【摘要】 目的 应用生物信息学技术对人类巨细胞病毒(HumanCytomegalovirus,HCMV)分子进行抗原表位预测,构建并表达具有多表位的重组融合蛋白并进行免疫原性鉴定.方法 GenBank中查询HCMV 氨基酸序列,利用BepiPred、ABCpred、BcePred、PREDICTED四种在线表位预测软件进行细胞表位预测,筛选出可能的抗原决定簇表位,构建、原核表达,并利用免疫印迹实验筛选出可用的表位抗原,原核表达出融合蛋白,用WesternBlot和ELISA 检测其抗原性.结果 综合预测分析结果,得出１３种可能的表位,构建出pET３２a原核表达载体,表达并纯化这１３种表位的融合蛋白,经免疫印迹技术筛选出gp５２、GB３、PP１５０－１、GB－５具有较强的抗原性表位,通过Ni２＋ 亲和柱纯化,对gp５２融合蛋白免疫印迹试验结果表明,蛋白抗原性较强;ELISA 法鉴定具有较高的抗原性及特异性.结论 在原核表达系统中能获得高效表达,纯化的融合蛋白具有较强的免疫反应性,对后期建立人HCMV 免疫检测试剂提供了可能性. 【关键词】 预测软件;抗原表位;原核表达;纯化;鉴定【中图分类号】R３９２．１【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０１４０－０１
血清免疫诊断[１－２]仍是现价段巨细胞病毒诊断的主要手段,但病毒来源的抗原存在敏感性、特异性等问题,基因工程方法获得的表达产物作为抗原已引起各国学者的重视.本文应用生物信息学技术对人类巨细胞病毒(HumanCytomegalovirus,HCMV)分子进行抗原表位预测,现报告如下: 材料和方法
１ 材料
１．１ 试剂和仪器 本实验采用的质粒抽提试剂盒采购至Omega公司;异丙基－β－半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(AMP)、酵母提取液、胰蛋白胨购自Sigma 公司;低分子量蛋白标准品采购自赛默飞世尔公司;HiTrapDesalting脱盐柱、HisTrapHPNi２＋ 亲和柱采购自GEHealthcare公司;恒温培养摇床采购自上海福玛公司;凝胶扫描仪、蛋白电泳仪为美国伯乐公司产品. １．２ HCMV 氨基酸序列 根据GenBank中公布的HCMV 全长的氨基酸序列作为表位预测依据.
１．３ 计算机预测软件 采用Predicted、ABCpred、BcePred、BepiPred在线预测软件以及美国DNAstar公司Lasergene７．１０软件. １．４ 质粒、菌株与抗体质粒pET３２a(G１－G８、pp６５－１、pp６５－２、gp５２、pp１５０－１、pp１５０－２)由上海捷瑞公司合成;大肠杆菌BL２１及Rosetta(DE３)为本实验室保存;羊抗兔抗体购自Sigma公司.抗HCMV 阳性血清来自本实验室确诊HCMV 病人血清.
２ 方法２．１ 表位预测 将查询的HCMV 氨基酸序列输入到预测软件中,利用一级序列中的氨基酸柔性、局部亲水性、突出指数以及二级结构的转角与环结构等进行B 细胞表位预测,综合五种软件的预测结果进行分析. ２．２ 融合蛋白诱导表达 重组质粒转化至Rosseta菌中,取１００μL转化液均匀涂抹至氨苄培养基中.取生长良好的挑单克隆于氨苄青霉素终浓度为０．１mg/mL的LB培养液中,１:１００转接至１０mL氨苄青霉素终浓度为０．１mg/mL的LB培养液中,检测菌液OD６００值至０．４－０．６,加入终浓度为０．１mmol/L异丙基－β－半乳糖苷(IPTG).至聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)观察融合蛋白表达情况.
