与SAHA联合用药能上调E-cadherin表达,这很可能是两药协同作用的另一机制。两药通过交互增敏的方式发挥协同抗肿瘤作用。在此基础上,在人肺癌细胞95-D的裸小鼠移植瘤模型上,雷公藤红素与SAHA合用能够增强对肿瘤生长的抑制作用,并且没有引起明显的毒副作用。二、雷公藤红素能够上调肿瘤细胞内E-cadherin表达,而这一调控作用依赖于它激活p38的作用。在TGF-β诱导的上皮间质转化(EMT)模型中,雷公藤红素能够抑制Smad信号通路,下调Slug/Snail的转录及蛋白表达水平,进而上调细胞内E-cadherin并干扰间质标记物表达,抑制EMT的发生。雷公藤红素能够通过靶向β1整合素通路抑制Fibronectin (FN)介导的细胞-ECM粘附,进而抑制肿瘤细胞的运动迁移及侵袭能力,而p38的激活参与其中。在体内模型中,雷公藤红素能够显着抑制B16-F10-GFP细胞形成肺转移。此外,EGFR抑制剂的抗肿瘤活性与细胞内E-cadherin表达相关,而雷公藤红素上调E-cadherin的作用使其能增强肿瘤细胞对EGFR抑制剂的敏感性。结论：(1)雷公藤红素与SAHA在体内外均表现出良好的协同抗肿瘤活性,能够协同诱导肿瘤细胞发生凋亡。雷公藤红素能够抑制NF-κB活性,以克服肿瘤细胞对SAHA的耐药,同时SAHA能够通过上调E-cadherin表达,增加肿瘤细胞对雷公藤红素的敏感性。两者通过互相增敏的方式达到协同抗肿瘤的效果。(2)雷公藤红素从肿瘤转移初始阶段(EMT)、粘附、迁移到形成转移灶多环节发挥抗转移作用。此外,雷公藤红素能够通过上调E-cadherin增强EGFR抑制剂的抗肿瘤活性。
刘德祥[8]2011年在《氟西汀抑制脂多糖诱导的小胶质细胞炎症介质释放及其机制的研究》文中研究表明1.前言抑郁症是目前危害人类健康的主要疾病之一,对其病因机制的探讨是达到有效治疗的必要途径。传统抑郁症的“单胺学说”认为,抑郁的发生主要与单胺类神经递质如5-羟色胺(seretonin,5-HT)及去甲肾上腺素(noradrenalin,NE)水平低下有关。而与之相对应研制的抗抑郁药也主要是通过提高突触间隙5-HT和NE水平,从而发挥抗抑郁的作用。近几年来,研究热点逐渐由神经递质和神经内分泌激素转向对细胞因子的关注。抑郁症的免疫异常早就有过报道,九十年代以来,随着研究技术的发展,发现抑郁症患者常有炎性分子增高,提示免疫激活。近年来这方面的研究趋向于认为抑郁症的发生可能与免疫激活导致细胞因子分泌增多有关,提出了抑郁症的“细胞因子假说”,该假说强调抑郁症是一种心理神经免疫紊乱性障碍。因此对抗抑郁药的药理机制也提出了新的观点,即抗抑郁药是否通过抑制细胞因子的分泌从而发挥其抗抑郁作用。细胞因子是免疫细胞产生的一大类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽,化学性质大都为糖蛋白。细胞因子包括白介素(interleukin, IL)、干扰素(interferon, IFN)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)等几类,根据它们在炎症反应中的不同作用又分为致炎性细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ等)和抗炎性细胞因子(如IL-4、IL-10等)。致炎性细胞因子中的Il-1、IL-6、TNF-α等是启动炎症反应的关键细胞因子,又称为前炎性细胞因子(pro-inflammatory cytokine)。众多细胞因子在体内或相互协同、或相互拮抗,构成复杂的细胞因子网络。抑郁症的“细胞因子假说”起源于细胞因子与抑郁症关联的现象学。临床发现,细胞因子疗法引起抑郁症,免疫激活性疾病伴随抑郁症,抑郁症病人有细胞因子增高；动物实验表明,细胞因子可引起动物出现抑郁样病态行为,且可被抗抑郁药所逆转,而细胞因子缺失或其受体缺失则产生抗抑郁作用。细胞因子可通过以下几种机制导致抑郁症的发生。