张家兴1,2，赖柳生2，王磊2，眭维国1,2[]
1.南方医科大学（510000，广州）2.解放军第181中心医院肾脏科（541002，广西桂林）
基金项目：广西自然科学基金（2014GXNSFAA118179）
摘要: 目的 探讨系统性红斑狼疮（SLE）患者的T淋巴细胞免疫图谱多样性，为SLE早期诊断和精确评估预后及治疗效果提供新的依据。方法 通过设计各V区家族和J区家族引物，扩增出TCR的所有CDR3区。结合高通量测序平台，分析SLE组和NC组外周血淋巴细胞中T细胞TCRβ链的各基因家族的表达频率、V-J配对和碱基插入、缺失情况以及CDR3区多样性、长度分布特征等；筛选SLE组和NC组中高度克隆性扩增（频率大于0.5%）的DNA序列，氨基酸序列(AA)和V-J组合；从海量数据中筛选SLE组和NC组的共有DNA序列，氨基酸序列和V-J组合，从而揭示SLE组和NC组外周血T淋巴细胞的免疫图谱特性。结果 我们发现SLE患者组和NC组的CDR3，VD indel和DJ indel的长度分布频率相似。SLE患者组的TCRβ链CDR3的克隆性扩增程度高于NC组，图谱多样性明显低于NC组。此外，SLE患者组中10个TRβV 和 6个TRβJ基因亚家族的表达水平，及73 个V-J组合的使用频率明显异于NC组（p＜0.05）。在共有序列方面，3条DNA序列和4条氨基酸序列被所有SLE患者共享，这些序列可用于开发SLE疾病诊断，预后和病情监控的生物标志物。结论 SLE患者组的T细胞克隆性扩增程度增加，图谱多样性降低，且TCR Vβ和Jβ亚家族呈现优势利用的现象。
关键词：统性红斑狼疮; T细胞受体; 高通量测序
中图分类号: R392.3 文献标志码: A
Diversity analysis of T cell receptor in systemic lupus erythematosus
Abstract: Objective To study the diversity of T lymphocyte immune repertoire in systemic lupus erythematosus (SLE) patients, to provide a new basis for early diagnosis of SLE and the accurate assessment of prognosis and therapeutic effect. Methods Designing primers for the region of V family and J family, to amplify the whole CDR3 area of T cell receptor (TCR). Combined with high throughput sequencing platform, to analyze the expression frequency of each gene family, V-J pairing, base insertion/deletion, the region of CDR3 diversity and length distribution characteristics of T cell TCR beta chain in peripheral blood T lymphocytes of SLE and NC group. To screen the highly clonal amplification (frequency greater than 0.5%) DNA sequence, amino acid sequence (AA) and V-J combination in SLE group and NC group, to screen the common DNA sequence, amino acid sequence and V-J pairing from the mass of data, in order to reveal the immunological characteristics of T lymphocytes in SLE group and NC group. Results We found the distributions of CDR3, VD indel, and DJ indel lengths to be comparable between the SLE and NC groups. The degree of clonal expansion in the SLE group was significantly greater than in the NC group, and the immune diversity of SLE patients was significantly lower than that in normal control group. Moreover, the usage frequency of 10 TRβV segments, 6 TRβJ segments, and 73 V-J combinations were also significantly different in the SLE group. Regarding public T cell responses, 3 CDR3 DNA sequences and 4 aa sequences were shared by all SLE patients and may serve as biomarkers for SLE disease diagnosis, prognosis and condition monitoring. Conclusion The degree of T cell clonal expansions in the SLE group was higher, and the immune diversity of SLE patients was significantly lower. In addition, TCR V beta and J beta subfamily showed the phenomenon of advantage usage.
