张晓娟[1]2004年在《剪切力对血管内皮细胞表达细胞因子及血管活性因子的影响》文中提出本实验以体外培养的人脐静脉内皮细胞为研究对象，借助经改进的平行平板流动小室为脐静脉内皮细胞施加流动剪切力，利用放免方法、硝酸还原酶法及荧光染色法来检测脐静脉内皮细胞在不同大小和不同时间剪切力作用下表达IL-8、ET-1、NO及胞内游离钙离子的规律，对于进一步探究内皮细胞通过何种信号传导途径将剪切力信号和刺激传入内皮细胞内并引起一系列的细胞应答和认识流动剪切力作用对血管内皮细胞功能、代谢等产生的影响具有重要意义，有利于对某些疾病的早期诊断和治疗。 我们把培养的脐静脉内皮细胞传代3至5代后用于实验。利用流动小室装置，通过精密蠕动泵灌注液体来提供剪切力，选择5dyne／cm~2、10dyne／cm~2、15dyne／cm~2叁种剪切力，施加于培养的脐静脉内皮细胞，作用不同时间后检测内皮细胞表达IL-8、ET-1、NO和细胞内游离钙的变化。 我们的研究发现不同剪切力作用于内皮细胞后，IL-8的表达量与剪切力大小及作用时间相关，为时间依赖性增长，剪勿力对止爹为贫绷腔裹送纷脸因子及止营厉世因子时矛时中丈材萝在sdyne/ cmZ和lodyne/ cmZ组中表达量明显高于空白对照组，而15dyne/cmZ组与对照组相比有下降趋势。ET一1表达量和对照组相比均有不同程度的增加，以10dyne/cmZ组最为明显，12omin后达到高峰，随后下降。而5 dyne/em，组在300min后达高峰，继而下降。空白对照组其ET一1表达量随时间延长缓慢增长，在3O0min后高于两实验组。同时我们也发现两组剪切力作用的内皮细胞其NO释放量的波动趋势相似，均为先急剧升高至120min时缓慢下降，但释放量有所不同。空白对照组没有明显变化。420min后两实验组NO释放量均低于空白对照组。内皮细胞经剪切力作用后其胞内游离钙和对照组相比均有一定程度的增加。 平行平板流动小室是常用的一种细胞加载装置，本研究使用蠕动泵来控制循环流量，调节剪切力的大小，容易控制流量和时间。但该技术循环液是均匀流动，与体内脉动血流形式有一定差别，只局限于模拟血流均匀的血管处，无法模拟血管分叉及弯曲处的流体流动。通过实验，我们可以推测 出，腔侧面内皮细胞表面的分子由于直接与流动血液接触而 最有可能成为剪切力传感器，这些分子可以被形态结构的改 变直接激活，也可以被配体一受体相互作用的改变间接激活。 给细胞施加剪切力后是通过细胞膜上机械性刺激受体激活引 起细胞骨架的改变或通过一些生化反应激活胞内第二信使钙 离子，使之升高活化，激活蛋白激酶，改变细胞内液中的转 录因子，调控细胞核中的基因转录，调节细胞活性物质的释 放，包括NO和内皮素一1保持相对动态平衡，IL一8的释放， 一4一军厉建瞥学院硕全讼丈剪勿力对应营为质细脸涛送细腔因子及应营厉趁因子时居时中丈茄萝和许多其他的生物活性物质，维持内皮细胞形态结构的完整，参与体内多种生理及病理的反应调控。
于海波[2]2016年在《剪切力对动静脉内瘘血管内皮细胞的影响》文中进行了进一步梳理血液透析是终末期肾病患者重要的治疗方法,动静脉血管内瘘是维持性血液透析患者首选的血管通路。长期稳定的血管通路对维持性血液透析患者的生活质量和生存时间意义重大。从手术建立动静脉血管内瘘到其发展成熟为具有充足的血流量可以用于穿刺透析,需要一段时间的成熟期。在内瘘成熟的过程中,动静脉血管内血流动力学发生了巨大变化,并促使吻合的血管产生一系列的病理和生理学变化。血流剪切力为影响内瘘成熟的重要因素。第一部分平行板流动室流场的建立和数值模拟研究目的:动静脉内瘘是人为将动脉与静脉血管吻合后形成的非生理性产物。内瘘建立后,动脉血和或部分静脉血混合后流经静脉端返回心脏。由于血管径、血流量和内瘘夹角各不相同,且动静脉内瘘血流复杂,往往难以分析和研究。本研究应用平行板流动腔模拟管腔和血流,CFD软件分析平行平板流动腔内流体类型、剪切力的大小和分布。为分析内瘘复杂血流做理论和实践准备。方法:应用平行平板流动腔模拟动静脉血管内瘘内的血流动力学变化。应用CFD软件建模并分析流动腔内流体模式及剪切力的分布。结果:(1)由于本算例为压差驱动流,流场的压强分布在x、z方向上没有太大的差异,沿着流动方向压强逐渐减小。(2)整个计算域为层流流动,速度在圆管入口经过一段发展后形成抛物状分布,而后在狭窄长方体物块中,流体进行掺混、紊乱的流动并有涡流的存在,进入底面流动腔室(底板)后,流体为稳定均匀的流动状态,速度沿着y、x方向几乎无变化,但在z方向上呈现抛物线型分布(典型的泊肃叶流动特征),中间速度最大。(3)壁面切应力在底板中央层流区域均匀分布且数值较大。靠近壁面区域由于有涡流的存在且速度垂向梯度较小,因此该区域壁面切应力较小。在上述两个区域之间存在一个区域,由于存在较大的速度梯度,壁面切应力达到峰值,但该区域很小,对内皮细胞培养的影响也相对较小。(4)流动腔室中速度梯度与壁面切应力呈正比例关系。结论:(1)流动腔内流体为压差驱动流,压强的分布沿血流方向逐渐减低。(2)流体进入底面流动腔室(底板)后,成为稳定均匀的流动状态,速度沿着y、x方向几乎无变化。(3)入口流量越大,流动腔室中速度梯度越大,壁面切应力也越大。剪切力和速度梯度成正比,由于本研究中流体速度较小,剪切力和速度也近似呈正比关系。第二部分生理状况下剪切力对静脉内皮细胞的影响目的:内皮细胞呈单层贴覆于血管内表面,是各种力学变化的主要受力者。小窝蛋白是分布于内皮细胞表面的力学感受器,当剪切力作用于内皮细胞时,会引起膜表面蛋白表达及分布的变化。在生理状况下,血流剪切力直接作用于血管内皮细胞,内皮细胞表面的力学感受器在接受刺激后,将力学信号转换为生物信号并传递到细胞核,从而影响内皮细胞的生物学功能。本研究通过不同剪切力不同时间的刺激,研究血管内皮细胞功能的变化,评估其在内瘘内膜增生中的作用。方法:应用平行平板流动腔模拟动静脉内瘘静脉端管腔,培养基模拟血流产生剪切力,以脐静脉内皮细胞模拟静脉血管内皮细胞。低于生理水平剪切力、生理水平剪切力和超生理水平剪切力叁种力作用于静脉血管内皮细胞。剪切力作用时间分别为0小时、6小时、12小时和24小时。应用Western blotting和RT-PCR等方法检测不同剪切力和不同时间下Cav-1、p-ERK、t-ERK、NF-κB等的表达水平。结果:在生理性剪切力作用下,随着时间的延长内皮细胞表达Cav-1水平逐渐下降,而细胞因子NF-κB、p-ERK的水平随时间延长表达水平增多。而在不同剪切力作用12小时情况下,内皮细胞表达Cav-1的水平随作用力的增强而增多,细胞因子NF-κB、p-ERK的表达在低于生理性剪切力的作用下明显较多且具有统计学意义,其他剪切力情况下表达差异无统计学意义。结论:剪切力的作用时间和剪切力的强度对Cav-1的表达均有明显的影响。细胞因子NF-κB、p-ERK的表达具有时间依赖性,且低剪切力的作用对表达的影响较大。因此低剪切力和长期的作用对内皮细胞功能的影响较大,可能与内瘘血管的内膜增生、血栓形成和局部平滑肌细胞的迁移有关。第叁部分尿毒症环境下剪切力对静脉内皮细胞的影响目的:终末期肾病患者在CKD晚期开始出现血肌酐、钙磷代谢紊乱和代谢性酸中毒等并发症。而这些因素在一定程度上影响了血管内皮细胞功能,造成内皮细胞损伤。因此研究尿毒症环境中,血流剪切力对内皮细胞的影响至关重要。方法:在培养基中加入一定浓度尿毒症患者血清模拟尿毒症环境,应用平行平板流动腔模拟血流剪切力。低于生理水平剪切力、生理水平剪切力和超生理水平剪切力叁种力作用于静脉血管内皮细胞。剪切力作用时间分别为0小时、6小时、12小时和24小时。应用Western blotting和RT-PCR等方法检测不同剪切力和不同时间下Cav-1、p-ERK、t-ERK、NF-κB等的表达水平。结果:在尿毒症环境中,在生理性剪切力作用下,随着时间的延长内皮细胞表达Cav-1水平也呈逐渐下降,但整体表达水平均较低。细胞因子NF-κB、p-ERK的水平随时间延长表达水平增多,但是12小时后增速变缓。而在不同剪切力作用12小时情况下,内皮细胞表达Cav-1的水平随作用力的增强而增多,细胞因子NF-κB、p-ERK的表达在低于生理性剪切力的作用下明显较多且具有统计学意义,其他剪切力情况下表达差异无统计学意义。结论:在尿毒症环境中,剪切力的作用时间和剪切力的强度对Cav-1的表达均有影响。作用时间越长,细胞因子NF-κB、p-ERK的表达越多。低剪切力对细胞因子NF-κB、p-ERK表达的影响较大。因此,在尿毒症环境中,低剪切力和长期的作用仍是内皮细胞功能活化的有效刺激因素,其与内瘘血管的内膜增生、血栓形成和局部平滑肌细胞的迁移有关。
孙惠文[3]2007年在《剪切力介导血管内皮细胞表达基质金属蛋白酶9及其信号转导通路的研究》文中研究指明背景在众多复杂的动脉粥样硬化发病学链条中，血流动力学因素始终占据着重要的环节。Pober和Cotran总结大量有关血流动力学与动脉粥样硬化(AS)关系的研究成果，提出了动脉粥样硬化发病学的剪切应力学说(shear stress hypothesis)，认为血流剪切力异常是促使动脉粥样硬化病变形成的重要原因。在正常血管内膜表面可以观察到，血流动力对内皮细胞的形态有明显的影响。管状动脉内始终以层流形式为特征，其内皮细胞呈现椭圆体状，并以同轴的形式沿血流方向排列；在血管分支或明显弯曲处出现血管几何学相关的复杂涡流，内皮细胞的形状趋向多角形并缺乏特定的排列方向。血流状况的慢性变化可以引起动脉壁结构重塑，改变细胞增殖与死亡和细胞外基质的合成与降解的平衡。动脉粥样硬化尸检材料和实验动物模型中所观察到的早期动脉粥样硬化的非随机化分布特点，可以作为血流动力在动脉粥样硬化发病中起重要作用的佐证。根据血管内皮细胞精细调节多种“血管保护”效应分子的反应能力和流体机械力调节内皮细胞基因表达的潜能，剪切应力学说认为，均匀的层流剪切应力可选择性地诱导内皮“粥样硬化保护性基因”的表达，从而作用于局部以抵消全身性危险因素的有害作用。血流动力学因素异常出现层流剪切应力不均匀，内皮细胞分泌抗动脉粥样硬化分子减少，这时高胆固醇血症、高半胱氨酸血症等危险因素的持续作用即可促使动脉粥样硬化病变发生。动脉分叉处和转弯处可出现紊乱的血流方式，如低幅波动的壁剪切应力、分流和逆流。动脉的这些部位是最易受损的区域，也正是动脉粥样硬化典型病变的易发位点。显然，动脉粥样硬化灶性分布特点主要由血流动力学因素介导的血管易损性程度所决定，而与危险因素或其他相关因素本身无关。该定位分布特点在人体和实验动物均已得到证实，这有力地说明剪切应力与动脉粥样硬化病变发生部位的紧密关系。基质金属蛋白酶9(MMP-9)是明胶酶的一种，又称明胶酶B，在体内可被多种细胞，如内皮细胞、血管平滑肌细胞、单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、中性粒细胞等分泌。MMP-9的主要作用是降解细胞外基质(ECM)，能降解血管内膜下细胞外基质，导致白细胞渗透进入血管壁，平滑肌细胞迁移至发展中的新生内膜。而这两个过程是动脉粥样硬化发生发展所必需的。MMP-9的表达及活性增强与AS的发生、发展密切相关。整合素是连接细胞外基质和细胞内骨架系统的主要受体。研究表明整合素在机械信号转导过程中起着重要的作用。然而，有关剪切应力是否导致MMP-9在内皮细胞中表达及其关系尚未明了。对其信号转导过程的调节还未见报道。因此我们提出了这样的假设：低剪切力和震荡剪切力通过膜整合素诱导内皮细胞表达基质金属蛋白酶9；而生理性剪切力可抑制血管内皮细胞对MMP-9的表达。研究目的1、明确不同的剪切力对血管内皮细胞表达MMP-9的影响。2、通过应用膜整合素的功能阻断抗体明确剪切力是否是通过膜整合素影响内皮细胞表达MMP-9。研究方法1．人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的原代培养与鉴定1．1人脐静脉内皮细胞的原代培养无菌获取剖宫产新生儿脐带15-20cm，剪去钳痕，将16号注射针头磨平，插入一端的脐静脉腔内，用止血钳夹闭，以PBS冲洗脐静脉管腔，至洗出液澄清无血迹。将脐带另一端用止血钳夹闭，注入0.1％Ⅱ型胶原酶或0.25％胰酶+0.02％EDTA(V／V=1／1)10-15ml，于超净台上室温消化10-13min，其间可用手轻轻揉捏脐带，促进消化。用无菌空针将酶抽出，置于离心管内，再以PBS冲洗管腔，洗出液置于离心管内，加入2ml胎牛血清终止消化。