(1)影响神经递质：细胞因子可激活吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO),该酶分解5-HT的前体色氨酸(tryptophan, TRP),降低TRP的血浓度,使合成5-HT的原料减少,导致脑内5-HT含量下降；(2)影响神经内分泌功能：细胞因子不但能强效地激活下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)轴,而且阻碍皮质激素对HPA轴的负反馈,造成HPA轴持久的活动过度。近年来,越来越多的研究表明小胶质细胞过度活化以及炎症反应过程参与抑郁症的病理过程。小胶质细胞广泛分布于中枢神经系统,占胶质细胞总数的5%-20%。在正常脑内小胶质细胞胞体较小,突起细长,呈分枝状,处于未激活状态。当中枢神经系统遭受损伤,如炎症、外伤时,小胶质细胞可被激活,早期表现为胞体增大,细胞表面的突起紧缩,变短,增粗,从而由分枝状的静息小胶质细胞转变成无突起的激活的阿米巴样巨噬细胞,这些形态改变有利于小胶质细胞的阿米巴样运动及其吞噬功能的发挥。另外,激活的小胶质细胞能够分泌大量的炎症介质如肿瘤坏死因子、白细胞介素和一氧化氮(nitric oxide, NO)等,从而引发免疫炎症反应,参与到抑郁症的发病过程中。氟西汀(fluoxetine)为选择性5-HT再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs)类抗抑郁药,主要通过对中枢神经5-HT再摄取的抑制作用,增加5-HT在突触间隙的浓度,从而发挥其抗抑郁的作用。鉴于抑郁症的“细胞因子假说”和小胶质细胞活化与抑郁症的病理机制密切相关,我们假设抗抑郁药的药理机制可能包括对小胶质细胞活化释放炎症介质的抑制作用。因此,我们的实验旨在研究抗抑郁药氟西汀是否能够抑制由脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱发的小胶质细胞炎症介质的释放及其有关的分子机制,从而为进一步阐明抗抑郁药物的药理机制以及研制新型抗抑郁药物提供理论依据。2.材料和方法2.1 BV2细胞培养BV-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养,当细胞达到95%融合时用0.25%的胰酶消化细胞,进行细胞传代。2.2原代小胶质细胞培养取出生1-2 d的BALB/c小鼠,无菌条件下取脑,剔除软脑膜及血管,尽可能快速切碎组织,胰蛋白酶37℃消化20 min,1000 rpm/min离心5 min,弃上清,加入10% FBS DMEM/F12(含体积分数1 0万U/L青霉素、100 mg/L链霉素)培养基重悬细胞,接种至60 mm培养瓶中,37℃、5%C为CO2培养箱中静置培养14 d。其中每3 d换1次液。14 d后,用37℃恒温振荡器振荡(500 rpm/ min)2 h,收集悬浮细胞,1000 rpm/min离心5 min,弃上清,种植密度1×106/ml。连续培养10 d,经过CDllb免疫荧光鉴定,其纯度可达97%,可以用于后续实验研究。2.33-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]在96孔板中接种BV-2细胞(5×104/孔),置37℃,5%CO2培养箱孵育过夜。细胞经过不同的处理后,在培养后第24 h,加入MTT20μl (5mg/ml),4 h,再加入二甲亚砜(dimethysulfoxide, DMSO)200μl,溶解后用酶联检测仪测OD值,绘制细胞的生长曲线。2.4酶联吸附免疫测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)BV-2细胞经过相应的药物处理后,收集上清液,采用ELISA检测试剂盒测定TNF-α和IL-6水平。2.5一氧化氮测量BV-2细胞经过相应的药物处理后,收集上清液。以NO的稳定性代谢产物-亚硝酸盐作为检测NO的指标,用Griess法试剂盒测定。