章静茹[1]2013年在《Notch/Dll4和VEGF信号通路在急性髓性白血病血管新生中的交互作用及机制研究》文中研究指明第一部分Notch/D114和VEGF信号通路在急性髓性白血病中的表达及临床意义研究背景：血管新生是指在原有血管基础上芽生出新的血管、广泛重建后形成稳定血管网络的复杂过程,在实体肿瘤的生长、转移及预后中发挥重要作用。越来越多的研究表明,骨髓微血管密度增多(即骨髓血管新生)对急性髓性白血病(AML)的发展、化疗耐药和预后亦有重要意义。AML骨髓微环境中血管生成刺激因子(正调节)和血管生成抑制因子(负调节)的相对平衡,可控制骨髓血管生成开关,从而调控AML血管新生。其中,血管内皮细胞生长因子(VEGF)和Notch/D114信号通路可能是调节AML血管新生的两个最重要机制。VEGF信号通路是调节胚胎血管发育和肿瘤血管新生的主要信号通路,对血管发育的启动至关重要。AML中VEGF的表达失调不仅可促进血管新生,还能刺激AML细胞增殖、迁移。研究显示,在初诊AML患者中可检测到VEGF和VEGFR2表达上调,且其高表达的AML患者易出现化疗药物抵抗、预后较差,提示VEGF信号通路与AML的发生、发展及预后关系密切。最近研究显示,Notch信号通路,尤其是Notch配体D114是另一调节肿瘤血管新生的重要信号通路。Notch信号通路在细胞增殖和分化等命运决定中起关键作用,其异常调控可导致肿瘤等多种疾病的发生。D114介导的Notch信号通路活化对肿瘤细胞与邻近内皮细胞的相互作用也有重要意义,可能在AML血管新生中发挥重要的调节作用。研究表明,根据肿瘤的组织来源和细胞类型,Notch/D114信号通路可发挥促进或抑制血管新生的作用。此外,该信号通路对不同肿瘤的预后影响亦存在很大差异,可能起促癌或抑癌作用。因此,阐明Notch/Dll4信号通路在AML中的预后价值对抗AML血管新生治疗具有重要意义。研究显示VEGF信号通路在血管新生中起促进作用；Notch/Dll4信号通路则能促进血管成熟、阻断新生血管分支形成,抑制血管的过度增生,从而发挥负调节作用,提示在AML血管新生中可能同时存在这两条正、负信号调节通路。因此,只有在VEGF和Notch/Dll4信号通路的协调作用下,AML血管新生才能有序进行。综上所述,AML细胞和骨髓微环境中的内皮细胞均能分泌多种血管调节因子,并且AML血管新生依赖于这些血管调节因子的相互协调作用。因此,明确AML中血管调节因子的相互关系及临床预后意义,可揭示AML血管新生的分子病理机制,为抗AML血管新生的治疗提供新思路。研究目的：研究Notch/Dll4和VEGF信号通路分子(Notch1、Dll4、Hes1、VEGF、VEGFR1和VEGFR2)在AML患者外周血和骨髓中的表达水平：探讨Notch/Dll4和VEGF信号通路在AML血管新生中的相互关系及临床意义；阐明Notch1和D114分子异常表达对AML患者的预后影响,为AML提供新的预后指标。研究方法：1.标本采集：收集122例AML患者和40例健康志愿者的外周血标本,分为初诊组(60例)和完全缓解组(62例)；收集60例初诊AML患者和40例健康志愿者的骨髓标本；收集8例初诊AML患者和5例健康志愿者的骨髓活检标本,所有初诊AML患者的骨髓活检标本中原始细胞比例大于50%。采用差速离心法分离外周血血清,采用淋巴细胞分离液分离外周血或骨髓单个核细胞。2.酶联免疫吸附试验(ELISA)去：血清离心去除细胞碎片,分装并储存于-20℃,应用ELISA方法检测血清中VEGF、VEGFR1和VEGFR2蛋白的分泌。3.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)法：采用TRIzol提取细胞总RNA,使用M-MuLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA,应用Real-time RT-PCR方法检测外周血或骨髓单个核细胞中Notch1、Dll4、Hes1、 VEGF、VEGFR1和VEGFR2基因mRNA水平的表达。4Western blot法：采用细胞裂解液RIPA提取细胞总蛋白,SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,应用Western blot方法检测外周血或骨髓单个核细胞中Notch1、Dll4和Hes1蛋白水平的表达。5.