Key words: Systemic lupus erythematosus; T lymphocyte receptor; High throughput sequencing
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）属于免疫系统性疾病，主要的特征表现为产生自身抗体和补体激活以及免疫复合物沉积和多个器官受损。SLE发病后所累及的范围较广，包括皮肤肾脏以及神经系统等多个组织和器官。年轻女性是该病的主要发病群体，其中育龄期妇女比正常女性的发病率要高，女性比男性的发病率更高9倍左右。我国每一千人中就有一名SLE患者，全国患有SLE的人数在100万左右，对我国居民的健康造成了严重的危害[1,2]。SLE早早起发病症状表现的比较多样，因此容易被误诊，增加了诊断上的曼度。SLE是一种典型的自身免疫系统疾病，因此在SLE的发生僧众免疫学异常占有关键的地位，免疫学异常表现包括T淋巴细胞减少、功能减退及B淋巴细胞激活增殖等。近年来研究者对免疫学研究的关注度越来越高，免疫相关研究也越来越深入，伴随着我国医学技术的不断进步，对于该病的研究也日趋成熟，从传统的免疫组化和免疫荧光技术，抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）实验等等发展到现在针对免疫细胞新一代测序技术，免疫学的研究也进入了一个崭新的时期，怎样利用最新的免疫测序技术来解决研究难题，也必将被更多的研究者所关注。因为免疫系统是覆盖全身的防卫网络，既巨大又繁杂。在没有使用扩增建库技术和高通量测序技术之前，人们对于免疫多样性的细胞水平上分析在使用扩增建库技术和高通量测序技术之前非常艰难，因此对于疾病的特异性变化也很难看到。而免疫组库是研究T细胞受体α、β、γ和δ链、B细胞受体重链和轻链可变区的免疫系统多样性，可深入挖掘免疫组库与疾病的关系。本研究以SLE患者为研究对象，通过免疫组库测序进一步阐明 SLE 的病因学及发病机制，对疾病的理解进一步加深，从而开发出更多有效的药物用于疾病的防治，为疾病的诊疗提供了新的依据，促进了个体化诊断的发展。
1. 材料与方法
1．1 材料
SLE患者男性和女性分别为10例和9例，其中最年轻的患者18岁，最年长的50岁，年龄平均为35.64±11.27岁，患病之间最短半年，最长10年。均来自于桂林解放军第181医院皮肤科，根据美国风湿协会相关诊断，所有患者均符合标准。选取同时期的10名健康献血者作为对照组，年龄为20-45岁，平均年龄33.47±9.61岁，为同一医院同一时间段的健康体检者，不患有SLE，无严重疾病史。
1．2 方法
1.2.1DNA的提取及样品检测
在空腹状态下，抽取所有研究对象（10例SLE患者和10例正常献血员）静脉血 5ml（EDTA 1mg:5ml 抗凝）。采用磁珠分选法分离T细胞，DNA的提取按试剂盒操作步骤进行。采用Qubit Fluorometer方法检测DNA样品浓度，琼脂糖凝胶电泳检测品完整性。
1.2.2 文库构建
从每个研究对象的DNA样品中取500ng（最低浓度不得低于35ng/μL），加入特意设计的45个V区引物和13个J区引物后用QIAGEN multiplex PCR Kit进行多重PCR（30cycles）。电泳检测回收100-190bp的多重PCR产物，使用QIAquick Gel Extraction kit进行回收。加入End Repair Mix，在20℃进行末端修复反应，并进行纯化（QIAquick PCR Purification Kit）；经过末端修复后的DNA片段在其3’端连上“A”碱基；再用Adapter oligo mix和DNA ligase配制接头连接反应体系进行接头连接；通过PCR反应富集经过接头修饰的DNA片段，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段后，使用QIAquick Gel Extraction kit进行胶纯化回收，溶于Elution Buffer中，至此文库构建完成。
1.2.3 文库检测