2.6. RT-PCR收集状态良好细胞,用Trizol抽提总量RNA,紫外分光光度计测定RNA浓度。逆转录为20μ1反应体系。PCR反应体系为25μ1。反应条件为94℃预变性5 min; 94℃,30 s; 60℃,45 s; 72℃,30 s;延伸72℃,7 min,32个循环。电泳及半定量分析,扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳。2.7 Western blot总蛋白经抽提后蛋白定量,按照上样量为30μg的量计算上样体积,余下用上样缓冲液补足20μ1,经加热变性处理后上样,电泳,5%浓缩胶60 V,12%～15%分离胶120 V；电转后移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1h,一抗4℃过夜,洗膜3次,二抗室温1h,洗膜3次,暗室中ECL发光。2.8免疫荧光经实验处理后,PBS清洗细胞爬片,用多聚甲醛固定30min; PBS漂洗,过氧化氢孵育10min,以消除内源性过氧化物酶活性；PBS漂洗,牛血清白蛋白封闭30 min；去除封闭液,加入相应的抗体,4℃过夜,PBS漂洗；加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗避光室温孵育1 h,荧光显微镜下计数阳性细胞表达率。2.9凝胶电泳迁移实验(Electrophoresis Mobility Shift Assay, EMS A)提取BV-2细胞核蛋白并定量。将核蛋白与地高辛标记的寡核苷酸探针在缓冲液中充分结合后,用5%非变性聚丙烯酞胺凝胶进行电泳(220V,1.5h),电泳结束后,用NC膜进行转膜(400 mA,30 min),然后用化学发光法检测。2.10双萤光素酶检测分析BV-2细胞转染报告基因质粒后48h,加入细胞裂解液(PLB),离心后收集细胞上清液。取20μl细胞上清,利用双萤光素酶检测试剂盒在萤光检测仪上检测萤火虫和海肾萤光素酶活力。用萤火虫/海肾萤光素酶活力比值来评价NF-κB的活性。3.实验结果3.1氟西汀抑制LPS引起的小胶质细胞活化在研究氟西汀的作用之前,首先进行了MTT实验以检验氟西汀是否对小胶质细胞具有毒性。MTT结果显示,经过24小时的孵育,只有在50μM浓度下,氟西汀才对小胶质细胞产生明显的毒性。而其他浓度(0.1μM, 1μM,10μM)的氟西汀对细胞均是无毒性的。CDllb是小胶质细胞激活的标志。在LPS刺激下,原代小胶质细胞表达较高水平的CD11b,而氟西汀能够明显地抑制这种由脂多糖引起的CDllb表达。3.2氟西汀对细胞因子的作用LPS刺激小胶质细胞24h后,BV-2细胞能够分泌大量的细胞因子包括TNF-α和IL-6,而氟西汀能够剂量依赖性地减少上述细胞因子的分泌。为了阐明氟西汀抑制细胞因子分泌作用的机制,我们通过RT-PCR技术分析了炎症因子的基因表达,发现氟西汀能够抑制上述细胞因子基因的表达。3.3氟西汀对一氧化氮的影响为了研究氟西汀对一氧化氮的影响,我们测量了小胶质细胞NO的分泌,同时我们应用RT-PCR、Western Blot和免疫荧光技术,从基因和蛋白水平检测了与NO分泌密切相关的iNOS的表达情况。结果证实,氟西汀能够从这两个方面抑制由LPS引起的iNOS的表达。3.4氟西汀对促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)的影响由于MAPK信号传导通路与炎症介质密切相关,所以我们试图研究氟西汀是否通过影响MAPK通路从而发挥了它的抗炎作用。Western Blot结果表明,由LPS引起的p38 MAPK磷酸化能够被氟西汀所抑制,而另外两种蛋白ERK1/2和JNK却没有受到影响。同时我们也通过免疫荧光技术进一步验证了上述结果。3.5氟西汀对NF-κB的作用NF-κB是细胞因子的重要上游调控信号。Western Blot结果显示,氟西汀能够抑制由脂多糖引起的IκB-α降解和NF-κB磷酸化,而EMSA和luciferase assay结果更加证实了氟西汀能够影响到细胞因子的调控和表达。综合以上结果,我们认为氟西汀能够显着抑制由LPS刺激小胶质细胞活化分泌的TNF-α, IL-6和NO,而且氟西汀的这种抗炎作用是通过p38MAPK和NF-κB两条信号通路实现的。我们的结果提示氟西汀的治疗效应部分是通过它抑制小胶质细胞活化的抗炎作用实现的,由此进一步阐明了抗抑郁药物的药理机制并为研制新型抗抑郁药物指明了方向。