免疫细胞化学(ICC)法：将外周血单个核细胞悬液吹匀,滴加在多聚赖氨酸包被处理的玻片上,多聚甲醛固定,应用ICC方法检测外周血单个核细胞中Notch1、Dll4和Hes1蛋白水平的表达。6.免疫组织化学(IHC)法：应用IHC方法检测骨髓活检组织中CD34蛋白水平的表达,即为骨髓微血管密度(MVD),评价骨髓血管新生的程度；应用IHC方法检测骨髓活检组织中Dll4和VEGF蛋白水平的表达。分析骨髓MVD与Dll4、VEGF蛋白表达的关系。7.统计分析：应用Mann-Whitney U检验、方差分析、Kruskal-Wallis检验分析AML患者组和对照组中Notch1、Dll4、Hesl、VEGF. VEGFR1和VEGFR2等血管调节因子的表达差异；应用Spearman秩相关分析各个血管调节因子表达的相关性、血管调节因子表达和临床特征的相关性：应用Kaplan-Meier生存曲线评估各组AML患者的生存率,log-rank检验比较组间生存率差异；应用单因素Cox比例风险回归模型评价各个因素对生存的预后影响,多因素Cox比例风险回归模型确定与生存相关的独立危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1Notch/D114和VEGF信号通路分子在AML患者外周血标本中的表达：①ELISA结果显示AML完全缓解组中血清VEGF浓度明显高于对照组,而初诊组中血清VEGF浓度明显低于完全缓解组,初诊组中血清VEGFR1、 VEGFR2浓度明显高于对照组；②Real-time RT-PCR结果显示初诊AML患者外周血单个核细胞中Notch1、D114、Hes1和VEGFR2基因mRNA表达水平明显高于对照组,而初诊AML患者外周血单个核细胞中VEGF和VEGFR1基因mRNA表达水平与对照组无显着差异；③Western blot和ICC结果显示初诊AML患者外周血单个核细胞中Notch1、Dll4和Hes1蛋白表达水平亦明显高于对照组；④Spearman秩相关分析结果显示初诊AML患者外周血Notch1与VEGFR2、Dll4与VEGFR2的mRNA表达显着相关,相关系数分别为0.483和0.426,表明AML患者外周血中存在Notch/D114和VEGF信号通路的异常激活。2Notch/D114和VEGF信号通路分子在AML患者骨髓标本中的表达：①Real-time RT-PCR结果显示初诊AML患者骨髓单个核细胞中Notch1、Dll4、VEGF和VEGFR2基因(?)nRNA表达水平明显高于对照组,而初诊AML患者骨髓单个核细胞中VEGFR1基因(?)nRNA表达水平与对照组无显着差异；②(?)Western blot结果显示初诊AML患者骨髓单个核细胞中Notch1和Dll4蛋白表达水平亦明显高于对照组；③Spearman秩相关分析结果显示初诊AML患者骨髓Notch1与D114、VEGF与VEGFR2、Dll4与VEGF的mRNA表达显着相关,相关系数分别为0.326、0.354和0.663,表明AML患者骨髓中存在Notch/D114和VEGF信号通路的异常激活。3.AML患者骨髓MVD及其与Dll4和VEGF蛋白表达的关系：①IHC结果显示初诊AML患者骨髓MVD较对照组明显增高；初诊AML患者骨髓Dll4和VEGF蛋白的表达水平较对照组亦明显增高,分别为1.27-4.63和1.49-2.92倍；②Spearman秩相关分析结果显示骨髓MVD与Dll4和VEGF蛋白的表达显着相关,相关系数分别为0.858和0.816,表明初诊AML患者骨髓MVD显着增加,且其与骨髓Dll4和VEGF蛋白的高表达呈正相关。4.AML患者骨髓标本中Notch/D114和VEGF信号通路分子表达与临床特征的相关性：①Spearman秩相关分析结果显示骨髓Notch1、Dll4和VEGF的mRNA表达水平与AML骨髓原始细胞比例显着相关,相关系数分别为0.428、0.288和0.428；②方差分析结果显示细胞遗传学各亚组间骨髓Dll4和VEGF的mRNA表达差异有统计学意义,而Notch/D114和VEGF信号通路分子的mRNA表达水平与性别、年龄及FAB分型无关。5.AML患者骨髓标本中Notch/D114和VEGF信号通路分子表达与临床预后的相关性：①AML患者的中位总生存期(OS)为25个月；②单因素Cox比例风险回归模型显示不良染色体核型、Notch1高表达、D114高表达或VEGF高表达的AML患者OS较短,多因素Cox比例风险回归模型显示染色体核型及Notch1、Dll4和VEGF的表达水平是影响AML患者OS的独立危险因素；③Kaplan-Meier生存曲线显示Dll4表达的预后价值在细胞遗传学中危组AML患者中更为显着。