1000rpm，离心8-10min，于超净台上将离心管内的上清液倒掉，以全培养基[M199+20％胎牛血清+40ng／mlVEGF(或贝复济2ul／ml)+青霉素100U／ml+链霉素100ug／ml]将细胞重新悬浮，转移至25cm~2的培养瓶内，置于37℃、5％CO_2孵箱中培养，12-24h后换液，清除未贴壁细胞，若培养液中含较多红细胞，可先以预温的PBS洗两遍，再加M199。以后每3-4天换液一次。1．2传代待原代细胞融合成单层后，用PBS将细胞洗两遍，以去除血清，加入0.25％胰酶2ml，孵箱内消化3-5min，在倒置相差显微镜下观察见细胞变成圆形，吸出胰酶，加入培养基[M199+10％胎牛血清+40ng／mlVEGF(或贝复济2ul／ml)+青霉素100U／ml+链霉素100ug／ml]，轻轻吹打，待细胞全部悬浮，按10~5个／ml分装，放回37℃孵箱中继续培养。1．3内皮细胞鉴定免疫荧光法检测CD31：HUVECs接种于预先置于细胞培养板内的盖玻片上，至细胞长成单层，弃培养液，PBS洗3次，加入95％乙醇固定30min，PBS冲洗，采用免疫荧光染色：滴加1：10兔抗人CD31抗体血清，再滴加1：40荧光素标记的羊抗兔免疫荧光抗体，设阴性及空白对照。荧光显微镜下观察、拍片。2．流室载玻片的准备将普通载玻片选择适合流室尺寸者用清水洗净晾干后泡酸24小时，再用清水冲洗、恒温箱中烘干，高温高压灭菌，于超净台上铺1％明胶，半小时后将玻片上的明胶吸除，备用。3．应力干预的实验分组3．1不同作用时间下，低剪切力对HUVECs表达MMP-9 mRNA及蛋白质活性的影响1)静态对照组：不给予剪切力，细胞在静态下培养。2)低剪切力(4 dyn／cm~2)1小时组：给予低剪切力作用1小时，以观察MMP-9 mRNA及蛋白质活性的变化。3)低剪切力(4 dyn／cm~2)3小时组：给予低剪切力作用3小时，以观察MMP-9 mRNA及蛋白质活性的变化。4)低剪切力(4 dyn／cm~2)6小时组：给予低剪切力作用6小时，以观察MMP-9 mRNA及蛋白质活性的变化。5)低剪切力8小时组：给予低剪切力作用8小时，以观察MMP-9 mRNA及蛋白质活性的变化。3．2在相同的作用时间下(6小时)，不同的剪切力对HUVECs表达MMP-9 mRNA及其蛋白质活性的影响1)静态对照组：细胞不给予任何剪切力。2)低剪切力组：给予低剪切力(4 dyn／cm~2)作用6小时，观察低剪切力对MMP-9 mRNA及蛋白质活性的影响。3)震荡剪切力组：给予震荡剪切力(±5dyn／cm~2，1HZ)作用6小时，观察低剪切力对MMP-9 mRNA及蛋白质活性的影响。4)生理性剪切力(12 dyn／cm~2)：给予生理性剪切力(12 dyn／cm~2)作用6小时，观察低剪切力对MMP-9 mRNA及蛋白质活性的影响。3．3不同剪切力作用下，膜整合素对HUVECs表达MMP-9 mRNA及其蛋白质活性的影响1)对照组：不加任何一种抗体。2)膜整合素β1组：加入膜整合素β1的功能阻滞抗体于孵箱内培养2小时后，再给予低剪切力和震荡剪切力分别作用6小时，以观察整合素β1对剪切力介导的MMP-9 mRNA及蛋白质活性的影响。3)膜整合素β3组：加入膜整合素β3的功能阻滞抗体于孵箱内培养2小时后，再给予低剪切力和震荡剪切力分别作用6小时，以观察整合素β3对剪切力介导的MMP-9 mRNA及蛋白质活性的影响。4)膜整合素αvβ3组：加入膜整合素αvβ3的功能阻滞抗体于孵箱内培养2小时后，再给予低剪切力和震荡剪切力分别作用6小时，以观察整合素αvβ3对剪切力介导的MMP-9 mRNA及蛋白质活性的影响。4．探针实时定量RT-PCR根据厂家说明，以Trizol(Invitrogen)自HUVECs中提取总RNA。用MLV试剂盒(Promega)于42℃、1小时的条件下进行逆转录。于Light Cycler(Roche Applied Science，USA)上实行实时定量PCR。每个样本重复叁次测量。MMP-9扩增引物(GenBank NM004994)：上游5′-cctggagacctgagaaccaatc-3′，下游5′-gatttcgactctccac gcatc-3′，MMP-9探针序列5′-taccgctatggttacactcgggtggc-3′；GAPDH扩增引物，上游(GenBank M33197)5′-ggaaggactcatgaccacagt-3′下游5′-gccat cacgccacagtttc-3′，GAPDH探针序列5′-tgccatcactgccacccag aagac-3′。扩增条件为：退火62℃、5秒，延伸72℃、10秒，以Light Cycler软件4.0(Roche Applied Science，USA)分析数据。MMP-9 mRNA表达以管家基因GAPDH进行标化。5．SDS-PAGE酶谱法用透析袋将条件培养液浓缩30倍。以SDS-PAGE在含1mg／ml明胶的8％聚丙烯酰胺凝胶中将蛋白分离。电泳后，室温下用冲洗缓冲液于摇床上漂洗1小时，然后在含50 mM Tris-Cl，pH 7.4，75 mM NaCl and 2.5 mM CaCl2的缓冲液中孵育过夜。用考马斯亮兰R-250中对凝胶进行染色后在45％甲醇和乙酸中脱色。最后将凝胶置于扫描仪上进行扫描，观察结果。6．Western Blot分析用透析袋将剪切应力处理过的培养液浓缩30倍，提取蛋白，煮沸5分钟。以SDS-PAGE电泳将等量蛋白分离，然后转至硝酸纤维素膜上。5％的脱脂牛奶封闭，室温震荡1-2小时，以TBST洗膜叁次，分别10、5、5分钟。以适当浓度的一抗4°C过夜(抗TIMP-1 1：100)。过夜后TBST洗膜。二抗孵育1小时(1：2000)后用TBST洗膜。最后采用增强化学发光法观察结果。7．统计学分析实验结果以均数±标准误表示。用SPSS13.0软件中的单因素方差分析对实验结果进行分析，p＜0.05时，差异具有统计学意义。结果1、不同作用时间下，低剪切力对HUVECs表达MMP-9 mRNA及蛋白质活性的影响将HUVCECs暴露于低剪切力1小时，MMP-9 mRNA的水平与静态时没有明显变化，但当分别作用3、6、8小时时，mRNA水平呈时间依赖性增加。将细胞培养上清液用透析袋浓缩30倍，以胶原酶谱法检测MMP-9的蛋白质活性发现，低剪切力作用于HUVECs 3小时，蛋白质活性无明显变化，6小时后，活性水平比静态时升高3.3倍，但比作用8小时后要低。经Western Blot检测，MMP-9特异性抑制因子TIMP-1的蛋白水平并未随MMP-9蛋白质活性增加而增加。2、在相同的作用时间下(6小时)，不同的剪切力对HUVECs表达MMP-9 mRNA及蛋白质活性的影响探针实时定量RT-PCR显示，震荡剪切力作用6小时后，MMP-9 mRNA的水平比静态对照组增加了6倍，比低剪切力组增加了1.6倍，然而生理性剪切力作用6小时后，其水平比静态对照组降低了3倍，比低剪切力组降低了10倍。胶原酶谱法检测细胞培养上清液中的MMP-9蛋白质活性显示，震荡剪切力作用6小时后，与静态对照组相比，活性水平增加1.7倍，与低剪切力组相比，增加1.3倍；而生理性剪切力作用6小时后，蛋白质活性较静态对照组降低4倍，较低剪切力组降低了7倍。3、不同剪切力作用下，膜整合素对HUVECs表达MMP-9 mRNA及蛋白质活性的影响将膜整合素β1、β3、αvβ3功能阻滞抗体分别与HUVECs共培养2小时，然后分别予以低剪切力或震荡剪切力6小时，探针实时定量RT-PCR结果显示，与无抗体干预组相比，这叁种抗体均能明显抑制HUVECs对MMP-9 mRNA的表达，胶原酶谱法亦显示MMP-9的蛋白质活性被这叁种抗体明显抑制。创新点1．本研究在体外培养的HUVECs中观察到，不同的剪切力对其表达基质金属蛋白酶9 mRNA及其蛋白质活性具有不同的调节作用。2．我们的研究结果表明，膜整合素参与了剪切力诱导HUVECs表达MMP-9的力学信号转导通路。结论1．低剪切力及震荡剪切力均能诱导体外培养的HUVECs对MMP-9 mRNA的表达，且增加MMP-9蛋白质活性，而生理性剪切力却能抑制HUVECs对MMP-9 mRNA的表达及其蛋白质活性，明确了力学与血管内皮细胞表达MMP-9的关系。2．不同的剪切力通过膜整合素诱导HUVECs表达MMP-9 mRNA及蛋白质，膜整合素亚型β1、β3、αvβ3在该过程中起主要作用，进一步阐明了力学影响内皮细胞表达MMP-9的可能机制。背景Pober和Cotran在总结大量研究血流剪切应力和动脉粥样硬化之间的关系的研究成果的基础上，提出了动脉粥样硬化发病学的剪切应力学说(shear stress hypothesis)，认为血流剪切应力异常是促使动脉粥样硬化病变形成的重要原因。血管内皮细胞(Endothelial cell，EC)衬于血管的内壁，直接承受着血液流动产生的剪切力。血流动力学因素异常出现层流剪切应力不均匀，内皮细胞分泌抗动脉粥样硬化分子减少，这时高胆固醇血症、高半胱氨酸血症等危险因素的持续作用即可促使动脉粥样硬化病变发生。动脉分叉处和转弯处可出现紊乱的血流方式，如低幅波动的壁剪切应力、分流和逆流。动脉的这些部位是最易受损的区域，也正是动脉粥样硬化典型病变的易发位点。显然，动脉粥样硬化灶性分布特点主要由血流动力学因素介导的血管易损性程度所决定，而与危险因素或其他相关因素本身无关。该定位分布特点在人体和实验动物上均已得到证实，这有力地说明剪切应力与动脉粥样硬化病变发生部位的紧密关系。基质金属蛋白酶9(MMP-9)是明胶酶的一种，又称明胶酶B，在体内可被多种细胞，如内皮细胞、血管平滑肌细胞、单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、中性粒细胞等分泌。它为降解细胞外基质(ECM)所需，能降解血管内膜细胞外基质，导致白细胞渗透进入血管壁，平滑肌细胞迁移至发展中的新生内膜。而这两个过程是动脉粥样硬化发生发展所必需的。MMP-9的表达及活性增强与AS的发生、发展密切相关。我们的研究已证明，在体外培养的HUVECs中，低剪切力和震荡剪切力能够刺激MMP-9 mRNA的表达及增加其蛋白质活性，而生理性剪切力能够抑制此种表达。但对其信号转导通路未完全清楚。整合素是一组跨膜糖蛋白，是连接细胞外基质与细胞内骨架蛋白的桥梁，能在细胞膜上进行双向的信息传递：来自细胞内的信号可调控整合素与细胞外配体的结合活性(inside-out signaling)，同时，细胞外的信号可通过整合素传递至细胞内，引发细胞的生物学功能的改变(outside-in signaling)。研究证明，整合素是一种机械感受器，依赖整合素的信号传导途径参与了血管内皮细胞对剪切应力的反应。整合素可激活胞质内多种蛋白质激酶(如MAPKs)，引发细胞内的信号传递过程。我们的研究已证实，膜整合素参与了剪切力诱导的MMP-9表达的调节，但其下游分子尚不明了。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是介导细胞反应的重要信号系统，在炎症的发生、发展和细胞因子的生成中起重要的作用。目前哺乳动物细胞中已发现4种MAPK信号分子，即ERK1／2、JNK、p38和ERK5亚家族。已有研究表明，MAPK参与了力学信号在细胞内的信号转导过程，但其与剪切力诱导的MMP-9表达的关系尚不清楚。目前在血管内皮细胞上已发现至少有四种转录因子可被剪切力激活，其中包括核转录因子κB(NF-κB)。研究证明：剪切应力刺激诱导血管内皮细胞IκB的磷酸化和降解；可促使其亚单位p50、p65向核内转移，与特异的DNA序列结合，调节目的基因的表达。上述情况说明，剪切力能分别激活整合素、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核转录因子κB(NF-κB)以及基质金属蛋白酶9(MMP-9)，然而，剪切力在诱导内皮细胞分泌表达MMP-9过程中与整合素、MAPKs及NF-κB之间的信号转导关系尚未见报道。研究目的我们在第一部分已证明，低剪切应力和震荡剪切应力可诱导HUVECs表达MMP-9，而且这一表达是通过膜整合素来完成的。在这一部分，我们的主要研究目的是：1．低剪切力能否通过MAPKs诱导内皮细胞表达MMP-9；2．低剪切力能否通过NF-κB诱导内皮细胞表达MMP-9；3．低剪切力能否通过膜整合素-MAPKs-NF-κB这一途径诱导内皮细胞表达MMP-9，明确低剪切力刺激内皮细胞表达MMP-9的信号转导通路。