孙承操[9]2017年在《长链非编码RNA 00301、00511及XIST在非小细胞肺癌中的作用及其机制研究》文中提出肺癌(lung cancer)是人类常见的恶性肿瘤之一,近年来随着环境污染的日益严重,其发病率在后续相当的时间内将继续呈显着的上升趋势。我国是肺癌的高发病率国家,近十年来肺癌已分别占男、女恶性肿瘤发病率的第一位和第二位,并且,绝大多数患者确诊时已属于中晚期常失去手术机会,这与肺癌的发病机制不清,缺乏有效的早期诊断和预防手段有关。国内外学者多年以来致力于肺癌发生机理的探讨,发现与正常细胞不同,癌细胞具有更强的增殖能力、更少的凋亡、更高的基因突变率和更强的耐药性等。非小细胞肺癌(NSCLC)占据肺癌全部比例的80%以上,其发生发展与诸多癌基因的过度表达、抑癌基因的失活紧密相关。但确切分子发病机制还不完全清楚。因此,进一步研究新的与肺癌发生发展过程及其恶性特征密切相关的基因功能改变,对揭示NSCLC发生发展的确切分子机制、找到早期诊断和预后判断指标(特别是能直接从血液中检测)、设计合理有效的药物,以及改善我国NSCLC的诊疗水平具有积极意义。长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt的单链RNA分子,定位于细胞核内或细胞质中,缺乏蛋白质编码功能,以RNA形式在多种层面(包括表观遗传学、转录调控及转录后调控等)上调控基因的表达水平。人类基因组序列中4%-9%产生的转录本是lncRNA,大部分lncRNA仅在机体特定的发育阶段表达,并且具有组织或细胞特异性。lncRNA能够通过诸多方式,包括转录干扰,诱导染色质重构和组蛋白修饰,反义链和正义链RNA杂交,结合特异蛋白,抑制mRNA降解,产生内部siRNAs,调控蛋白质活性,改变蛋白质定位等,调节与之相关的蛋白编码基因,进而参与疾病的发生。这些发现在病因学上开辟了 lncRNA作用机制研究的新领域。本研究通过分析TCGA、Oncomine和GEO数据库在NSCLC中进行lncRNA的差异表达分析和组织验证,发现LINC00301,LINC0051和XIST在NSCLC中显着高表达,其表达水平NSCLC的预后密切相关。故而选择LINC00301,LINC0051和XIST作为研究对象,进一步研究其在NSCLC中的作用及其机制。本研究分为叁个部分,第一部分通过对肺癌组织进行lncRNA的差异表达分析,发现LINC00301在NSCLC中特异性高表达。进一步的研究发现,LINC00301的表达同时在NSCLC组织及细胞中均显着增高。通过脂质体2000转染pcDNA3.1-LINC00301、sh-LINC00301 入人肺癌细胞 A549 及 SPC--A-1 细胞。荧光原位杂交(FISH)实验检测LINC00301在细胞内的定位;采用台盼蓝染色、CCK-8、克隆形成实验和EdU增殖实验检测LINC00301对肺癌细胞增殖能力的影响;采用transwell迁移侵袭实验研究LINC00301对肺癌细胞迁移能力的影响;通过构建裸鼠成瘤模型,研究LINC00301对肺癌细胞体内生长的影响;检测了LINC00301对肺癌细胞系A549和SPC-A-1细胞甲基化水平的影响;利用生物信息学软件RPISeq和catRAPID预测,RIP,RNA-pulldown和EMSA等技术检测LINC00301 与 EZH2 的相互作用;采用 western blot,qRT-PCR,ChIP 