Notch1和Dll4表达水平是VEGF高表达AML患者的不利预后因素。结论：1.AML患者中存在Notch/D114和VEGF信号通路的异常活化,提示这两条信号通路可能在AML发生、发展中起作用。2.AML患者中D114和VEGF蛋白的异常高表达与骨髓微血管密度增高相关,提示Dll4和VEGF可能在AML血管新生中起作用。3.AML患者中Notch/D114信号通路的异常活化与预后不良有关。D114表达水平可能是细胞遗传学中危组AML患者的新预后标志。第二部分Notch/D114信号通路在急性髓性白血病体外血管新生中的作用及其与VEGF信号通路的交互作用研究背景：AML是一类以骨髓中不成熟髓细胞的异常增殖和聚集、以及骨髓造血抑制为特征,严重威胁人类健康的造血系统恶性疾患。骨髓微环境中AML原始细胞与邻近内皮细胞间的相互作用对AML的发生、进展及化疗抵抗有重要意义。我们前期研究显示初诊AML患者骨髓MVD显着增高,且其与血管调节因子的表达相关,进一步研究发现骨髓血管调节因子的高水平表达可成为独立的预后不良因素。由此可见,骨髓血管新生的程度及血管调节因子的表达在AML的发病和预后中起重要作用,抗AML骨髓血管新生有望成为AML治疗的有力手段。AML骨髓微环境可维持血管调节因子的相对平衡,控制血管生成开关,从而调控AML血管新生。研究显示,AML细胞能够分泌多种血管调节因子,刺激或抑制内皮细胞增殖,导致血管新生增强或减弱。VEGF是其中最重要的血管生成刺激因子,不仅可促进内皮细胞血管新生,还能刺激AML细胞增殖。VEGF在多种人类肿瘤中过表达,与肿瘤的发生、发展关系密切。目前,VEGF已成为极具发展潜力的肿瘤治疗靶点,通过单克隆抗体等药物靶向治疗转移性结直肠癌的研究已取得较大进展,但仍存在药物敏感性低、肿瘤细胞耐药以及药物不良反应等问题,提示在肿瘤血管新生中可能还存在更复杂的调控机制。因此,研究VEGF与其他信号通路的交互作用具有重要价值,可能为AML等多种肿瘤的多靶点分子靶向治疗开辟新途径。Notch信号通路异常调控在多种肿瘤的发生、发展中起关键作用,AML亦不例外。新近研究显示,Notch通路配体Dll4亦可参与对血管发生及生长的调控。有研究报道,D114在肾癌和膀胱癌血管内皮细胞中高表达,阻断D114信号能引起肾癌血管内皮细胞周期阻滞,抑制血管新生。然而,在小鼠胶质瘤模型的研究中发现,阻断D114信号可导致胶质瘤的血管分支增多、血管密度增加。综上所述,D114在肿瘤血管新生的调节中占重要地位,可发挥促进或抑制作用,但Notch/D114信号通路在调控AML骨髓血管新生中的作用尚不明确。研究显示,Notch/Dll4和VEGF信号通路在内皮细胞增殖分化及肿瘤血管新生中存在联系。VEGF可诱导Dll4表达,激活Notch/Dll4信号通路,说明VEGF对Notch/D114信号通路有正调节作用。而Notch/Dll14信号通路活化可减弱内皮细胞对VEGF诱导的血管新生反应,提示Notch/D114信号通路可能会反馈抑制VEGF信号通路的功能活性。另有研究显示,Notch1与基质金属蛋白酶(MMPs)在肿瘤的侵袭、转移和血管新生中亦存在交互作用。因此,我们推测Notch/D114和VEGF信号通路或MMPs在AML血管新生的调控中很可能存在交互作用。本研究在前期工作基础上进一步探讨Notch/D114信号通路在调控AML骨髓血管新生中的作用及其与VEGF信号通路的交互作用,为抗AML血管新生的治疗提供新靶点。研究目的：研究AML细胞对共培养内皮细胞增殖、迁移及体外血管新生的影响,探讨Notch/D114信号通路在AML诱导内皮细胞功能中的作用及机制,阐明Notch/D114信号通路对VEGF信号通路的负反馈作用及机制。预期目标的实现将明确Notch/D114信号通路在AML血管新生中的重要地位,并揭示Notch/D114与VEGF信号通路在调节AML骨髓微环境血管新生中的交互作用,为AML的分子靶向治疗提供理论学依据和实验室基础。研究方法：1.细胞体外共培养模型的构建：AML细胞HL60、Kasumi、NB4、K562与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)在Transwell细胞培养板中行间接共培养,或在24孔细胞培养板中行直接共培养。2.