方法1．人脐静脉内皮细胞的原代培养与鉴定人脐静脉内皮细胞根据Jaffe等的方法，本室加以改进。具体操作方法详见第一部分。2．玻片上内皮细胞的种植将经胰蛋白酶消化后的悬浮内皮细胞种植于用明胶处理过的载玻片上，利用流体表面张力将其限制在玻片范围。小心移至CO_2孵箱(37℃，5％CO_2)，5-8h待细胞贴壁后，在置载玻片的培养皿内加入全M199培养液，隔日换液，细胞长满汇合后换含1％血清培养基继续孵育12-16h，用于后续实验．3．流室系统流室系统由四川大学华西医学中心生物医学工程实验室设计并提供标准数据，成都西木子公司承接制造。流室系统由两块透明有机玻璃平板和环行硅橡胶垫圈组成。硅橡胶垫圈置于两块平板之间，可防止渗漏。安装后流室的尺寸为：长8.5cm，宽2.6cm，高0.55mm。流入孔和流出孔间距离为7.0cm．(见第一部分图1．1)。经理论计算，流室测试区满足：(1)层流：(2)二维流动；(3)充分发展的流动。具体结构请参看第一部分。4．应力加载的实验分组实验采用3-9代细胞。以2×10~5的浓度接种于处理好的载玻片上，置于无菌培养皿中。8小时待细胞贴壁后，在培养皿中加入培养液，待细胞融合至80％时，将细胞分组用于实验。4．1 NF-κB调节低剪切应力(4dyn／cm~2)介导的HUVECs对MMP-9 mRNA的表达及其蛋白质活性1)静态组：不给予任何力，也不给予任何抑制剂。2)对照组：分别给予HUVECs低剪切力15、30分钟、1、6小时，观察在不加NF-κB抑制剂SN50的条件下，低剪切力对NF-κB抑制子IκBα、p65的DNA结合活性及MMP-9 mRNA表达及其蛋白质活性的影响。3)SN50组：先予以HUVECs18μM SN50，于孵箱中培养2小时，再给予低剪切应力6小时，观察NF-κB对低剪切力介导的MMP-9 mRNA表达及其蛋白质活性的影响。4．2 MAPKs对低剪切力(4 dyn／cm~2)介导的NF-κB／MMP-9信号转导通路的影响1)静态组：不给予任何力，也不给予任何抑制剂。2)对照组：分别给予HUVECs低剪切力5、10、15、30分钟、1、6小时，观察在无MAPKs抑制剂的条件下，低剪切力对MAPKs各亚单位磷酸化水平、IκBα的水平、p65的DNA结合活性及MMP-9 mRNA表达及其蛋白质活性的影响。3)PD98059组：先给予HUVECs 20μM ERK抑制剂PD98059于孵箱中培养2小时，再给予低剪切应力作用5、15分钟、1、6小时，观察PD98059对ERK磷酸化的抑制效果及ERK对低剪切力介导的IκBα降解、p65 DNA结合活性及MMP-9 mRNA表达及其蛋白质活性的影响。4)SB203580组：先给予HUVECs 5μM p38 MAPK抑制剂SB203580于孵箱中培养2小时，再给予低剪切应力作用5、15分钟、1、6小时，观察SB203580对p38 MAPK磷酸化的抑制效果及p38 MAPK对低剪切力介导的IκBα降解、p65 DNA结合活性及MMP-9 mRNA表达及其蛋白质活性的影响。5)SP600125组：先给予HUVECs 18μM JNK抑制剂SP600125于孵箱中培养2小时，再给予低剪切应力作用15分钟、1、6小时，观察SP600125对JNK磷酸化的抑制效果及JNK对低剪切力介导的IκBα降解、p65 DNA结合活性及MMP-9 mRNA表达及其蛋白质活性的影响。4．3膜整合素对低剪切力介导的MAPK／NF-κB／MMP-9信号转导通路的影响1)静态组：不给剪切力，也不给任何抑制剂。2)对照组：给予低剪切力作用5、15分钟、1、6小时，在无膜整合素抑制剂GRGDNP的条件下，观察低剪切力对MAPKs各亚单位磷酸化水平、IκBα的水平、p65的DNA结合活性及MMP-9 mRNA表达及其蛋白质活性的影响。3)GRGDNP组：先给予HUVECs 50μM GRGDNP，于孵箱中培养2小时，再给予低剪切应力作用5、15分钟、1、6小时，观察低剪切力对MAPKs各亚单位磷酸化水平、IκBα的水平、p65的DNA结合活性及MMP-9 mRNA表达及其蛋白质活性的影响。5．实验方法采用探针实时定量RT-PCR方法检测HUVECs MMP-9 mRNA的表达量；以胶原酶谱法检测细胞培养上清液中MMP-9的蛋白质活性；用western blot方法检测MAPKs各亚单位的磷酸化水平及IκBα的水平；用TransAM~(TM) NF-κB p65转录因子检测试剂盒来检测NF-κB p65与DNA的结合活性。6．统计学分析实验结果以均数±标准误表示。应用SPSS13.0软件，采用单因素方差分析对实验结果进行分析，p＜0.05为差异具有统计学意义。结果1．NF-κB调节低剪切应力(4dyn／cm~2)介导的HUVECs对MMP-9 mRNA的表达及其蛋白质活性将HUVECs暴露给低剪切力0、15、30分钟后，收集细胞，提取蛋白，用Western Blot方法检测IκBα的蛋白水平，发现随着时间的推移，其表达量逐渐减弱；给予细胞低剪切力1小时，收集细胞，提取核蛋白，用TransAM~(TM) NF-κB p65转录因子检测试剂盒来检测NF-κB p65与DNA的结合活性，结果显示，经低剪切力作用后，与静态组比较，p65与DNA的结合活性明显增强(p＜0.01)；用抑制NF-κB核转移的细胞渗透肽SN50预培养HUVECs2小时后，给予低剪切力1小时，发现SN50明显抑制了p65与DNA的结合活性(p＜0.05)；用SN50预处理细胞2小时，置于流室系统6小时，发现该肽能明显抑制MMP-9 mRNA的表达及降低其蛋白质活性(p＜0.01)。2．MAPKs对低剪切力(4 dyn／cm~2)介导的NF-κB／MMP-9信号转导通路的影响将HUVECs分别置于流室系统0、5、10、15、30分钟，用Western Blot方法检测ERK1／2、p38 MAPK、JNK1／2的蛋白磷酸化水平，结果显示：ERK1／2、p38 MAPK的磷酸化在5分钟达到高峰，JNK1／2的磷酸化则在15分钟达高峰；根据该结果，将HUVECs分别与ERK1／2的抑制剂PD98059 20μM、p38 MAPK抑制剂SB203580 5μM共培养2小时，再分别给予低剪切力5分钟，结果显示，MMP-9的mRNA表达及其蛋白质活性水平被明显抑制；将HUVECs用JNK1／2的抑制剂SP600125 18μM预处理2小时，再给予低剪切力作用15分钟，MMP-9的mRNA表达及其蛋白质活性水平不能被其抑制。将HUVECs用PD98059和SB203580预处理2小时，再分别给予低剪切力15分钟或1小时，结果显示，IκBα的水平明显升高，NF-κB的DNA结合活性却明显被抑制。3．膜整合素对低剪切力介导的MAPKs／NF-κB／MMP-9信号转导通路的影响以膜整合素抑制剂GRGDNP50μM与HUVECs共培养2小时后，给予低剪切力6小时，实时定量RT-PCR和胶原酶谱法结果显示，MMP-9的mRNA表达和其蛋白质活性水平明显下降(p＜0.01)。将细胞用GRGNDP预处理2小时，再将其置于流室系统5、15分钟，提取总蛋白，Western Blot检测发现，5分钟后，ERK1／2和p38 MAPK的磷酸化水平明显下降，15分钟后，JNK1／2的磷酸化水平明显下降，IκBα的降解也大大减少。将细胞用GRGNDP预处理2小时，再将其置于流室系统1小时，收集细胞，提取核蛋白，转录因子实验显示，p65的DNA结合活性被明显抑制。创新点在体外培养的人脐静脉内皮细胞中系统阐明了机械剪切力诱导血管内皮细胞表达MMP-9的信号转导机制，即低剪切力和震荡剪切力通过膜整合素-ERK1／2或p38 MAPK-NF-κB途径诱导内皮细胞表达MMP-9。结论1．低剪切力作用下，膜整合素参与了HUVECs对MMP-9表达的调节，增加了MMP-9 mRNA的表达，提高了其蛋白质活性。2．低剪切应力作用下，ERK1／2或p38MAPK参与了HUVECs对MMP-9表达的调节，增加了MMP-9 mRNA的表达，提高了其蛋白质活性。3．低剪切应力作用下，NF-κB参与了HUVECs对MMP-9表达的调节，增加了MMP-9 mRNA的表达，提高了其蛋白质活性。总之，整合素-ERK1／2或p38MAPK-NF-κB信号途径参与了低剪切力介导的内皮细胞对MMP-9 mRNA及蛋白质的表达。
王娟[4]2012年在《JNK1/2在剪切力介导下ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成机制的实验研究》文中研究指明背景动脉粥样硬化、高血压、脑卒中等常见心脑血管疾病的发生都与血液流动时作用于血管的应力密切相关。血液动力学异常是动脉硬化发生的重要成因之一。研究血液动力学-尤其是血流剪切力与血管重构之间的关系,对于阐明动脉粥样硬化疾病的发病机制、探索新的疾病治疗方法具有潜在的理论和应用价值。动脉粥样硬化形成是一个长期的病理过程,其发病机制最主要的有脂质浸润学说、血栓形成学说、单克隆学说和损伤反应等学说。其病理生理表现包括：血管内皮细胞功能障碍、平滑肌细胞浸润增殖、炎症反应、脂质等细胞外基质沉积、斑块形成等。近期研究认为：上述诸因素并不能完全解释为何血管弯曲处和分叉处以及血液反流或有梗阻的地方更易形成斑块,血流动力学因素在AS发生条件中具有主要的作用。因为这些部位的血流动力学特点是剪切力的幅度降低,方向紊乱。而在正常状态下,体内大动脉中的血流剪切力在5～20dynes/cm2(dynes/cm2),平均约为12dynes/cm2,血管内皮细胞多呈规则的梭形排列,其长轴与血流方向平行,此时血流剪切力对血管内膜起保护作用,阻抑动脉粥样硬化的发生、发展,促进新生血管形成。而血流剪切力相对较高的区域不发生动脉粥样硬化斑块,这可能与高血流剪切力区eNOS的表达增多有关。大多数研究动脉粥样硬化发生和血流剪切力关系的实验为临床病例观察或体外实验,Cheng C等学者应用改进的血管周围剪切力诱发装置(也被成为套管)在动物体内改变血流剪切力,对比研究了不同剪切力对载脂蛋白E(apolipoprotein E)基因敲除小鼠动脉粥样硬化发生的作用,发现低血流剪切力区及振荡剪切力区所形成动脉粥样硬化斑块的性质,认为低血流剪切力斑块与振荡剪切力斑块相比,含有更多的脂质成分,而血管平滑肌细胞及胶原含量均少于振荡剪切力斑块；且在低剪切力区,动脉粥样硬化斑块更容易形成缺乏血管平滑肌细胞的薄纤维帽。血管腔的内皮细胞持续暴露在血流动力学的剪切力中,内皮细胞上的感受器能感受血流剪切力的变化,将这种机械刺激通过激活特定的信号通路调节不同基因和蛋白质的表达影响内皮细胞和平滑肌的结构和功能(如增殖、凋亡、迁移、通透性、结构重塑以及基因表达等),参与血管的重塑和疾病的发生。在人类已发现的518个蛋白激酶系统中,丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)家族在细胞内信号转导和功能调节中发挥重要作用。MAPK主要包括ERK1/2、JNK、p38和BMK/ERK5这四条经典途径,广泛参与细胞的生长、增殖到凋亡的过程。其中JNK(c-Jun NH2-terminal kinases)家族,因为它对物理、化学和生理应激刺激(如紫外线、渗透压变化、感染、细胞因子等)感受敏感也被称为应激活化蛋白激(stress-activated-MAPkinases, SAPK),是哺乳动物内发现的第叁类MAPK家族。JNK在传导胞外信号至核转录因子时起着重要作用,可以提高转录能力。JNK蛋白可由3个基因编码,JNKl和JNK2基因存在于多种组织,而JNK3基因局限于在脑、心脏、睾丸中表达。JNK基因通过选择性剪接而产生10种JNK形式,激活的方式分为小G蛋白依赖性途径和小G蛋白非依赖性途径。JNK通路已被证实可被层流剪切力激活,通过G蛋白、P13K、Src以及MEKK1的上调JNK分子后结合AP-1等转录因子引起下游效应分子MCP-1、IL-8、VCAM以及胞外基质的代谢等变化在动脉粥样硬化形成中发挥作用。在给与JNK抑制剂SP60025的野生小鼠和JNK2-/-apoE-/-敲基因小鼠中均能观察到动脉粥样硬化斑块形成明显减少。这些都说明血流剪切力可以通过细胞感受器启动JNK通路调控内皮细胞的生长代谢,影响动脉粥样硬化的发生发展。另一方面,早期动脉粥样硬化发生的病理学特征被认为是促炎因子激活后影响内皮功能紊乱启动的炎症反应过程。