文库检测采用2种方法：一种是使用Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent DNA 1000 Reagents)检测文库的插入片段范围；另一种是使用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System (TaqMan Probe)对文库进行浓度的定量。
1.2.4 高通量测序
使用Illumina测序平台进行文库测序：将检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的浓度。并将变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，然后在簇生成平台cBot上结合TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot - HS试剂完成桥式PCR扩增。最后将制备好的FlowCell采用HiSeq 2000测序系统和TruSeq SBS KIT-HS v3试剂进行上机测序。
1.2.5 生物信息学分析
在数据下机后，首先对原始数据做过滤处理（滤掉含有接头、平均质量低于15、未知碱基（N碱基）多于5%的同时Reads）。过滤完成后，将Pair-end（PE）数据的两条序列拼接成一条完整的contig，最终得到的合并后的序列。使用milaboratory开发的miTCR：http://mitcr.milaborator y. com/downloads/，自动校正由PCR、测序等原因带来的序列错误。比对完成后，自动统计CDR3克隆的表达及插入缺失情况。分别统计各个样品的distinct clone数，辛普森系数及香农威纳系数，在DNA序列、氨基酸序列和V-J组合三个层面分析各个样品的TCR多样性差异和克隆表达差异。
2 结果
正常对照组中平均每个样本获得18772948.4条总读数(Total Reads )。SLE疾病组中平均每个样本获得20898195.9条总读数。然后对这些原始数据做过滤处理，正常组的平均过滤率为4.63%，SLE疾病的平均过滤率为5.80%。过滤完成后经拼接得到合并后的序列，正常组中平均有10674277.8条优质序列（Total good sequences）, SLE疾病组平均有11537754.7条优质序列。而正常组和疾病组的平均克隆（Clones）数分别为87125和57174.4，每个样本的序列统计情况见表1。
2.1 CDR3、VD InDel和DJ InDel长度分布频率
通过对10个SLE患者和10个健康者外周血T淋巴细胞的TCRβ CDR3、VD indel和DJ InDel长度分布进行统计并求均值 (图1），发现TCRβCDR3 的长度分布在16nt~106nt之间，其中SLE患者中分布频率最大的5个CDR3长度为45，42，39，48和36，NC组中5个频率最大的CDR3长度为42, 45, 39, 36和48nt；VD indel长度分布在-1~71nt，其中SLE患者中分布频率最大的5个VD indel长度为0，3，4，2和1，NC组中5个频率最大的VD indel长度为0, 2, 3, 1和 4nt；DJ indel长度分布在-1~73nt，其中SLE患者中分布频率最大的5个DJ indel长度为0，3，2，4和1，NC组中5个频率最大的DJ indel长度为0, 1, 2, 3和4；总的来说，SLE患者外周血单个核细胞中的TCRβCDR3、VD indel和DJ InDel长度分布频率和健康对照组中的分布频率相似，无显著性差异。
图1. SLE患者组和NC组外周血单个核细胞中TCRβCDR3(A)、VD indel(B)和DJ InDel (C)长度分布频率图。横轴是nt长度分布区间，竖轴是不同长度(nt)的分布频率。
Figure 1. Length distribution of CDR3, VD indel, and DJ indel in the SLE group and NC group. The horizontal axis is the length distribution interval of nt, the vertical axis is the frequency distribution of nt in different length.