检测LINC00301与EZH2对EAF2及其下游HIFlα信号途径的调控作用;利用台盼蓝染色和克隆形成实验检测EAF2对LINC00301在NSCLC细胞增殖中的调控;利用transwell迁移侵袭实验研究EAF2对LINC00301在NSCLC细胞迁移侵袭中的调控;利用western blot,免疫组化检测HIFlα在NSCLC组织中的表达水平;K-M plotter检测HIF1 α在NSCLC病人预后中的作用;利用生物信息学软件miRDB预测,RNA-pull down和荧光素酶报告基因检测系统检测LINC00301对miR-1276的调控作用;采用生物信息学软件TargetScan,PicTar,microRNA.org预测,荧光素酶报告基因检测系统,western blot,qRT-PCR检测miR-1276对HIFlα的调控作用;利用western blot,台盼蓝染色,克隆形成实验和transwell迁移侵袭实验检验LINC00301/miR-1276/HIF1α途径对NSCLC的调控。实验结果表明:LINC00301在NSCLC组织和细胞中特异性高表达并与NSCLC病人预后密切相关;LINC00301促进了 NSCLC细胞的体外增殖、迁移和侵袭,促进了 NSCLC细胞的体内生长;FISH结果显示LINC00301主要定位于细胞核;LINC00301与EZH2特异性结合,介导EAF2基因启动子处发生H3K27me3甲基化,抑制了EAF2的表达,从而抑制VHL磷酸化,抑制了 HIF1α的水解;HIF1α在NSCLC组织中高表达并与NSCLC病人预后密切相关;LIN00301通过与miR-1276竞争性结合,缓解了 miR-1276与HIF1αmRNA3'-UTR的结合,从而促进HIF1α的蛋白表达。研究结果提示:LINC00301可以通过调控HIF1α信号途径作为肺癌的促癌基因来发挥功能。第二部分我们通过对肺癌组织进行lncRNA的差异表达分析,发现LINC00511在NSCLC中特异性高表达。进一步研究发现,LINC00511的表达同时在NSCLC组织及细胞中均显着增高。通过脂质体2000转染sh-LINC00511入人肺癌细胞A549及SPC-A-1细胞。采用CCK-8、克隆形成实验和EdU增殖实验检测LINC00511对肺癌细胞增殖能力的影响;利用流式细胞术检测LINC00511对肺癌细胞周期的调控;采用transwell迁移侵袭实验研究LINC00511对肺癌细胞迁移能力的影响;采用流式细胞术,Hochest染色,caspase3/7活性检测研究LINC00511对NSCLC细胞凋亡的影响;通过构建裸鼠成瘤模型,研究LINC00511对肺癌细胞体内生长的影响;利用RIP,RNA-pulldown、western blot,qRT-PCR和ChIP等技术检测LINC00511与EZH2的相互作用及其对p57的调控;利用克隆形成实验,BrdU实验,transwell迁移和侵袭实验,流式细胞术检测p57在LINC00511调控NSCLC发生发展中的作用;K-Mplotter检测p57在NSCLC病人预后中的作用。实验结果表明:LINC00511在NSCLC组织和细胞中特异性高表达并与NSCLC病人预后密切相关;LINC00511促进了 NSCLC细胞的体外增殖、迁移和侵袭,抑制了 NSCLC细胞的体外凋亡,促进了 NSCLC细胞的体内生长;LINC00511主要定位于细胞核;LINC00511与EZH2特异性结合,促进了p57基因启动子处H3K27me3甲基化,抑制了 p57的表达;p57在NSCLC组织中低表达并与NSCLC病人预后密切相关。研究结果提示:LINC00511可以通过调控p57信号途径作为肺癌的促癌基因来发挥功能。第叁部分我们通过对肺癌组织进行lncRNA的差异表达分析,发现XIST在NSCLC中特异性高表达。进一步的研究发现,XIST的表达同时在NSCLC组织及细胞中均显着增高。通过脂质体2000转染sh-XIST入人肺癌细胞A549及SPC-A-1细胞。