细胞增殖实验：将共培养前、后的HUVECs细胞接种于96孔细胞培养板中,应用CCK-8法检测HUVECs细胞的存活,分析AML与HUVECs细胞共培养对HUVECs细胞增殖的影响。3.细胞迁移实验：将HUVECs细胞接种于Transwell细胞培养板的上层小室中,共培养上清加入下层小室,应用Transwell细胞迁移实验检测HUVECs细胞的迁移能力,分析AML与HUVECs细胞共培养上清对HUVECs细胞迁移的影响。4HUVECs体外血管新生实验：将HUVECs细胞接种于己铺好Matrigel基质胶的12孔细胞培养板中,用共培养上清培养HUVECs细胞,应用HUVECs管状形成实验检测HUVECs细胞的体外血管新生能力,分析AML与HUVECs细胞共培养上清对HUVECs细胞体外血管新生的影响。5.细胞转染：应用Lipofectamine2000将携带Notch1小干扰片段(siRNA)或Dll4真核表达载体(pIRES2-EGFP-D114)的质粒分别转染HUVECs细胞和AML细胞NB4、K562,采用G418筛选至少2周获得稳定转染的细胞,再将AML细胞与转染的HUVECs细胞/转染的AML细胞与HUVECs细胞行直接或间接共培养。应用CCK-8法、Transwell细胞迁移实验和HUVECs管状形成实验观测转染对HUVECs细胞增殖、迁移和体外血管新生的影响。6ELISA法：将AML细胞接种于6孔细胞培养板中,离心分别收集细胞和细胞培养上清,行细胞计数；离心收集转染前、后AML与HUVECs细胞共培养上清,应用ELISA方法检测AML细胞培养上清或共培养上清中VEGF蛋白的分泌。7Real-time RT-PCR法：采用TRIzol提取细胞总RNA,使用M-MuLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA,应用Real-time RT-PCR方法检测转染前、后AML或HUVECs细胞中Notch1、D114、Hes1、Hey1、Hey2、VEGF、VEGFR1和VEGFR2基因mRNA水平的表达。8Western blot法：采用细胞裂解液RIPA提取细胞总蛋白,SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,应用Western blot方法检测转染前、后AML或HUVECs细胞中Notch1、D114和Hes1蛋白水平的表达。9.明胶酶谱法：收集AML与HUVECs细胞共培养上清,BCA试剂盒检测共培养上清的蛋白浓度,取等量蛋白上样,采用含A型明胶的SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,应用明胶酶谱法检测转染前、后AML与HUVECs细胞共培养上清中MMP2和MMP9蛋白的活性。研究结果：1.AML细胞对共培养内皮细胞功能的影响：①ELISA结果显示AML细胞HL60、Kasumi、NB4、K562培养上清中VEGF浓度较对照组明显增高；②CCK-8法检测发现,与AML细胞间接共培养后,HUVECs细胞增殖明显增强；与AML细胞培养上清共孵育后,HUVECs细胞增殖亦明显增强：而与AML细胞直接共培养后,HUVECs细胞增殖无明显变化；③Transwell细胞迁移实验发现,与AML细胞间接共培养或与AML细胞上清共孵育后,HUVECs细胞迁移明显增强；④HUVECs体外血管新生实验发现,与AML细胞间接共培养或与AML细胞上清共孵育后,HUVECs管状形成明显增多,表明间接共培养时,AML细胞可分泌VEGF,促进内皮细胞的增殖、迁移和体外血管新生。2.AML细胞对共培养内皮细胞Notch/D114信号通路的影响：①Real-time RT-PCR结果显示HUVECs与AML细胞间接共培养后,HUVECs细胞中Notch1、D114、Hes1、和Hey2的rnRNA表达水平较对照组明显升高；②、Vestern blot结果显示HUVECs与AML细胞间接共培养后,HUVECs细胞中Notch1和Dll4的蛋白表达水平较对照组亦明显升高；③明胶酶谱结果显示HUVECs与AML细胞间接共培养后,共培养上清中MMP2和MMP9的活性较对照组明显增强,表明AML细胞间接共培养可激活内皮细胞中Notch/D114信号通路。间接共培养时,AML诱导的内皮细胞功能增强可能与Notch/D114信号通路活化及其下游基因MMPs活性增强有关。3.