２．３ 融合蛋白纯化 可溶性融合蛋白纯化小量诱导成功后.按照HiTrapHP 操作说明,安装好纯化系统. ２．４ 脱盐 按照HiTrapDesalting操作说明安装好脱盐系统,SDS－PAGE跑胶后用BCA 法测蛋白量,－８０℃保存备用. ２．５ 免疫反应原性检测用Bio－Rad凝胶成像采集图像,观察结果.用０．１mol/LpH８．６的碳酸氢盐缓冲液稀释包被纯化抗原,按ELISA 法步骤操作检测免疫原性. ３ 结果３．１ HCMV 全长序列细胞表位预测结果 综合分析四种在线式表位预测软件和Lasergene预测结果,研究指出,抗原蛋白的空间构象表位多以二级结构的转角、环的形式存在,综合考虑利用Lasergene预测的蛋白质二级结构,最终确定１３个预测表位,标记为G１－G８、pp６５－１、pp６５－２、gp５２、pp１５０－１、pp１５０－２(表１).
３．２ 预测表位设计及鉴定 将G１－G８、pp６５－１、pp６５－２、gp５２、pp１５０－１、pp１５０－２预测表位的基因分别插入pET３２a克隆载体质粒,克隆位点NcoI/XhoI,克隆载体抗性为氨苄青霉素(AMP).测序结果表明１３个表位均成功插入pET３２a多克隆位点.
３．３ pET３２a/G１－pET３２a/PP１５０－２重组质粒的原核表达 含重组质粒的Rosetta(DE３)菌均成功表达出符合预计大小的融合蛋白GB－３、GB－５、gp５２、pp１５０－１、(图１).对菌液超声后将上清和沉淀进行SDS－PAGE检测,结果为上清表达. ３．４ 重组蛋白纯化、脱盐 经Ni２＋ 亲和柱纯化,获得了纯度较高的蛋白条带.
３．５ 重组蛋白免疫原性鉴定 经免疫印迹试验检测,诱导纯化出的４种重组蛋白中gp５２融合蛋白与抗人HCMV 抗体识别(图２);用gp５２融合蛋白做包被抗原,ELISA 法测定２０例HCMV 阳性血清,结果均为阳性.阴性血清均未见反应.
４ 讨论
人巨细胞病毒(Humancytomegalovirus,HCMV)是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒.HCMV 基因编码很多蛋白质,在活动性感染时,这些蛋白暴露在宿主免疫系统中,由于免疫原性及宿主反应的强度和特异性不同,在不同患者血清中会出现针对不同抗原表位的抗体.我们利用基因工程技术筛选出６ 种HCMV 抗原表位,成功构建在pET３２a原核表达载体,表达并纯化这６种表位的融合蛋白,经免疫印迹技术筛选出gp５２、GB３、PP１５０－１、GB－５具有较强的抗原性表位,通过Ni２＋ 亲和柱纯化,得到纯度较高的蛋白条带.对gp５２纯化蛋白用WesternBlot和ELISA 法分析证实具有良好的抗原性和特异性,对后期建立人HCMV 免疫检测试剂提供了可能.磁珠(magneticbeads)或磁性纳米颗粒(magneticnanoparticles,MNPs)因具有分离速度快、效率高、可重复使用、操作简单、易实现功能化、易实现自动化以及不影响分离物质的活性等特殊的物理化学性质和生物相容性,目前已应用于细胞的分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定以及DNA 的检测等,我们会在后续研究中与磁珠免疫结合, 继续寻求HCMV 病毒感染的早期快速高效诊断方法. M 低分子量蛋白Marker;１ 空菌诱导;２pET３２a;３pET３２a－G３诱导表达;４pET３２a－G５诱导表达;５pET３２a－gp５２诱导表达;６pET３２a－pp１５０－１ 诱导表达参考文献[１] 郭雅飞,王志飞,李智洋等．磁性纳米复合颗粒(Fe３O４/PVA)/SiO２的制备与修饰．应用化学,２００８,２５(９):１０２２－１０２６． [２] 李智洋,何磊,何农跃,史智扬,李松,刘洪娜,戴亚斌．一种实用的基于化学发光和磁性纳米颗粒的E．coliO１５７:H７ 免疫鉴定方法．化学学报,２０１０,６８(３):２５１－２５６
论文作者:王良梅 李智洋 许红攀 夏艳艳 庞露 司
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/2
标签：蛋白论文; 抗原论文; 免疫论文; 质粒论文; 抗原性论文; 诱导论文; 血清论文; 《中国综合临床》2015年12月供稿论文;