采用克隆形成实验检测XIST对肺癌细胞增殖能力的影响;利用流式细胞术检测XIST对肺癌细胞周期的调控;采用transwell迁移侵袭实验研究XIST对肺癌细胞迁移能力的影响;通过构建裸鼠成瘤模型,研究XIST对肺癌细胞体内生长的影响;利用 RIP,RNA-pull down、western blot,qRT-PCR 和 ChIP等技术检测XIST与EZH2的相互作用及其对KLF2的调控;利用克隆形成实验,transwell迁移和侵袭实验,流式细胞术检测KLF2在XIST调控NSCLC发生发展中的作用。实验结果表明:XIST在NSCLC组织和细胞中特异性高表达并与NSCLC病人预后密切相关;XIST促进了 NSCLC细胞的体外增殖、迁移和侵袭,促进了 NSCLC细胞的体内生长;XIST主要定位于细胞核;XIST与EZH2特异性结合,促进了 KLF2基因启动子处H3K27me3甲基化,抑制了 KLF2的表达;KLF2在NSCLC组织中低表达并与NSCLC病人预后密切相关。研究结果提示:XIST可以通过调控KLF2信号途径作为肺癌的促癌基因来发挥功能。
李远[10]2013年在《杂合型重编程Oct4联合多能干细胞因子表现重编程人脑胶质瘤细胞的研究》文中研究表明研究背景脑胶质瘤(Glioblastoma)是神经外科最常见的一类肿瘤,其发病率占颅脑肿瘤的35.26%～60.96%(平均为44.69%),特别是分化不良的星形细胞胶质瘤预后很差,患者多于确诊后9-18个月死亡,严重危害人们的生活健康。虽然最近10年中,神经外科的诊疗技术有了很大的发展,但恶性脑胶质瘤的预后并未出现明显改善,患者的中间生存期仍未超过一年。胶质瘤的发病、发展及复发过程与基因(Genetic)及其表观遗传学(Epigenetic)改变密切相关。因此,更好地理解胶质瘤发病及发展的基因学及表观遗传学原理将有助于进一步揭示该病的发生及发展机制,并有助于发展新的治疗方案。诱导多能干细胞(Induced Pluripotent stem cell, iPS细胞)技术一种基因重编程的干细胞技术,通过表观遗传重编程可重排成体细胞的表观遗传调控。iPS重编程技术在疾病的诊断和治疗方面已表现出很大的潜力,并改变了人们对疾病治疗的理念,使制造病人特异性和疾病特异性的干细胞成为可能。目前,iPS重编程技术的重编程效率很低,在正常成纤维祖细胞中仅为0.02%左右,在病理细胞中,特别是肿瘤细胞,其诱导效率更低,严重影响了iPS技术在临床应用等领域的推广应用。现阶段,将iPS技术应用于恶性肿瘤研究治疗的报道较少,还未有诱导颅脑肿瘤细胞重编程为iPS细胞的报道。本研究依据杂合型重编程因子(Synthetic Reprogramming Factor, sRF)假说,构建具有强激活效率的sRF-Oct4因子,以提高iPS的生成效率,并用于诱导脑胶质瘤细胞向iPS细胞转化,从而调控脑胶质瘤细胞的表观遗传网络,探讨脑胶质瘤在诱导前后的肿瘤性改变。实验目的诱导多能干细胞(Induced Pluripotent stem cell, iPS细胞)技术一种基因重编程技术,通过表观遗传重编程重排成体细胞的表观遗传调控。恶性人脑胶质瘤的发病、发展及复发过程与基因及其表观遗传调控紊乱密切相关。现阶段,iPS技术的表观重编程效率较低,特别是在肿瘤细胞中的效率更低,常规的iPS技术很难完全重排肿瘤细胞的表观遗传调控,且国内外还未有用iPS技术表观重编程胶质瘤细胞的报道。因此,本研究拟将强转录激活子pAD65引入经典重编程转录因子Oct4的结构中,构建新杂合型重编程因子(sRF-Oct4),并应用诱导脑胶质瘤细胞U87-MG向iPS细胞转化,重排其表观遗传网络,并探讨诱导后的U87-MG的多能性变化及其肿瘤性改变,以期为下·步胶质瘤的机制研究和寻求新的治疗手段提供实验基础。方法1)采用分子克隆技术用强激活子pAD65构建重编程转录因子Oct4(sRF-Oct4),并用LipofectamineTM2000脂质体方法将重组质粒转染入293T细胞,检测sRF-Oct4在293T细胞中的表达情况；并应用pOct4-EGFP与sRF-OctT4共转染,通过荧光发光观察靶细胞下游基因激活情况；并用荧光素酶(Luciferase)技术检测sRF-Oct4对靶细胞下游调控元件的作用,间接评价其转录活性。