2.2克隆扩增
每一个Clone的克隆性扩增程度的计算方法是：该Clone在测试样本中出现的次数/该样本的总优质序列数。在此，我们将克隆扩增程度划分为≥0.5%，0.05~0.5%，0.005~0.05%，0.0005~0.005%和<0.0005%五个等级，定义克隆频率大于0.5%的Clones为高度扩增性克隆（highly expanded clones，HEC)，并从DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种不同分辨率统计每个克隆的克隆扩增程度。在DNA序列中，发现SLE患者组和NC组的高度扩增性克隆数分别106和73个；在氨基酸序列中，SLE患者组和NC组的高度扩增性克隆数分别107和72个；在V-J组合中，SLE患者组和NC组的高度扩增性克隆数分别472和398个。在所有Clones中，高度扩增性克隆（HEC）所占的比例很小。以DNA序列为例（表2，图2），SLE患者中仅2.87×10-2% (范围从 2.95×10-3%到7.42×10-2%) 的 clones 为 HEC, 而NC组中更小，仅9.42×10-3% (范围从9.67×10-4%到2.30×10-2%) 的clones其克隆频率大于0.5%，两组间具有显著性差异(p<0.03)，表明SLE患者中高度扩增性克隆数明显多于正常对照组。从整体克隆性扩增程度来看，SLE患者组中克隆频率分布在≥0.5%，0.05~0.5%和0.005~0.05%区间的Clones数量都明显多于NC组。而对于分布在低扩增性克隆区间（0.0005~0.005%和<0.0005%）的Clones, 其在SLE组的数量明显少于NC组。该结果表明SLE患者组中的Clones的扩增性程度明显高于正常对照组。为了进一步定量SLE组和NC组的TCRβCDR3多态性，我们使用辛普森系数（1/Ds）统计每一个Clone的频率。这个指数的变化范围从1到∞。该值越大表明所分析的样本中所有Clones的扩增性程度越相近，同时多态性越高。我们从DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种分辨率分析SLE患者组和NC组的TCRβCDR3多态性，三种分辨率均显示SLE患者组的TCRβCDR3多态性（DNA水平：1/Ds= 1.017；氨基酸和V-J组合水平：1.024）低于NC组（DNA水平：1/Ds= 1.029; 氨基酸和V-J组合水平：1.039）（图3）。
图2. TCRβ DNA克隆性扩增程度，图中显示SLE患者组和NC组中不同扩增性克隆程度（≥0.5%，0.05-0.5%，0.005-0.05%，0.0005-0.005%和<0.0005%）的Clones的频率分布及不同扩增性克隆区间的克隆（Clones）对T细胞总免疫图谱（Total good sequences）的影响。X轴为不同扩增性克隆区间，Y轴为不同扩增性克隆Clones所占的百分比。
Figure 2. Degree of expansion and frequency distribution of T cell clones. The chart shows that the frequency distribution of clones in different degree expansion（≥0.5%，0.05~0.5%，0.005~0.05%，0.0005~0.005% and <0.0005%）in SLE group and NC group, and the influence of different degree of expansionin on T cell immunity Atlas (Total good total sequences) .
图3. SLE组和NC组中的TCRβCDR3多态性，使用辛普森系数(1/Ds) 从DNA（A)、氨基酸(B)、V-J组合(C)三种不同的分辨率比较两者的多态性。
Figure 3. TCR diversity of the SLE group and NC group. The TCR diversity of each group was calculated at different resolutions of distinct DNA sequence (A), amino acid sequence (B), and V-J combination (C) based on the Simpson index of diversity (1/Ds) .
接着，我们分析了这些HECs是否在SLE组内/NC组内的不同个体中共有/重叠或在SLE组和NC组间共有/重叠。经统计，我们发现在DNA序列和氨基酸序列中没有一个HECs在SLE组内/NC组内的不同个体中共有/重叠或在SLE组和NC组间共有/重叠。然而在V-J组合中，在SLE组内/NC组内的不同个体中存在大量的共有组合，SLE组和NC组间也存在很多的共有组合，只是每个V-J组合的频率不一致。我们将SLE组和NC组中扩增性克隆程度排在前10位的HECs筛选出来并进行比较（图4）。
图4. SLE组和NC组中不同个体的扩增性克隆程度前10位的HECs序列，分别从DNA（A)、氨基酸(B)、V-J组合(C)三种不同的分辨率进行描述。扩增性程度最高的10个序列用不同颜色标注，其余的用灰色标注。
Figure 4. Quantification of T cell repertoire across the SLE group and NC group. The ten most common unique TCRβ CDR3 sequences (A), CDR3 amino acids (B), and V-J combinations (C) among ten samples are indicated in colors, and the remaining clonotypes are grouped together in black.