许多实验证实剪切力通过JNK信号通路引起内皮功能改变、粘附分子(VCAM、ICAM、P选择素、E选择素等)分泌、单核一巨噬细胞募集迁移、脂质吞噬泡沫细胞生成等改变参与动脉粥样硬化的发生。但研究结果也不尽统一,有文献报道JNK2-/-apoE-/-敲基因小鼠较apoE-/-敲基因小鼠虽斑块明显减少,但VCAM等分子表达无明显差异,这与许多研究报道的JNK广泛参与炎症反应不同一致,因此有待于进一步的研究。且以往对剪切力与动脉粥样硬化形成分子机制的研究大部分通过体外细胞实验模拟血流剪切力来完成,但不能完全复制体内血流的生理状态。因此,我们将对apoE-/-基因敲除小鼠实施颈动脉套管术构建动脉粥样硬化斑块动物模型,人为造成颈动脉处低、高及振荡剪切力血流区域,用于观察不同剪切力与动脉粥样硬化形成部位,大小及稳定性的相互关系。重点研究JNK信号通路在这一过程中的作用,通过给与JNK抑制剂,分组观察不同组别间、不同剪切力在动脉粥样硬化形成的过程中与炎症反应、脂肪沉积和胶原代谢之间的相互关系。明确JNK信号传导通路在不同剪切力介导下对动脉粥样硬化斑块形成中的调节机制,为动脉粥样硬化疾病的治疗提供新的途径。目的1.构建斑块动物模型,人为改变apoE-/-小鼠颈总动脉血流剪切力,形成低、高、振荡剪切力及生理剪切力四个部位。2.采用组织学和分子生物学方法,分组观察JNK抑制剂在不同剪切力介导下对动脉粥样硬化形成的作用。3.进一步探讨JNK通路在不同血流剪切力介导下,引起的生物效应及动脉粥样硬化斑块形成过程中的分子机制。方法1.动物模型的构建和分组：8周龄左右雄性apoE-/-小鼠84只(25-30g),0.08%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠。颈部正中皮肤切开,剥离右侧颈部的腺体和肌肉,暴露右侧颈总动脉,小心分离与之伴行的迷走神经,将长度为2mm、内径为0.3mm的硅胶管(小鼠颈动脉直径为0.5mm)套置于血管外周,2端固定套管,人为造成动脉狭窄,改变此处血流速度,狭窄的近心端由于放置套管造成血液流动相对缓慢为低剪切力；套管部位血流速度较快为高剪切力；狭窄的远心端为振荡剪切力；对侧为生理剪切力。套管放置后小鼠均改用高脂食物喂养,应用小鼠体表超声技术测定不同部位血流的变化和动脉粥样硬化斑块形成的过程。分组：apoE-/-小鼠颈总动脉套管1周后均给以高脂饮食(0.25%胆固醇+15%脂肪),随机分为2组,每组42只,根据参考文献一组腹腔注射SP600125(JNK的抑制剂)0.2mg/kg/d,另外1组同等体积NS腹腔注射作为对照。套管术后10周处死,分离双侧颈总动脉、心脏、肝脏、脾脏、肾脏,脂肪组织留取标本进行检测。2.血液学指标检测：麻醉小鼠灌注血管前经心尖取血静置30分钟自凝后2500rpm离心15分钟,取上层血清,酶法检测血清中总胆固醇(TC)、甘油叁脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平。3.病理组织学检测：(1)每组取15只进行组织学标本处理,分别取材近心端(低剪切力)、套管区(高剪切力)、远心端(振荡剪切力)及对侧颈动脉(生理剪切力),标本用OCT包埋,制作6μ m冰冻切片,连续切片20张。分别行HE染色(用于软件分析斑块的形态学)、Masson染色(显示胶原)、油红0染色(显示脂质)等染色分析各组成分。(2)免疫荧光检测：免疫荧光双标VCAM-1和vWF检测重点观察两组间各不同剪切力部位内皮表达VCAM-1的不同,阐明剪切力的变化与JNK信号通路的调节与粘附分子之间的关系。(3)组织病理学测量：根据每个标本连续切片的组织学染色结果,H&E染色后光镜下摄片,用ImagePro-Plus软件测量血管中层壁厚(MT)和管腔内径(LD),每个标本测量5次,取平均值,并计算二者的比值(MT/LD)。通过直线相关分析判定内中膜厚度,管腔面积和血流剪切力的关系。使用图象分析软件IPP测量VCAM-1的荧光强度变化,比较不同部位的炎症反应程度。4.实时定量PCR(RT-PCR)检测：各组动物取10只颈动脉分段取材近心端(低剪切力)、套管区(高剪切力)、远心端(振荡剪切力)及对侧颈动脉(生理剪切力)新鲜标本,同组同侧提取组织RNA,RT-PCR方法检测ICAM-1,VCAM-1等的表达。5.Western blot检测：取新鲜颈动脉斑块标本,按实验分组分段提取蛋白,采用Western blot方法检测不同部位ICAM-1, VCAM-1,NFκB, JNKl/2的蛋白表达。结果1.M型超声成像评价和血脂水平检测小动物超声M型超声评价套管术后3天近心端(低剪切力区)与对侧颈动脉(生理剪切力)相比,血流速度(Vmax)明显减低,根据公式SS=4μVmax/Ds计算所得的剪切力数值明显低于生理剪切力(P<0.05)。术前及取材时的血脂水平比较结果显示,两组TC及LDL这两个主要的影响动脉粥样硬化发生的指标没有明显差别(P>0.05),说明JNK抑制剂SP600125对循环中的血脂水平没有明显影响,两组间饮食中及血清中血脂水平无明显差异。2.抑制JNK活性明显减少LSS和OSS部位的动脉粥样硬化的发生组织学切片过程中发现,对照组(NS组)的LSS部位及OSS部位斑块的发生率分别为100%和62.5%,两部位比较也有统计学差异(P<0.05),而在HSS和对侧USS部位均无斑块发生。JNK抑制剂组LSS和OSS部位斑块发生率均为13.3%,与同部位的NS组相比明显降低(P<0.05)。HE染色后测量颈动脉内膜-中膜比值(I/M)结果显示生理盐水组LSS部位斑块体积明显大于OSS部位(1.21VS.0.42；P<0.05),HSS及USS部位无明显差异(P>0.05)。JNK抑制剂组LSS及OSS部位与生理盐水同部位相比明显降低(0.02,0.07VS.0.42,1.21；P<0.05)。3.抑制JNK活性后颈动脉各剪切力部位斑块成分的影响油红0检测脂质含量的染色中发现,JNK抑制剂组各部位均无斑块发生,故检测到的脂质含量均较生理盐水组低(P<0.05),而在生理盐水组LSS及OSS部位有明显脂质成分(P<0.05),其中LSS部位较之OSS部位有更明显的脂质含量增高(45.53%VS.13.48%,P<0.05)。MASSON染色观察平滑肌与胶原含量,结果发现斑块发生的两个部位LSS及OSS比较,生理盐水组中LSS较OSS部位胶原含量稍低及平滑肌含量稍高,但无明显统计学差异(P>0.05)。JNK抑制剂组较生理盐水组比较胶原含量稍有升高(24.41%VS17.62%.,P>0.05)而平滑肌含量降低(21.24%VS.26.17%,P>0.05),两组并无统计学差异。4.抑制JNK活性后明显减少LSS及0SS引起的粘附分子等相关分子的表达RT-PCR检测基因表达结果发现,生理盐水对照组中,与USS部位比较,VCAM-1表达明显升高,LSS及OSS部位分别升高12.5倍和4.3倍(P<0.05),而HSS部位无明显差异(P>0.05)。JNK抑制剂明显减少LSS和OSS引起的VCAM-1表达(P<0.05)。Western Blot及免疫荧光检测所得的VCAM-1蛋白表达结果均显示,LSS及OSS部位有明显升高(P<0.05),且LSS较之更高(P<0.05)。而JNK抑制剂组VCAM-1表达均生理盐水组较同一部位明显降低(P<0.05)。进一步检测SP600125对JNK的抑制率,Western Blot显示JNK抑制剂组各部位p-JNK表达均明显降低(P>0.05)。而且,与炎症反应明显相关的转录因子NFκB的活性成分p-p65的表达量在JNK抑制剂组明显低于同部位的生理盐水对照组(P<0.05)。结论1.颈动脉套管人为改变apoE-/-小鼠颈动脉内不同血流剪切力后小动物M型超声测量低剪切数值,证实模型是成功的。2.LSS和OSS均促动脉粥样硬化发生,且LSS的作用更明显；而HSS及USS则显示保护性作用。JNK抑制剂SP600125明显减少LSS及OSS所诱发的动脉粥样硬化的发生。3.抑制JNK基因表达后,相关的VCAM-1、ICAM-1及PECAM-1表达相应发生改变,说明JNK参与了LSS及OSS诱发的VCAM-1表达影响动脉粥样硬化的发生。背景动脉粥样硬化斑块的形成始于血流紊乱,内皮下脂质(LDL)沉积,内皮功能异常,炎症反应加剧。大量研究表明炎症在动脉粥样硬化性成和发展中起重要的作用,从VCAM参与脂质条纹的形成,到ox-LDL及其他炎症因子趋化单核细胞等炎性细胞参与斑块增生,最后纤维帽边缘巨噬细胞募集和基质酶等参与下斑块破裂。在稳定层流作用下内皮细胞分泌一氧化氮、前列环素、利尿钠肽、乙酰肝素及SOD等分子来对抗炎症因子的作用延缓动脉硬化的发生。相反,动脉粥样硬化的发生和进展多在涡流区和低剪切力部位,许多研究也发现低剪切力作用可通过激活转录因子,如NFκB、Egrl (Early growth response1)和API (Activator protein1)等作用来调节炎症的反应,由于NFκB是重要的致炎和致动脉粥样硬化的转录因子,其靶基因如MCP1、ICAM和VCAM的高表达能促进白细胞的聚集和炎症反应。另外在低剪切力区域NF K B激活后,由于NFκB和NO之间的负反馈调节可导致eNOS和其产物NO表达减少参与动脉硬化形成。血管腔的内皮细胞持续暴露在血流动力学的剪切力中,内皮细胞上的感受器能感受血流剪切力的变化,将这种机械刺激通过激活特定的信号通路调节不同基因和蛋白质的表达影响内皮细胞和平滑肌的结构和功能(如增殖、凋亡、迁移、通透性、结构重塑以及基因表达等),参与血管的重塑和疾病的发生。JNK信号通路广泛参与动脉粥样硬化发生的各阶段；而且剪切力通过JNK信号通路引起内皮功能改变、粘附分子(VCAM、ICAM、P选择素、E选择素等)分泌、单核一巨噬细胞募集迁移、脂质吞噬泡沫细胞生成等改变参与动脉粥样硬化的发生。血管内皮细胞表面装配有很多的能感受和传导剪切力的机械力感受器。最近的研究表面,PECAM-1(CD31)除了作为内皮细胞表面标志蛋白外,其感受和传导血流剪切力并进一步调节内皮细胞内信号传导的作用也渐被人重视。CD31能通过激活NFκB和Akt途径在血管重塑过程中调节炎症细胞募集方面发挥重要作用。另一方面,许多体内和体外实验证实CD31通过调节NFκB促进紊乱血流区域动脉粥样硬化的斑块形成。Cuhllmann等研究者报道血流紊乱能上调内皮细胞NFκB活性经由JNK-ATF2信号通路促进动脉管壁炎症的发生。但有些研究显示PECAM1敲基因小鼠并不能激活血流紊乱部位的NF K B和其下游的炎症基因表达。而且此感受器信号传导通路研究并不是十分一致,比如血管内皮细胞中MAPKs(ERK1/2,p38)和AKT通路磷酸化激活有时不依赖于CD31活化。因此我们在实验中重点关注LSS引起的内皮细胞炎症因子的释放是否有JNK参与的信号传导,并且是否有CD31感受传导和NF K B的激活参与。目的1.通过检测VCAM-1表达变化验证文献中4dye/cm2作为低剪切力刺激下的时间依赖性作用,为以下的体外实验选定刺激条件。2.在蛋白水平上比较LSS刺激下JNK表达变化印证体内实验中JNK的作用,进一步通过干扰和抑制剂等方式观察NFκB的表达,推测JNK-NFκB-VCAM1转导通路的可能性。3.进一步探讨PECAM1作为机械力感受器在LSS引起的炎症反应中调节JNK一NFκB-VCAM1表达的作用,初步提出其引起的生物效应新的分子机制。方法1.细胞培养和体外剪切力模拟装置刺激：HUVECs购买自美国ATCC公司,含5%胎牛血清的ECM培养基传代培养,细胞传至第4代进行试验。购买一种Flex5的层流板模拟装置设定4dyn/cm2作为低剪切力刺激细胞。2. siRNA体外转染：HUVECs细胞刺激前分组转染330pmol的人CD31或人JNK1/2的小干扰RNA,混合lul脂质体2000稀释到3ml的Opti-mem培养基中,干扰6小时后或10μ mol/L SP600125抑制剂15分钟后再给予LSS刺激。3.实时定量RT-PCR:LSS或对照组细胞提取RNA后,统一到每一反应体系1μg,按照比例加入反应体系。引物序列为VCAM-1(正义)5'-ATGACATGCTTGAGCCAGG-3'和(反义)5’-GTGTCTCCTTCTTTGACACT-3';β-actin(正义)5'-TGGACATCCGCAAAGAC-3'和(反义)5'-GAAAGGGTGTAACGCAACTA-3'.PCR反应解链95℃5min,扩增36循环95℃10秒,退火56℃30秒,延伸72℃30秒VCAM-1相对表达标准化比β-actin。