2)采用LipofectamineTM2000脂质体法,包被sRF-Oct4、Oct4、Sox2、Kif4、 c-myc及EGFP逆转录病毒质粒,并将质粒导入病毒包装EP2-293细胞系中,增殖相应逆转录病毒。3)采用浓缩后的病毒上清感染胶质瘤细胞U87-MG,感染后的靶细胞接种入鼠滋养层细胞(Mouse Embryonic Fibroblast, MEF)中,置于干细胞培养环境中向iPS细胞诱导。4)将诱导为克隆状生长的iPS细胞移植入新的MEF中,继续培养,并稳定传代。将稳定传代后的iPS细胞收集处理,用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase Chain Reaction, RT-PCR)技术检测iPS细胞下游基因的表达,并用Western-Blot技术检测其相应功能蛋白的合成情况。5)将未处理的U87-MG、诱导后的iPS细胞及U87-iPS分化的细胞分别接种入裸鼠体内,观察其成瘤情况,并将成瘤组织做病理切片。6)检测未处理的U87-MG及U87-iPS分化的细胞分别检测TIMP2及MMP-2的蛋白表达情况。结果1)构建重组杂合型重编程因子sRF-Oct4,并与逆转录病毒载体结合,形成杂合型重组质粒,基因测序与预期使用设计结果一致。2)荧光素酶检测证明,杂合型重编程质粒sRF-Oct4与野生型Oct4对照,其转录活性明显高于野生型Oct4。3)经MEF及干细胞环境诱导SRF-Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc感染后的U87-MG细胞,3周后出现类iPS细胞的克隆团,并可分化传代；而经典Yamanaka因子诱导3周未见细胞克隆形成。4) RT-PCR检测诱导后的U87-iPS细胞显示干细胞相关基因Oct4、Nanog等表达增强；Western-Blot显示,诱导后的细胞干细胞相关蛋白Oct4、Nanog表达增强。5)诱导U87-iPS细胞接种诱导后的细胞到免疫缺陷小鼠体内,可生成畸胎瘤组织。6)诱导U87-iPS细胞自然分化后,其增殖活性低于正常U87-MG细胞,其肿瘤性下降可能与TIMP2及MMP-2信号通路改变相关。结论整合转录激活子pAD65至杂合型重编程Oct4质粒中,可以提高经典干细胞重编程因子Oct4的转录活性；pAD-Oct4联合Sox2、Klf4及c-Myc因子包装逆转录病毒可将U87-MG细胞重编程为类iPS细胞,且重编程后的细胞经自然分化后增殖活性下降,肿瘤性降低。
参考文献：
[1]. 医用电泳胶片图像检测系统的研究[D]. 范毅. 西安理工大学. 2002
[2]. 基于冷阴极X射线源的脉冲式线扫描系统的研究[D]. 刘春毅. 东南大学. 2015
[3]. 嗜酸粒细胞性支气管炎与支气管哮喘气道炎症特征的比较及相互关系探讨[D]. 张清玲. 广州医学院. 2008
[4]. 抑制血管内膜增生的血流动力学和血液流变学机理研究[D]. 徐在品. 重庆大学. 2005
[5]. 人上皮性卵巢癌相关成纤维细胞促癌作用的研究[D]. 傅士龙. 南京医科大学. 2014
[6]. CaMKKβ抑制剂STO-609诱导胃腺癌细胞凋亡的机制研究[D]. 马志明. 吉林大学. 2017
[7]. 基于E-cadherin调控的雷公藤红素抗肿瘤作用研究[D]. 郑琳. 浙江大学. 2015
[8]. 氟西汀抑制脂多糖诱导的小胶质细胞炎症介质释放及其机制的研究[D]. 刘德祥. 山东大学. 2011
[9]. 长链非编码RNA 00301、00511及XIST在非小细胞肺癌中的作用及其机制研究[D]. 孙承操. 武汉大学. 2017
[10]. 杂合型重编程Oct4联合多能干细胞因子表现重编程人脑胶质瘤细胞的研究[D]. 李远. 郑州大学. 2013