2.3共有序列
我们对10个SLE患者和10个健康者的T细胞免疫图谱进行测序，在SLE组中获得了 5.4 ×105个核苷酸序列，对应于5.0×105个氨基酸序列。在NC组中获得了8.5×105个核苷酸序列，对应于7.8×105个氨基酸序列（非冗余序列）。我们发现SLE组中的两两共有DNA序列和氨基酸序列分别为8.20%±6.91%和13.84%± 2.30%，NC组中的两两共有的DNA序列和氨基酸序列分别为4.85%±2.50%和12.17%±0.81%。较之于NC组，SLE组中的两两个体间的序列的共有程度没有显著性差异。为进一步分析共有程度，我们将各组（SLE组和NC组）的所有个体的非冗余TCRβ序列视为一个整体。发现绝大部分的 CDR3 DNA 序列 (NC.97.8%，SLE.95.5%) 和氨基酸序列 (NC.94.6%，SLE.93.1%) 只在独立个体中被发现。然而，有些序列共有程度较高。在SLE组中，10个DNA序列和30个氨基酸序列被80%以上（n≥8）的个体所共有。而NC组中，36 个DNA 序列和 178 氨基酸序列被80%以上的个体所共有。值得注意的是，我们发现3个CDR3 DNA (占所有序列的~5.52×10-4% ) 和 4个氨基酸序列 (占所有序列的~8.05×10-4% ) 在所有的SLE患者（n=10）中存在。15个DNA (占所有序列的~1.77×10-3% ) 和30个氨基酸序列 (占所有序列的~3.86×10-3% ) 被所有的健康者共有。这些序列请详见表3和表4。
随后，我们基于SLE/NC组内2个人以上共有的序列来分析SLE组和NC组间之间共有程度，发现一些序列在SLE组和NC组之间共有（图5）。在SLE组中被两人以上共有的DNA序列中，有2.00%的序列存在于NC组中。在氨基酸水平，SLE组中15.19%的AA序列存在于NC组中。而在V-J组合中，SLE组中82.03%的V-J组合存在于NC组中。
图5. SLE患者组和NC组中DNA序列（A)、氨基酸序列(B)、V-J组合(C)的共有程度。红色圆圈代表SLE组中2个人共有的序列，绿色圆圈代表NC组中2个人共有的序列，红色圆圈和绿色圆圈重叠的部分为SLE组和NC组之间共有的共有序列。
Figure 5. The extent of overlap of nucleotide clonotypes (A), amino acid clonotypes (B), and
V-J combinations in the healthy control group and SLE patient group. The Venn diagrams present the total number of nucleotide clonotypes, amino acid clonotypes, and V-J combinations that were shared between the SLE group (red) and NC group (green). The numbers of CDR3 clonotypes that are unique to each group are shown in the nonoverlapping sections, and the numbers of CDR3 clonotypes that are common to both groups are indicated in the relevant overlapping areas. HC, healthy control subjects.
2.4 SLE组和NC组的TRβV 和TRβJ 图谱分析
为了鉴定疾病相关的TRβV和TRβJ亚类，我们比较了SLE组和NC组中各TRβV和TRβJ 基因亚类的表达水平。结果显示，SLE患者组中10个TRβV和6个TRβJ亚类的表达水平明显异于正常对照组（图6）。在50个Vβ基因亚类中，TRBV3-1（P=0.015），TRBV6-2（P=0.02），TRBV6-3（P=0.02），TRBV6-4（P=0.006），TRBV7-1（P=0.011），TRBV12-5（P=0.004）， TRBV18（P=0.009）和TRBV21-1（P=0.035）在SLE患者组中低表达。然而TRBV10-2（P=0.037）和TRBV23-1（P=0.009）在SLE患者组中高表达。在13个Jβ基因亚类中，TRBJ1-4（P=0.026）， TRBJ1-5（P=0.003），TRBJ2-4（P=0.004），TRBJ2-5（P=0.02），TRBJ2-6（P=0.013）在SLE患者组的外周血中低表达，而TRBJ2-7（P＜0.001）在SLE患者组的外周血中高表达。其余的Vβ和Jβ的表达水平在SLE患者组和NC组中没有显著性差异。
图6. SLE组和NC组中TRBV和TRBJ 基因亚家族使用频率的比较。条形图描述了SLE组（n=10)和NC组（n=10)中每个TRBV基因（A)和TRBJ 基因（B)亚家族的平均使用频率和标准差。采用F统计方法来计算显著性差异(*p＜0.05，*p＜0.01).