4.细胞免疫荧光检测：HUVECs经过4%甲醛固定,PBS冲洗后用正常血清封闭,4℃孵育一抗过夜：兔抗鼠p-JNK,兔抗鼠p-NFκB p65。Alexa488结合的驴抗兔的二抗孵育后用含DAPI的封片液封片,激光共聚焦照相保存,Image Pro Plus6.0软件分析表达量。5.Western blot检测：各组刺激后HUVECs收集提取全蛋白,统一浓度到2mg/ml。10%SDS-PAGE电泳后转到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭后TBST洗3次,孵育一抗4℃过夜：兔抗人β-actin,兔抗人t-JNK和p-JNK,大鼠抗人CD31和山羊抗人VCAM-1。TBST冲洗后孵育相应二抗后化学发光液测表达变化。6.数据分析：结果表示为均数±标准差,SPSS16.0软件统计分析。结果1.VCAM-1表达变化与LSS刺激呈时间依赖性LSS4dyn/cm2刺激HUVECs不同时间(0,6,12,18,24hr)后,VCAM-1表达在RNA水平和蛋白水平检测均呈现先生高后减低的趋势,其中以12小时处较对照表达最高(P<0.05),因此以下的实验均采用此刺激条件,即LSS刺激12小时观察各检测指标变化。2.LSS刺激下JNK和NF-κB表达变化与VCAM-1呈现相关性JNK活性(p-JNK/t-JNK)在LSS刺激后的HUVECs中明显升高(4.34-fold,P<0.05),同时LSS刺激12小时后活化的NF-κB(p-p65)表达也明显升高(1.89-fold, P<0.05)。3.CD31和JNK的小干扰RNA的干扰效率检测LSS刺激前首先转染si-CD31或si-JNK以及各自的阴性对照小干扰RNA用来减少目的片段CD31或JNK1/2的表达。通过Western blot检测比较后证实si-CD31(0.35±0.04vs.1.00±0.10对照组；0.30±0.02vs.1.54±0.14低剪切力组；P<0.05)或si-JNK(0.43±0.09vs.1.00±0.12对照组；0.57±0.13vs.1.86±0.11低剪切力组；P<0.05)均明显减少各自蛋白表达。4.抑制CD31表达后明显减少LSS刺激下的JNK活性变化LSS刺激下JNK活性明显上调(P<0.05),经si-CD31预处理后再给予LSS刺激的JNK活性分别下降24.68%(对照组)和31.16%(低剪切力组)(P<0.05)。细胞免疫荧光检测的p-JNK表达变化趋势大致与Western blot结果一致,除了对照组si-CD31预处理后p-JNK减少程度较无干扰组减少无统计学差异。提示CD31参与LSS介导的JNK信号分子的生物学作用。5.JNK活性抑制后明显减少NF-κB和VCAM-1的表达细胞免疫荧光检测显示经si-JNK或SP600125预处理HUVECs后,LSS引起的p-p65表达升高被显着抑制(1.05±0.06和1.16±0.05vs.2.27±0.08；P<0.05),Western blot蛋白定量分析显示相似的结果(P<0.05)。p-p65和VCAM-1水平的变化呈现明显的相关性(r2=0.992,P<0.01)。结论1.体外细胞实验中,HUVECs表达VCAM-1的变化与LSS刺激呈明显的时间依赖性关系,选择LSS刺激12小时作为后续实验的刺激条件。2.JNK的小干扰si-JNK和抑制剂SP600125均能减少LSS引起的HUVECs细胞内NFκB活性和VCAM-1表达量,提示LSS引起VCAM-1表达升高可通过JNK-NFκB途径。3.特异性siRNA减少CD31表达后,LSS刺激下JNK和VCAM-1表达均明显下降,提示CD31至少作为其中之一的机械力感受器参与LSS引起的HUVECs细胞内JNK-NFκB-VCAM1信号转导通路过程。
李立[5]2016年在《EPCs在低剪切应力下归巢机制及作为靶向AS的治疗载体研究》文中进行了进一步梳理心血管疾病是影响人类健康的常见疾病。其中冠状动脉粥样硬化性心脏病是其主要的致死致残性疾病,给患者、家庭、社会带来严重的经济和精神负担。冠状动脉粥样硬化性心脏病是由于冠状动脉粥样硬化斑块狭窄管腔及不稳定斑块破碎引起血栓阻塞血管引起的心肌缺血性疾病。由于冠状动脉粥样斑块及斑块不稳定的病理及发展机制不清晰,成为治疗和逆转动脉粥样硬化斑块的重要挑战。解决冠状动脉粥样斑块发生发展和不稳定化的分子机制和合适的治疗策略成为冠状动脉粥样硬化性心脏病研究中的重中之重。目前认为动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的产生和发展是多细胞多因子参与的血管内膜的慢性炎症。关于粥样硬化病理的假说包括:内皮损伤和脂质浸润学说、氧化学说、血栓形成学说、炎症学说、损伤反应学说、单克隆学说、同型半胱氨酸学说、精氨酸学及剪应力学说等。从大量冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的冠状动脉的病理解剖发现:动脉粥样硬化病变多发生在血管分叉、开口和弯曲处,呈现局部高发的特点,很难用全身因素加以解释。这些部位的血流动力学特点是和全身是不一样的。这也提示我们:血流动力学特性的改变是导致动脉粥样硬化发生发展过程中不可忽略的重要高危因素。冠状动脉粥样硬化导致了什么样的血流动力学改变和其如何影响动脉粥样硬化病理过程的发生发展(科学问题一)。动脉血管处于这种异常的血流状态产生适应性保护反应和适应性加重反应。动脉血管内膜的内皮细胞是对这种异常血流状态最直接和最重要的反应元件细胞。如何筛查这样的适应性的保护性反应分子及其是否可以成为干预和逆转动脉粥样硬化斑块的靶标分子(科学问题二)冠状动脉的血流速度快、如何达到特异性的靶向递送适应性保护分子达到治疗效果是一个重要的工具问题,同时也是解决冠状动脉粥样硬化性心脏病靶向药物递送系统开发的工程难题(科学问题叁)大量的文献报道,在冠状动脉粥样硬化病理情况下,异常的血流状态对于内皮细胞的功能和内膜下炎症稳态、内膜增生具有重要作用,同时介导内皮祖细胞、免疫细胞等归巢到动脉粥样硬化斑块下参与动脉粥样硬化斑块的病理进程。表达谱芯片是常用于高通量评价刺激因子对于细胞全面影响的评价工具,同时也在疾病的解析和靶标分子的筛选方面起着重要的作用。细胞自组装是利用正负电荷相互吸引和细胞表面带有负电荷的原理在细胞表面负载药物分子的工程学方法。我们根据以上的研究背景提出我们的科学假说“通过内皮祖细胞层层自组装适应性保护因子归巢到动脉粥样硬化组织达到逆转治疗动脉粥样硬化斑块”围绕这叁个重要的科学问题和假设,基于以上研究背景我们拟展开以下叁个方面进行深入的研究:一、动脉粥样硬化不稳定斑块异常血流状态归巢EPC及机制研究LSS促进EPCs归巢进入斑块。可能的机制是(a)流体剪切应力可以通过上调血浆血小板释放的腺苷水平来刺激诱导EPCs动员。(b)LSS可引起内皮细胞的损伤,增加血小板活化分子和粘附分子的表达,从而诱导血小板聚集在LSS地区。(C)流体剪切应力刺激诱导血小板表达SDF-1有利于EPCs归巢斑块。二、动脉粥样硬化异常血流状态保护性适应反应分子筛选实时RT-PCR芯片显示,VEGF,PSGL-1,TNC,Thbs4,SOD-1、TNF AIP,PPARγ,PPARα、ApoA1、bcl2a1a表达水平等方面,LSS显着高于OSS领域;而明显高于对照组。但VEGF和VWF只增加了大约两倍,这可能不是内皮祖细胞归巢的主要触发机制。PSGL-1,TNC,以及Thbs4表达显着增加可促进血小板的粘附和激活。同时,实时定量PCR结果显示,实时定量PCR结果显示LSS区域SDF-1表达比对照区高,是在OSS领域SDF-1表达的1.24倍。我们通过文献对芯片转录有差异的蛋白进行调研,发现这些差异性转录的基因主要与冠状动脉粥样硬化细胞粘附、归巢、内膜炎症稳态等具有重要作用。这也从另一方面证明冠状动脉粥样硬化斑块导致的不稳定血流状态,近段的低剪切力和远段的湍流是引起冠状动脉粥样硬化病理进展和斑块纤维帽不稳定破裂的一个重要原因。通过对文献调研和结合表达谱芯片结果的解析,我们筛选到Netrin-1可以作为重要的适应性保护分子。Netrin-1可以促进神经轴突的生长和长入,而且能够促进新生血管的萌芽和新生。对血管组织和神经组织同时具有重要的作用。体外研究表明,Netrin-1可以刺激内皮细胞增殖,迁移和分化成为毛细血管的内皮细胞从而新生血管。Netrin-1对于动脉粥样硬化的病理过程产生了重要的作用。对于调节内膜下炎症和免疫稳态发挥了重要作用。叁、构建明胶/透明质酸自组装负载Netrin-1的EPCs靶向治疗冠状动脉粥样硬化我们成功构建明胶、透明质酸层层自组装、负载Netrin-1的内皮祖细胞递送载体,并且实验证明了层层自组装负载Netrin-1的内皮祖细胞具有一定的靶向趋化动脉粥样硬化炎症环境的能力。这说明明胶、透明质酸层层自组装、负载Netrin-1的工程化内皮祖细胞可能是一种非常有希望的靶向递送药物至不稳定斑块的治疗策略。内皮祖细胞是一种非常有希望的抗冠状动脉粥样药物的生物性载体。利用内皮祖细胞作为抗动脉粥样硬化斑块的药物生物载体,相对于其他常见的化学合成的药物递送系统,其具有较好的生物相容性。内皮祖细胞归巢到动脉粥样硬化斑块的特性作为药物载体具有较高的药物递送效率,并且具有较高的药物负载效率。细胞自组装负载抗冠状动脉粥样硬化斑块药物可以更加有效地趋化迁移到动脉粥样硬化斑块的内膜层达到缓释药物分子的作用。
张力[6]2016年在《瑞舒伐他汀减轻野百合碱诱发的大鼠肺动脉高压》文中提出研究背景肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH)患者远端肺小动脉通常出现特征性的病理改变,这些特征性的病理改变往往包括血管内膜增生并纤维化、丛样病变、中膜增生肥厚、肌化以及血栓形成。肺小动脉的这种持续性病理改变终将导致以血管管腔逐渐闭塞为基本特征的恶性肺动脉血管病变。弥漫性的微血管管腔闭塞最终导致肺动脉血管阻力渐进性增加。长期进行性的肺动脉压升高导致右心功能衰竭。临床常用的治疗药物对PAH有很大的个体差异,总体治疗效果不佳,患者的运动耐量和生存率受到严重影响。随着对PAH机制的阐明,近年来研发的药物如前列腺类似物(前列环素),内皮素受体拮抗剂(波生坦)和磷酸二脂酶5抑制剂(西地那非)在重度PAH患者的血流动力学生活质量及改善预后方面显示了一定的临床效果,但PAH患者长期的预后仍然不容乐观。近年来随着对PAH病理生理机制的研究的进一步深入,认为内皮细胞功能障碍导致的内皮细胞结构、功能以及代谢的改变在肺动脉循环压力升高的发生和发展中起着关键作用。基因突变(微卫星不稳定性、骨形态发生蛋白受体2突变、激活素样激酶1突变)、活性氧、自身免疫、剪切力以及Ang1-Tie2-BMPR1a-BMPR2信号通路缺陷通常会引起肺动脉内皮损伤。损伤的内皮出现功能障碍,导致肺动脉内膜屏障破坏、内膜下暴露于可溶性生长因子、体液失调、内皮细胞紊乱不受控制性增殖、高凝以及细胞因子/生长因子的释放,参与了肺动脉血管的病理性收缩与重构。内皮细胞损伤后,合成引起血管舒张的物质(NO、PGI2)减少,而释放内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)、血管紧张素(Angiotensin,Ang)等血管收缩物质增多,结果导致肺血管收缩。损伤的内皮出现屏障功能异常,一些来自血液中和激活的内皮细胞本身释放的细胞活性因子被激活,导致肺动脉中层平滑肌细胞出现增生肥大。肺动脉压力进行性增加促使肺动脉平滑肌细胞和血管外膜出现适应性增生和肥厚。发生于肺动脉的内皮功能异常还增加各种促栓物质的生成并减少抗栓活性因子的合成分泌,最终使肺循环产生了易栓环境并导致部分肺微循环的血栓形成,微循环血栓形成会使肺动脉管腔出现进一步狭窄,最终导致肺动脉压力的升高。因此,恢复正常的内皮功能是治疗PAH的病理生理基础。内皮祖细胞(EPC)是内皮细胞的前体细胞,来源于骨髓,能在体循环分化为成熟内皮细胞并参与损伤血管内皮的修复。研究表明内皮祖细胞可在某些药物的刺激动员下,由骨髓释放进入外周循环,定向迁移归巢到血管出现损伤的部位,因此在修复损伤的血管内皮细胞,维护正常血管内皮功能中起重要作用。大量证据表明PAH患者中EPCs水平和功能均降低。