Figure 6. Relative frequencies of each TRBV gene (A) and TRBJ gene (B) family in PBMCs from the SLE group and NC group. Bars and error bars indicate the respective mean frequencies and standard deviations of the results from 10 individuals. Significant differences were statistically analyzed by the F-test (*p＜0.05，*p＜0.01).
虽然通过分析TRβV 和TRβJ 基因亚家族的表达水平，可以筛选出疾病相关的V，J基因，但V-J组合的使用频率差异更能挖掘出有价值的信息。接着我们比较了SLE组和NC组V-J组合的使用频率（图7）。合计20个样本的（10个SLE患者和10个健康者）TCR 图谱，获得5888个 V-J组合。在这些V-J组合中，73 个V-J组合在SLE患者组的表达量明显异于NC组。统计显著性差异定义为p＜0.05。
图7. 比较SLE组和NC组V-J组合的使用频率。X轴为J基因的亚类分布，Y轴为V基因的亚类分布.采用F统计方法来计算显著性差异，不同颜色代表不同程度的显著性差异，颜色有红到蓝表示该V-J组合在SLE组和NC组的使用频率的显著性差异程度越大。
Figure 7. Comparison of the average V-J gene utilization of the sequenced TCRβsequences between the SLE group and NC group. J gene segments are arranged on the x-axis, and V gene segments are arranged on the y-axis. Significant differences were statistically analyzed by the F-test. Different colors (red to blue rectangular bands) indicate different levels of significance.
3 讨论
作为一种慢性的免疫系统疾病，ALE的临床特征主要表现为T、B细胞活化异常、补体激活、免疫复合物清除障碍、沉积、产生自身抗体等，发病后累及的范围较广，可引起多个组织和器官的损伤，包括皮肤，关节，肾及中枢神经系统等。异常的T细胞信号传导是T细胞免疫功能障碍的基础。TCR的CDR3区域具有独特的分子结构，每个T细胞只表达一种特异性TCR CDR3。在本研究中，我们使用新一代测序技术研究SLE患者外周血单个核细胞的TCR BV CDR3基因的多态性和特征谱。分析了222,120,325条优质序列的CDR3, VD indel 和 DJ indel 长度分布频率，频率较高的CDR3, VD indel 和 DJ indel被鉴定。TCR的V、D、J基因片段在T细胞的发育过程中重新排列，结果发现将核苷酸的不同数量随机的插入到V-J片段或-D-J间的能够形成多样性的可变区-CDR3，CDR3序列决定着TCR克隆型，度和氨基酸排列的顺序早很大程度上具有严重的差异。要检验T细胞的克隆性可以通过CDR3的长度来进行判断。本研究结果显示CDR3SLE在患者组和NC组, VD indel 和 DJ indel 长度分布特征没有显著性差异。类似的研究中，Venturi等人[3]发现记忆T细胞的CDR3长度分布频率与初始T细胞的明显不同。此外，大量研究表明长链IgH CDR3结构与自身反应或多反应性抗体相关[4-7]。这也是B细胞分化过程中长链IgH CDR3 结构被移除的重要原因。另有研究发现短CDR3结构与胸腺CD4 单阳性细胞有关[8]。总之，CDR3 结构长短之间的功能差异有待进一步研究。