一些研究已经表明3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶抑制剂对EPCs和e NOS有潜在的调节作用。3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶抑制剂可以动员骨髓EPC的增殖和迁移,增强EPC修复损伤血管内皮细胞的能力。3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶抑制剂还可上调和激活e NOS的表达(参与调节血管功能的一个关键酶)产生内皮衍生舒张因子。目的观察瑞舒伐他汀对MCT诱导的PAH大鼠EPCs和e NOS表达的影响。方法六十只Sprague-Dawley(SD)大鼠均分为叁组:对照组(A组)、PAH+瑞舒伐他汀组(B组),和PAH组(C组)。MCT(60mg/kg ip)腹腔注射诱导PAH。B组大鼠Rosuvastatin(10mg/(kg.day),阿斯利康公司提供)灌胃共6周。治疗前及治疗6周后从各组大鼠股动脉抽取外周血(5毫升)。用M199培养基(含10%胎牛血清)常规分离和培养获得EPC的单个核细胞,6周后取小的和中等大小的肺动脉进行组织学分析。本研究采用RT-PCR和Western blotting检测肺动脉e NOS在m RNA和蛋白水平的表达的变化。结果与A组相比,B组和C组循环EPC的数量和肺动脉e NOS在m RNA和蛋白水平表达均降低(P<0.05),且B组和C组之间有统计学差异(P<0.05)。与C组相比,B组大鼠肺动脉血管病理检测重塑现象减弱。结论1.Rosuvastatin可以增加MCT诱导的PAH大鼠EPCs的数量;2.Rosuvastatin可以上调MCT诱导的PAH大鼠e NOS的表达;3.Rosuvastatin可以改善MCT诱导的PAH大鼠肺动脉重塑,减轻PAH。
陈良[7]2009年在《低剪切力介导内皮细胞表达膜型基质金属蛋白酶1的机制及辛伐他汀干预的研究》文中指出背景动脉粥样硬化致病机理一直是心血管领域的研究热点,先后有血栓形成学说、炎症学说、脂质浸润学说、单克隆学说、损伤反应学说、氧化学说、同型半胱氨酸学说以及精氨酸学说。Pober和Cotran在大量血流动力学与动脉粥样硬化关系的研究成果基础上,提出了动脉粥样硬化发病学的剪切力学说(shear stresshypothesis),认为血流剪切力异常是促使动脉粥样硬化病变形成的重要原因之一。根据血管内皮细胞精细调节多种“血管保护”效应分子的反应能力和流体机械力调节内皮细胞基因表达的潜能,剪切力学说认为,均匀的层流剪切力可选择性地诱导内皮“动脉粥样硬化保护性基因”的表达,从而作用于局部以抵消全身性危险因素的有害作用。血流动力学因素异常出现层流剪切力不均匀,内皮细胞分泌抗动脉粥样硬化分子减少,高胆固醇血症、高半胱氨酸血症等危险因素的持续作用可促使动脉粥样硬化病变的发生。显然,动脉粥样硬化灶性分布特点主要由血流动力学因素介导的血管易损性程度所决定。该定位分布特点在人体和实验动物均已得到证实,这有力地说明剪切力与动脉粥样硬化病变发生部位的紧密关系。研究表明人的动脉管壁处于生理剪切力区域(剪切力≥12dyne/cm~2)有抑制动脉粥样硬化形成的保护性作用,而低剪切力区域(剪切力≤4dyne/cm~2)有促动脉粥样硬化形成作用。膜型基质金属蛋白酶1(membrane type-1 matrix metalloproteinase,MT1-MMP,MMP-14)是唯一锚定于细胞膜上的胶原蛋白酶,其底物广泛包括:胶原,纤连蛋白,层连蛋白,弹性蛋白,纤溶酶原等。实验表明MT1-MMP可以通过促进单核细胞迁移、降解细胞外基质包括胶原等,促进易损斑块的发生和发展。新近实验通过选择性基因敲除和过表达两个方面证实,MT1-MMP通过影响斑块胶原纤维含量在易损斑块的形成过程中起到重要作用。已有实验证实,低剪切力可以上调MMP-2和MMP-9的表达,同时增加其活性,MT1-MMP可以通过活化MMP-2和MMP-9前胶原形式增加其活性。然而,低剪切力与MT1-MMP的关系尚未明了。因此我们提出了这样的假设:低剪切力可诱导MT1-MMP的表达,从而参与动脉粥样硬化斑块的形成。研究目的:1.在低剪切力动物模型中,观察低剪切力对MT1-MMP的作用。2.在体外细胞研究中,明确低剪切力与MT1-MMP的关系。研究方法1.动物模型20只8-10周龄雄性ApoE~(-/-)小鼠,均给予高脂饮食(含0.25%胆固醇和15%脂肪)喂养。通过缩窄性颈总动脉套管建立ApoE~(-/-)小鼠左侧颈总动脉低剪切力动脉粥样硬化斑块模型,右侧颈总动脉假手术对照。2.显微超声测量应用显微超声技术测量小鼠左侧和右侧颈总动脉最大内膜中层厚度(IMT),收缩期内径(Ds),近心端最大血流速度(Vmax)。根据公式τ(N/m~2)=4·Vma·η/Ds,η是血液粘滞系数(采用η=0.035)计算小鼠左右两侧颈总动脉剪切力(τ)。3.病理学检测8周末应用过量戊巴比妥钠注射使小鼠安乐死后,PBS液体灌洗血管,继之灌注4%的多聚甲醛固定液。分离左侧颈总动脉和右侧颈总动脉,取材后标本置于4%的多聚甲醛固定液中浸泡固定12小时,OCT包埋,制作5um冰冻切片,标本每间隔50um即连续切片20张,苏木素-伊红染色。其它相邻切片做免疫组化检测MT1-MMP的分布和含量。4.体外人脐静脉内皮细胞培养及鉴定4.1人脐静脉内皮细胞的原代培养与传代无菌获取剖宫产新生儿脐带15-20cm,冲洗脐静脉管腔。将脐带另一端用止血钳夹闭,注入胰酶于超净台上室温消化5-7 min。将胰酶抽出,置于离心管内,再冲洗管腔,洗出液置于离心管内,加入胎牛血清终止消化。离心10min,于超净台上将离心管内的上清液倒掉,以全培养基将细胞重新悬浮,转移至培养瓶内,置于孵箱中培养,12-24h后换液,清除未贴壁细胞。4.2传代待原代细胞融合成单层后,用PBS将细胞洗两遍,以去除血清,加入0.25%胰酶2 ml,孵箱内消化3-5min,在倒置相差显微镜下观察见细胞变成圆形,吸出胰酶,加入培养基,轻轻吹打,待细胞全部悬浮,按10~5个/ml分装,放回37℃孵箱中继续培养。4.3内皮细胞鉴定免疫荧光法检测CD31、CD34和Ⅷ因子:HUVECs接种于预先置于细胞培养板内的盖玻片上,至细胞长成单层,弃培养液,PBS洗3次,加入95%乙醇固定30min,PBS冲洗,采用免疫荧光染色,滴加相应抗体血清,再滴加1:40荧光素标记的羊抗兔疫荧光抗体,设阴性及空白对照。荧光显微镜下观察、拍片。5.内皮细胞剪切力干预分组5.1不同作用时间下,低剪切力对脐静脉内皮细胞表达MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的影响1)静态对照组:不给予剪切力,细胞在静态下培养。2)低剪切力1小时组:给予低剪切力(4 dyne/cm~2)作用1小时,以观察MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的变化。3)低剪切力3小时组:给予低剪切力(4 dyne/cm~2)作用3小时,以观察MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的变化。4)低剪切力5小时组:给予低剪切力(4 dyne/cm~2)作用5小时,以观察MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的变化。5.2相同作用时间下,不同剪切力对脐静脉内皮细胞表达MT1-MMP mRNA及其蛋白质活性的影响1)静态对照组:细胞不给予任何剪切力。2)低剪切力组:给予低剪切力(4 dyne/cm~2)分别作用1、3、5小时,观察低剪切力对MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的影响。3)生理剪切力组:给予生理性剪切力(12 dyne/cm~2)分别作用1、3、5小时,观察低剪切力对MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的影响。6.实时定量RT-PCR根据试剂盒说明,以Trizol自HUVECs中提取总RNA。用M-MLV试剂盒进行逆转录。于Light Cycler上实行实时定量PCR。每个样本重复叁次测量。MT1-MMP扩增引物:上游5'-ACGTGCAGCAGCATTGGA-3',下游5'-CAACAGGAGCAAGTGTGCCTTC-3';β-actin扩增引物,上游5'-TGGACATCCGCAAAGAC-3',下游5'-GAAAGGGTGTAACGCAACTA-3'。反应结束得到循环阈值(Ct值),用相对定量的方法(2~(-ΔΔCt))来分析数据。MT1-MMP mRNA表达以管家基因β-actin进行标化。7.Western Blot分析收集细胞后,提取总蛋白,煮沸5分钟。以SDS-PAGE电泳,然后转膜,封闭,洗膜叁次。以适当浓度的一抗4℃过夜后,洗膜。二抗孵育、洗膜,最后采用增强化学发光法观察结果。8.MT1-MMP活性测定收集细胞后,加入适量蛋白提取液,收集上清液待查。吸取待测蛋白以及蛋白标准品加入96孔板中,轻轻摇晃20s,4℃孵育过夜。洗板4次,每孔滴加结合液50ul,混匀,滴加50ul反应试剂,摇晃20s混匀,在405nm读取t_0值。37℃孵育2.5h,摇晃20s,405nm读取t值。由标准品浓度根据浓度和(t-t_0)×1000/6.25呈线性关系描绘标准曲线,由标准曲线得出待测值。9.统计分析实验结果以均数士标准误表示。应用SPSS13.0软件进行分析,两两比较采用t检验,多组之间采用单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.动物基本特点20只实验动物,其中1只死于手术前麻醉,其他各只动物全部完成实验。2.显微超声测量结果左侧颈总动脉IMT明显大于右侧颈总动脉IMT(P<0.05),左侧颈总动脉近心端有明显斑块形成,而右侧颈总动脉未检测明显斑块,仅有内膜毛糙现象。根据Ds与Vmax计算得出,左侧剪切力比右侧剪切力低30%(P<0.05)。3.病理学检测结果左侧颈动脉近心端形成明显的斑块,管腔明显狭窄,而右侧仅有动脉增厚,未见明显斑块。免疫组织化学显示MT1-MMP在左侧颈总动脉表达明显升高。4.人脐静脉内皮细胞鉴定应用兔抗人CD31、CD34和Ⅷ抗体,根据免疫荧光检测结果,显示体外培养内皮细胞纯度可达95%以上。5.不同作用时间下,低剪切力对脐静脉内皮细胞表达MT1-MMP mRNA及蛋白质的影响将HUVECs暴露于低剪切力1小时,MT1-MMP mRNA的水平与静态时比有明显升高(P<0.01),但当分别作用3、5小时,MT1-MMP mRNA表达增高更加明显。Western Blot和ELISA结果显示,低剪切力作用于HUVECs 1小时,蛋白质量及活性无明显变化(P>0.05),3和5小时后,蛋白表达量及活性水平比静态时明显升高(P<0.01)。6.相同作用时间下,不同剪切力对脐静脉内皮细胞表达MT1-MMP mRNA及蛋白质的影响实时定量RT-PCR显示,生理剪切力作用1h后,MT1-MMP mRNA水平比静态对照组无明显变化,但比低剪切力组表达降低(P<0.01),然而生理性剪切力作用3h和5h后,其水平比静态对照组明显降低(P<0.01)。生理剪切力作用1h后,Western Blot和ELISA发现MT1-MMP mRNA蛋白质表达及活性,与静态对照组相比,蛋白质表达量和活性未见明显下降(P>0.05);与低剪切力组相比,蛋白质表达量和活性明显下降(P<0.01)。生理剪切力作用3h和5h后,与静态对照组和低剪切力组相比,蛋白质表达的量和蛋白质活性具有明显的降低(P<0.01)。结论:1.在ApoE~(-/-)小鼠低剪切力模型中,低剪切力可以上调MT1-MMP的表达。2.在体外研究中,低剪切力上调MT1-MMP的表达,提示低剪切力诱导的MT1-MMP表达上调在动脉粥样硬化斑块发生和/或发展过程中具有重要的作用。背景Pober和Cotran在总结大量研究血流剪切力和动脉粥样硬化之间的关系的研究成果的基础上,提出了动脉粥样硬化发病学的剪切力学说(shear stresshypothesis),认为血流剪切力异常是促使动脉粥样硬化病变形成的重要原因。血管内皮细胞(Endothelial cell,EC)衬于血管的内壁,直接承受着血液流动产生的剪切力。血流动力学因素异常出现层流剪切力不均匀,内皮细胞分泌抗动脉粥样硬化分子减少,这时高胆固醇血症、高半胱氨酸血症等危险因素的持续作用即可促使动脉粥样硬化病变发生。许多调节因素影响胶原的合成与降解,任一因素的失调均可引起胶原代谢的平衡紊乱。许多研究发现MMPs升高与纤维帽变薄、急性冠脉综合症的发生密切相关。“纤维帽薄,胶原含量少”是典型的易损斑块生物组织学特征之一,这一特点已经得到公认。基质金属蛋白酶(MMPs)在胶原代谢过程中起关键的作用,很多研究显示:MMPs如MMP-2,MT1-PMMP,MMP-13等的表达上调促进细胞外基质包括胶原的降解,导致斑块纤维帽变薄,从而形成易损斑块。近年来锚定于细胞膜的基质金属蛋白酶(MTs-MMP)对易损斑块的作用受到了广泛的关注,其导致易损斑块的机制得到了一定的阐释。膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP,MMP-14)是唯一锚定于细胞膜上的胶原蛋白酶,其底物广泛,包括:胶原蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、弹性蛋白和纤溶酶原等。MT1-MMP促进单核细胞的迁移,进入内膜下吞噬脂质成为泡沫细胞,启动动脉粥样硬化斑块的形成;MT1-MMP溶解细胞周围胶原,促进内皮细胞的迁移,从而促进动脉粥样硬化的发展;MT1-MMP激活MMP-2、9前蛋白成为活性形式,MT1-MMP和被激活的MMP-2、9降解细胞外基质如:胶原等,使得斑块纤维帽变薄,促进易损斑块的发生和发展。由此可见MT1-MMP在易损斑块的发生发展中可能是中心环节。整合素是一组跨膜糖蛋白,是连接细胞外基质与细胞内骨架蛋白的桥梁,能在细胞膜上进行双向的信息传递:来自细胞内的信号可调控整合素与细胞外配体的结合活性,同时,细胞外的信号可通过整合素传递至细胞内,引发细胞的生物学功能的改变。研究证明,整合素是一种机械感受器,依赖整合素的信号传导途径参与了血管内皮细胞对剪切力的反应。整合素可激活胞质内多种蛋白质激酶,如MAPKs、黏附斑激酶(FAK)等,引发细胞内的信号传递过程。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是介导细胞反应的重要信号系统,在炎症的发生、发展和细胞因子的生成中起重要的作用。目前哺乳动物细胞中已发现4种MAPK信号分子,即ERK1/2、JNK、p38和ERK5亚家族。我们前期研究表明,MAPK参与了力学信号在细胞内的信号转导过程,介导了MMP-9的高表达,但其与低剪切力诱导的MT1-MMP表达的关系尚不清楚。目前在血管内皮细胞上已发现至少有四种转录因子可被剪切力激活,其中包括核转录因子κB(NF-κB)。研究证明:剪切力促使其亚单位p65向核内转移,调节目的基因表达。上述情况说明,低剪切力能分别激活整合素、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核转录因子κB(NF-κB),我们第一部分的实验已经表明低剪切力可以诱导内皮细胞高表达MT1-MMP。然而,低剪切力诱导内皮细胞分泌表达MT1-MMP过程中与整合素、MAPKs及NF-κB之间的信号转导关系尚未见报道。研究目的:1.观察低剪切力是否通过上调NF-κB与DNA结合的能力诱导内皮细胞MT1-MMP高表达;2.观察低剪切力是否通过活化ERK1/2或者Akt来上调NF-κB与DNA的结合能力来诱导MT1-MMP高表达;3.观察FAK是否参与低剪切力诱导内皮细胞表达MT1-MMP信号转导过程;4.观察整合素β1在低剪切力诱导内皮细胞表达MT1-MMP的作用。研究方法:1.人脐静脉内皮细胞的原代培养与鉴定采用无菌获取脐带分离脐静脉内皮细胞原代培养的办法获取内皮细胞,具体分离、传代和鉴定方法见第一部分。2.玻片上内皮细胞的种植将经胰蛋白酶消化后的悬浮内皮细胞种植于用明胶处理过的载玻片上,利用流体表面张力将其限制在玻片范围。小心移至CO_2孵箱,待细胞贴壁后,在置载玻片的培养皿内加入全M199培养液,隔日换液,用于后续实验.3.流室系统由四川大学华西医学中心生物医学工程实验室设计并提供数据,成都西木子公司承接制造。流室测试区满足:(1)层流;(2)二维流动;(3)充分发展的流动。4.细胞剪切力干预分组4.1 NF-κ3调节低剪切力(4dyne/cm~2)介导的HUVECs对MT1-MMP mRNA的表达及其蛋白质活性1)静态组:不给予任何力,也不给予任何抑制剂。2)低剪切力对照组:分别给予HUVECs低剪切力(4dyne/cm~2)30分钟、1、3小时,观察在不加NF-κB抑制剂SN50的条件下,低剪切力对p65的DNA结合活性及MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。3)SN50组:先予以HUVECs18μM SN50,于孵箱中培养2小时,再给予低剪切力(4dyne/cm~2)5小时,观察NF-κB对低剪切力介导的MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。4.2 ERK1/2(Akt)对低剪切力(4 dyne/cm~2)介导的NF-κB/MT1-MMP信号转导通路的影响1)静态组:不给予任何力,也不给予任何抑制剂。2)低剪切力对照组:分别给予HUVECs低剪切力(4dyne/cm~2)作用5、10分钟、1、5小时,观察在无ERK1/2抑制剂的条件下,低剪切力对ERK1/2磷酸化水平、p65的DNA结合活性及MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。分别给予HUVECs低剪切力(4dyne/cm~2)作用5、10分钟,同时观察低剪切力对Akt磷酸化水平。3)PD98059组:先给予HUVECs 20μM ERK1/2抑制剂PD98059于孵箱中培养2小时,再给予低剪切力(4dyne/cm~2)作用5分钟、1、5小时,观察PD98059对ERK1/2磷酸化的抑制效果及ERK1/2对低剪切力介导p65 DNA结合活性及MT1-MMPmRNA表达及其蛋白质活性的影响。4)LY294002组:先给予HUVECs 50μM Akt抑制剂LY294002于孵箱中培养2小时,再给予低剪切力(4dyne/cm~2)作用5分钟、1、5小时,观察LY294002对低剪切力介导及MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。4.3黏附斑激酶(FAK)对低剪切力介导的ERK1/2/NF-κB/MT1-MMP信号转导通路的影响1)静态组:不给剪切力,也不给任何抑制剂。2)低剪切力对照组:给予低剪切力(4dyne/cm~2)作用3、5、10分钟、1、5小时,在无FAK siRNA的条件下,观察低剪切力对FAK磷酸化水平、p65的DNA结合活性及MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。3)FAK siRNA组:先将HUVECs和200pmol FAK siRNA共培养6小时,换液培养48小时后,再给予低剪切力(4dyne/cm~2)作用5分钟、1、5小时,观察低剪切力对ERK1/2磷酸化水平、p65的DNA结合活性及MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。4.4整合素β1对低剪切力介导的FAK/ERK1/2/NF-κB/MT1-MMP信号转导通路的影响1)静态组:不给剪切力,也不给任何抑制剂。2)低剪切力对照组:给予低剪切力(4dyne/cm~2)作用3、5、10分钟、1、5小时,在无整合素β1 siRNA的条件下,观察低剪切力对整合素β1活化水平、FAK磷酸化水平、p65的DNA结合活性及MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。3)整合素β1 siRNA组:先将HUVECs和150pmol整合素β1 siRNA共培养6小时,换液培养48小时后,再给予低剪切力(4dyne/cm~2)作用5分钟、1、5小时,观察低剪切力对FAK、ERK1/2磷酸化水平、p65的DNA结合活性及MT1-MMPmRNA表达及其蛋白质活性的影响。5.实验方法采用实时定量RT-PCR方法检测MT1-MMP mRNA的表达量;以ELISA法检测细胞MT1-MMP的蛋白质活性;用westernblot方法检测蛋白表达和磷酸化水平;EMSA检测NF-κB p65与DNA的结合活性。6.统计学分析实验结果以均数士标准误表示。应用SPSS13.0软件,采用单因素方差分析对实验结果进行分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.NF-κB调节低剪切力(4dyne/cm~2)介导的HUVECs对MT1-MMP mRNA的表达及其蛋白质活性给予HUVECs细胞低剪切力(4dyne/cm~2)作用30分钟、1小时和3小时,收集细胞,提取核蛋白,EMSA检测NF-κB p65与DNA的结合活性,结果显示,低剪切力作用后,与静态组比较,p65与DNA的结合活性明显增强(P<0.01);用抑制NF-κB核转移的细胞渗透肽SN50预培养HUVECs2小时后,给予低剪切力1小时,发现SN50明显抑制了p65与DNA的结合活性(P<0.05);用SN50预处理细胞2小时,置于流室系统给与低剪切力作用5小时,发现该肽能明显抑制MT1-MMPmRNA和蛋白质的表达同时降低其活性(P<0.01)。2.ERK1/2对低剪切力(4 dyne/cm~2)介导的NF-κB/MT1-MMP信号转导通路的影响将HUVECs分别置于流室系统给与低剪切力(4dyne/cm~2)作用0、5、10分钟,用Western Blot方法检测ERK1/2的蛋白磷酸化水平,结果显示:ERK1/2的磷酸化在5分钟达到高峰,根据该结果,将HUVECs与ERK1/2的抑制剂PD98059 20μM共培养2小时,再分别给予低剪切力5小时,结果显示,MT1-MMP的mRNA表达及其蛋白质活性水平被明显抑制。将HUVECs用PD98059预处理2小时,再分别给予低剪切力1小时,结果显示,NF-κB的DNA结合活性却明显被抑制。将HUVECs分别置于流室系统给与低剪切力(4dyne/cm~2)作用0、10、20分钟,用Western Blot方法检测Akt的蛋白磷酸化水平,结果显示:Akt在低剪切力刺激下其活化程度没有变化;将HUVECs与Akt的抑制剂LY294002 50μM共培养2小时,再分别给予低剪切力5小时,结果显示,MT1-MMP的mRNA表达及其蛋白质活性水平未出现明显变化。3.FAK对低剪切力介导的ERK1/2NF-κB/MT1-MMP信号转导通路的影响将HUVECs分别置于流室系统给与低剪切力(4dyne/cm~2)作用0、3、5、10分钟,用Western Blot方法检测FAK的蛋白磷酸化水平,结果显示:FAK的磷酸化在5分钟达到高峰。以FAK siRNA与HUVECs共培养6小时,换液继续培养48小时后,给予低剪切力5小时,实时定量RT-PCR、western blot和ELISA法结果显示,MT1-MMP的mRNA表达和其蛋白质活性水平明显下降(P<0.01)。FAK基因沉默后,再将其置于流室系统给与低剪切力(4dyne/cm~2)作用5分钟,提取总蛋白,Western Blot检测发现,5分钟后,ERK1/2的磷酸化水平明显下降。转录因子实验显示,p65的DNA结合活性被明显抑制。4.膜整合素对低剪切力介导的ERK1/2/NF-κB/MT1-MMP信号转导通路的影响将HUVECs给与低剪切力(4dyne/cm~2)作用0、3、5、10分钟,用Western Blot方法检测整合素β1的蛋白活化水平,结果显示:整合素β1蛋白在3分钟活化达到高峰。以整合素β1 siRNA与HUVECs共培养2小时6小时,换液继续培养48小时后,给予低剪切力5小时,实时定量RT-PCR和ELISA结果显示,MT1-MMP的mRNA表达和其蛋白质活性水平明显下降(P<0.01)。整合素β1基因沉默后,再将其置于流室系统给与低剪切力(4dyne/cm~2)作用5分钟和1小时,提取总蛋白,Western Blot检测发现,低剪切力作用5分钟后,FAK和ERK1/2的磷酸化水平明显下降。