我们发现绝大部分T细胞的克隆（Clones）在优质序列（total good sequences）中的频率较低，表明这些Clones没有经历克隆性扩增。而在每个个体的TCR BV CDR3图谱中都发现一些高度扩增性克隆（HECs），可能是机体在环境中的抗原或病原体的刺激下形成的。虽然我们发现NC组和SLE组的Clones都有克隆性扩增的现象，SLE组的克隆性扩增程度要高于NC组。由于较NC组，SLE患者体内存在大量的自身抗原，而慢性炎症条件下这些自身抗原将引发新的自身反应性克隆。然而，本研究没有发现SLE组不同个体间存在相同的HECs，可能源于SLE是一种复杂的自身免疫性疾病，体内的自身抗原具有多态性，很难发现共有的HECs。
近年来被证实SLE的发病与TCR库的限制性取用具有十分密切的联系。根据TCR Vβ亚家族的CDR3的特点发现，用多重PCR和高通量测序技术分析了SLE患者组和NC组外周血单个核细胞TCR BV CDR3区域中V, D和J基因亚家族的使用频率。结果发现SLE患者组中10个TRβV和6个TRβJ亚类的表达水平明显异于正常对照组。在SLE的发生过程中表示有RβV和TRβJ亚家族的而异常表达参与。说明在自身抗原的刺激下, TCRV/J基因存在优势取用的现象。VDJ基因重排在正常人TCR区域是具有随机性的。当发生疾病时，体内的特异性相关抗原对TCR基因产生刺激，导致TCR基因发生选择性的重新排列，因此表现为选择性表达某些家族的Ｔ细胞，只表达优势。出现某些TCR特异性的T细胞克隆性增殖的现象，破坏TCR的多态性。而TCR的多样性对健康起着至关重要的作用，免疫蛋白的亚型越多，越能有效抵抗病原体，亚型越少越容易感染疾病[9-11]。Sun等[12]发现TRBV27的异常表达与GVHD的发生密切相关。Wang和同事研究了母胎界面T细胞受体谱偏移与复发性流产的关系，发现复发性流产患者母胎界面的某些TCR BV图谱较正常对照组发生明显偏移，并表明这些TCR BV的优势取用是导致习惯性流产的原因[13]。关于SLE疾病，符粤文等[14]发现8例SLE患者TCR BV CDR3谱型图均出现异常，表现为CDR3多态性降低，BV家族寡克隆增生Vβ13.1、Vβ8、Vβ9、Vβ18寡克隆增生。
共有TCR DNA序列和氨基酸序列是不同个体所共有的[15]，这些序列由于在不同个体中表达且响应相同抗原决定簇的刺激，以至于筛选出共有序列是小概率事件。然而，最近研究学者越来越重视共有TCR序列的发现，涉及急性和慢性疾病以及自身反应性疾病[16]。在本研究中，我们筛选出一些共有序列。值得注意的是，我们发现3个CDR3 DNA和4个氨基酸序列被所有的SLE患者（n=10）共有，这些序列是SLE疾病的潜在生物标志物，对疾病诊断、病情判断及预后评估有重要价值。另外，有研究发现共有序列的形成源于VDJ基因重排过程中的固有偏向，这是在不同个体中重头合成相同TCR序列所需要的条件，就如在胸腺和抗原刺激选择过程中极强的偏向。为了研究是共有序列产生的机制，AsafMadi等人使用电脑模拟方法创建了TCR图谱，发现重排偏好，重排容易和T细胞选择在塑造TCR CDR3序列的过程中发挥着重要的作用[17]。
总之，我们成功的应用免疫组库测序方法从分子水平研究整个免疫图谱的多样性。进一步研究应该更好地阐明TCR图谱在免疫识别，自身免疫性和自身反应中的作用。以期更好地理解疾病的致病机理，并对其诊断、治疗和预防提供新的思路。
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第一作者简介：张家兴（1990—），男，硕士研究生在读，主要研究方向为狼疮肾病，肾移植
通讯作者简介：眭维国 （1964—），男，主任医师，硕士，主要研究方向为肾移植
论文作者:张家兴1,2，赖柳生2，王磊2，眭维国1,2[]
论文发表刊物:《中国医学人文》2018年第5期
论文发表时间:2018/6/29
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