提取核蛋白,转录因子实验显示,p65的DNA结合活性被明显抑制。结论:1.低剪切力通过增强NF-κB与DNA结合的活性介导内皮细胞MT1-MMP的高表达。2.低剪切力可以通过ERK1/2活化介导的内皮细胞MT1-MMP的高表达。3.低剪切力作用下,FAK参与了内皮细胞表达MT1-MMP的信号转导过程。4.低剪切力作用下,整合素β1通过FAK-ERK1/2-NF-κB途径参与了内皮细胞MT1-MMP表达的调节。总之,低剪切力通过整合素β1-FAK-ERK1/2-NF-κB信号途径上调内皮细胞MT1-MMP的表达,并增强其活性。背景动脉粥样硬化斑块破裂是促发急性冠脉综合征的主要原因。机械应力及细胞外基质重构在斑块破裂中起主要作用。易于破裂的粥样斑块,其纤维帽中单核细胞密度增加而平滑肌细胞密度减少,而且胶原成分也减少。动脉粥样硬化斑块结构完整性的维持依赖于细胞外基质成分,包括胶原纤维、弹力纤维等。研究认为,斑块肩部基质金属蛋白酶的表达明显增加,因其降解细胞外基质,使纤维帽变薄脆性增加,导致斑块破裂。膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP,MMP-14)是唯一的锚定于细胞膜上的胶原蛋白酶。已经有研究证实MT1-MMP在动脉粥样硬化斑块的发生和发展过程中有着重要的作用,近来通过动物靶向性性基因敲除发现MT1-MMP在易损斑块的发生发展中可能是中心环节。MT1-MMP在动脉粥样硬化斑块的发生和发展中起着重要的作用。作为一个有潜力的治疗靶点,寻找治疗方法就成了亟待解决的问题。他汀类药物,即3.羟基-3-甲基戊二酸单辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,是临床上广泛使用的调脂药物。近年来,其非调脂作用日益成为研究热点。有研究证实他汀类药物可以抑制MMP-2,9的表达,那么他汀类是否抑制低剪切力介导内皮细胞表达MT1-MMP就成了本研究的主要问题。研究目的:1.明确辛伐他汀是否干预低剪切力介导的内皮细胞表达MT1-MMP;2.探讨辛伐他汀干预低剪切力介导内皮细胞表达MT1-MMP的可能机制。研究方法:1.人脐静脉内皮细胞的原代培养与鉴定根据Jaffe等的方法培养人脐静脉内皮细胞,作方法详见第一部分。2.玻片上内皮细胞的种植将经胰蛋白酶消化后的悬浮内皮细胞种植于用胶原蛋白Ⅰ处理过的载玻片上,利用流体表面张力将其限制在玻片范围。小心移至CO_2孵箱,待细胞贴壁后,在置载玻片的培养皿内加入全M199培养液,隔日换液,用于后续实验.3.流室系统由四川大学华西医学中心生物医学工程实验室设计并提供数据,成都西木子公司承接制造。流室测试区满足:(1)层流;(2)二维流动;(3)充分发展的流动。具体结构请参看第一部分。4.细胞剪切力干预分组4.1不同浓度的辛伐他汀对于低剪切力(4 dyne/cm~2)介导脐静脉内皮细胞MT1-MMP mRNA表达的影响1)静态对照组:不给予剪切力,细胞在静态下培养。2)低剪切力对照组:给予低剪切力(4 dyne/cm~2)作用5小时,以观察MT1-MMP mRNA的变化。3)不同浓度的辛伐他汀组:分别应用1、3、5、10、20μM辛伐他汀处理2小时,给予低剪切力作用5小时,以观察MT1-MMP mRNA的变化。4.2辛伐他汀对低剪切力(4 dyne/cm~2)介导脐静脉内皮细胞MT1-MMP蛋白质表达及其活性的影响1)静态对照组:细胞不给予任何剪切力。2)低剪切力对照组:给予低剪切力(4 dyne/cm~2)作用5小时,观察低剪切力对MT1-MMP蛋白质表达及其活性的影响。3)辛伐他汀组:将辛伐他汀加入HUVECs培养基中,共培养2小时后,给予低剪切力(4 dyne/cm~2)作用5小时,观察低剪切力对MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的影响。4.3辛伐他汀对低剪切力(4 dyne/cm~2)介导脐静脉内皮细胞MT1-MMPmRNA稳定性的影响1)静态组:不给予任何力,也不给予任何抑制剂。2)低剪切力对照组:分别给予HUVECs低剪切力(4 dyne/cm~2)5小时后,在培养基中加入Act D,最终浓度为20μg/ml。然后在不同的时间点(0,1,2,3,5 h)收集细胞,提取总RNA,应用实时定量RT-PCR技术检测MT1-MMP mRNA水平。3)辛伐他汀组:将辛伐他汀加入HUVECs培养基中,共培养2小时后,给予低剪切力(4 dyne/cm~2)作用5小时,在培养基中加入Act D,最终浓度为20μg/ml。然后在不同的时间点(0,1,2,3,5 h)收集细胞,提取总RNA,应用实时定量RT-PCR技术检测MT1-MMP mRNA水平。4.4辛伐他汀对参与低剪切力(4 dyne/cm~2)介导HUVECs表达MT1-MMP信号转导途径分子的影响1)静态组:不给予任何力,也不给予任何抑制剂。2)低剪切力对照组:分别给予HUVECs低剪切力(4 dyne/cm~2)3、5分钟、1小时,观察在无辛伐他汀的条件下,低剪切力对整合素β1活化、FAK和ERK1/2磷酸化水平以及p65的DNA结合活性的影响。3)辛伐他汀组:将辛伐他汀加入HUVECs培养基中,共培养2小时后,分别给予HUVECs低剪切力(4 dyne/cm~2)3、5分钟、1小时,观察在存在辛伐他汀的条件下,低剪切力对整合素β1活化、FAK和ERK1/2磷酸化水平以及p65的DNA结合活性的影响。5.实验方法采用探针实时定量RT-PCR方法检测HUVECs MT1-MMP mRNA的表达量;以ELISA法检测细胞培养上清液中MT1-MMP的蛋白质活性;用western blot方法检测蛋白磷酸化水平;EMSA检测NF-κB p65与DNA的结合活性。6.统计学分析实验结果以均数士标准误表示。应用SPSS13.0软件,采用单因素方差分析对实验结果进行分析,p<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.辛伐他汀抑制低剪切力(4 dyne/cm~2)诱导的脐静脉内皮细胞MT1-MMPmRNA的表达1μmol/L的辛伐他汀即可以使得由低剪切力诱导内皮细胞MT1-MMP的表达受到抑制(P<0.05),3μmol/L和5μmol/L的辛伐他汀都可以取得相似的效果。10μmol/L的辛伐他汀可以明显抑制内皮细胞MT1-MMP的表达(P<0.01),而且与静力下内皮细胞表达MT1-MMP没有区别(P>0.05),20μmol/L的辛伐他汀可以有更好的抑制效果,但是和10μmol/L的辛伐他汀没有明显的区别(P>0.05)。2.辛伐他汀抑制低剪切力(4 dyne/cm~2)诱导的脐静脉内皮细胞MT1-MMP的蛋白质表达,同时抑制其活性应用10μmol/L的辛伐他汀与HUVECs共培养2小时后,将HUVECs暴露与低剪切力(4 dyne/cm~2)作用5小时,应用western blot检测MT1-MMP蛋白质的表达。辛伐他汀可以抑制由内皮细胞MT1-MMP的表达(P<0.01)。应用ELISA法检测,发现辛伐他汀可以降低内皮细胞表达MT1-MMP的活性(P<0.01)。3.辛伐他汀逆转低剪切力(4 dyne/cm~2)对脐静脉内皮细胞MT1-MMP mRNA稳定性的作用应用Act D检验低剪切力(4 dyne/cm~2)诱导内皮细胞MT1-MMP mRNA的稳定性,结果显示低剪切力可以诱导MT1-MMP mRNA稳定性增强(P<0.01)。应用10μmol/L的辛伐他汀预处理HUVECs后,将HUVECs暴露与低剪切力(4dyne/cm~2)5小时,分析发现由低剪切力导致的MT1-MMP mRNA稳定性下降(P<0.01)。4.辛伐他汀抑制参与低剪切力(4 dyne/cm~2)介导HUVECs表达MT1-MMP信号转导分子活化辛伐他汀可以抑制整合素β1活化,同时通过降低FAK、ERK1/2磷酸化水平而抑制其活性(P<0.01),EMSA结果显示,辛伐他汀可以抑制NF-B与DNA结合的能力(P<0.01)。结论:1.辛伐他汀可以抑制由低剪切力诱导的内皮细胞MT1-MMP表达的上调,同时抑制MT1-MMP蛋白质活性。2.低剪切力可以使MT1-MMP mRNA稳定性增强,辛伐他汀可以逆转这一过程。3.辛伐他汀抑制内皮细胞表达MT1-MMP机制之一是抑制了整合素β1-FAK-ERK1/2-NF-κB信号转导途径。
成敏[8]2005年在《低剪切力上调内皮细胞IL-8 mRNA信号转导途径的实验研究》文中提出研究背景 血液流动对血管产生力的作用,这对于心血管系统稳态的维持有着重要的意义,这些力分为沿血流方向与血管平行的剪切力,垂直于血管壁的压应力和沿血管壁周向的拉应力。此外,它们也在心血管疾病,如动脉粥样硬化等的发生、发展过程中扮演着重要的角色。剪切力,作为血流动力的水平分量,不仅会影响内皮细胞的形态、迁移、分化和增殖,而且还通过调节内皮细胞不同基因的表达,在心血管系统的病理和生理过程中起重要作用。在内皮细胞,已发现多种受剪切力调节的基因,根据它们的生物学特性,大致可以分为血管活性物质、生长因子、粘附分子、趋化因子、凝血因子和原癌基因等。我们前期工作表明层流状态的低剪切力(4.20 dyne/cm~2)可诱导培养的人脐静脉内皮细胞IL-8 mRNA的表达。显然,从最初的剪切力这种物理刺激到最终的IL-8基因的表达之间必然存在着复杂而精细的信号转导过程。 鉴于力学信号的转导过程包括力学耦联(mechanocoupling),作用在细胞上的外界应力使胞外基质产生形变,成为能被细胞所感知的局部信号;生化耦联(biochemical coupling),细胞将局部信号转化为细胞内的生物化学信号并最终影响基因的表达或蛋白的活化等过程。我们拟从以下几个方面探讨低剪切力上调内皮细胞IL-8 mRNA的信号转导途径:1)研究整合素在低剪切力上调内皮细胞IL-8基因表达中的作用:2)研究细胞骨架在低剪切力上调内皮细胞IL-8基因表达中的作用;3)研究低剪切力上调内皮细胞IL-8基因表达过程中胞内信号转
曹雪飞, 董国, 杨树森[9]2016年在《剪切力对血管内皮功能影响及机制研究进展》文中提出动脉粥样硬化好发于动脉分叉外侧壁和弯曲内侧壁,与流体力学密切相关,其中剪切力对动脉粥样硬化斑块的定位起决定性作用。血管内皮是血流和血管壁之间的重要介质,在剪切力作用下将机械刺激转化成细胞内信号,以影响细胞功能和基因表达。本文就剪切力作用下内皮细胞功能改变及分子生物学机制的研究进展作一综述。
柴守栋, 顾承雄[10]2016年在《血流剪切力对静脉桥血管再狭窄影响的研究进展》文中进行了进一步梳理大隐静脉因其易得、长度足够且较为匹配等特点是冠状动脉搭桥术中广泛使用的血管材料,然而静脉桥具有较高的再狭窄率,术后10年约50%的静脉桥血管发生狭窄或闭塞。造成静脉桥血管再狭窄的因素较多,如获取静脉血管时的操作损伤、缺血再灌注,早期血管内血栓形成,内膜细胞的增殖、血小板及白细胞的黏附及平滑肌细胞的增生等。静脉桥
参考文献：
[1]. 剪切力对血管内皮细胞表达细胞因子及血管活性因子的影响[D]. 张晓娟. 中国人民解放军军医进修学院. 2004
[2]. 剪切力对动静脉内瘘血管内皮细胞的影响[D]. 于海波. 天津医科大学. 2016
[3]. 剪切力介导血管内皮细胞表达基质金属蛋白酶9及其信号转导通路的研究[D]. 孙惠文. 山东大学. 2007
[4]. JNK1/2在剪切力介导下ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成机制的实验研究[D]. 王娟. 山东大学. 2012
[5]. EPCs在低剪切应力下归巢机制及作为靶向AS的治疗载体研究[D]. 李立. 第叁军医大学. 2016
[6]. 瑞舒伐他汀减轻野百合碱诱发的大鼠肺动脉高压[D]. 张力. 郑州大学. 2016
[7]. 低剪切力介导内皮细胞表达膜型基质金属蛋白酶1的机制及辛伐他汀干预的研究[D]. 陈良. 山东大学. 2009
[8]. 低剪切力上调内皮细胞IL-8 mRNA信号转导途径的实验研究[D]. 成敏. 四川大学. 2005
[9]. 剪切力对血管内皮功能影响及机制研究进展[J]. 曹雪飞, 董国, 杨树森. 中华实用诊断与治疗杂志. 2016
[10]. 血流剪切力对静脉桥血管再狭窄影响的研究进展[J]. 柴守栋, 顾承雄. 心肺血管病杂志. 2016