下调内皮细胞中Notch1的表达对AML诱导内皮细胞功能的影响：①Real-time RT-PCR和Western blot结果显示Notch1siRNA转染后,HUVECs细胞中Notch1和Hes1的mRNA和蛋白表达水平较对照组明显下降,而Dll4的蛋白表达水平无明显变化,说明针对Notch1的siRNA片段能有效下调HUVECs细胞中Notch1的表达；②明胶酶谱结果显示Notch1siRNA转染后,HUVECs与NB4细胞间接共培养上清中MMP2和MMP9的活性较对照组明显减弱；③CCK-8法、Transwell细胞迁移实验和HUVECs体外血管新生实验发现Notch1siRNA转染后,间接共培养中HUVECs细胞的增殖和迁移显着抑制,管状形成亦明显减少,表明间接共培养时,内皮细胞中siRNA介导的Notch1表达下调可抑制AML诱导的内皮细胞增殖、迁移和体外血管新生。4.上调AML细胞中Dll4的表达对AML细胞增殖及内皮细胞功能的影响：①Real-time RT-PCR和Western blot结果显示pIRES2-EGFP-D114表达载体稳定转染后,NB4和K562细胞中Dll4的mRNA和蛋白表达水平较对照组明显升高,说明Dll4真核表达载体能有效上调AML细胞中Dll4的表达；②CCK-8法检测发现pIRES2-EGFP-D114表达载体转染后,NB4和K562细胞的增殖无明显变化,而直接共培养中HUVECs细胞的增殖显着抑制,间接共培养中HUVECs细胞的增殖亦无明显变化；③HUVECs体外血管新生实验发现pIRES2-EGFP-D114表达载体转染后,直接共培养中HUVECs细胞的管状形成明显减少,而间接共培养中HUVECs细胞的管状形成无明显变化,表明直接共培养时,AML细胞中Dll4的表达上调可抑制内皮细胞增殖和体外血管新生。5.上调AML细胞中Dll4的表达对共培养内皮细胞Notch/D114和VEGF信号通路的影响：①Real-time RT-PCR和Western blot结果显示NB4和K562细胞中Dll4表达上调后,仅直接共培养中HUVECs细胞Notch1、Hesl和Hey2的(?)nRNA表达水平较对照组明显升高,Notch1和Hes1的蛋白表达水平较对照组亦明显升高；②明胶酶谱结果显示HUVECs与Dll4过表达的AML细胞直接共培养后,共培养上清中MMP2和MMP9的活性较对照组明显减弱；③ELISA结果显示HUVECs与Dll4过表达的AML细胞直接共培养后,共培养上清中VEGF的浓度较对照组明显降低；④Real-time RT-PCR结果显示HUVECs与Dll4过表达的AML细胞直接共培养后,HUVECs细胞中VEGFR2的mRNA表达水平较对照组明显降低,而VEGFR1的nRNA表达水平较对照组明显升高,表明直接共培养时,AML细胞中Dll4的表达上调可活化内皮细胞Notch信号通路,减弱其下游基因MMP的活性,并抑制VEGF信号通路。6.VEGF活化对Dll4上调诱导内皮细胞功能抑制的影响：①HUVECs体外血管新生实验发现HUVECs与Dll4过表达的AML细胞直接共培养后,加入重组人VEGF(rhVEGF)能使HUVECs细胞的管状形成明显增多；②明胶酶谱结果显示HUVECs与Dll4过表达的AML细胞直接共培养后,加入rhVEGF亦能使共培养上清中MMP2和MMP9的活性明显增强,表明VEGF是Dll4介导内皮细胞增殖和体外血管新生的关键分子。直接共培养时,VEGF信号通路活化可减弱D114上调对内皮细胞功能的抑制作用。结论：1.间接共培养时,AML细胞可活化VEGF和Notch/Dll4信号通路,增强MMP2和MMP9的活性,从而促进内皮细胞的增殖、迁移和体外血管新生2.直接共培养时,上调AML细胞中Dll4的表达可抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖和体外血管新生。3Notch/Dll4和VEGF信号通路在AML血管新生的调控中存在交互作用,靶向这些信号通路可能为抗AML血管新生的治疗开辟新途径。
温树鹏[2]2003年在《AML患者MMP-2，MMP-9基因表达的预后意义及其与VEGF相关性的分析》文中研究指明目的：基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2，-9在实体肿瘤的侵袭，转移过程中发挥了重要作用。MMP-2，MMP-9在造血系统尤其是恶性血液病中的作用的报道日渐增多，而且与VEGF关系密切，它们有可能协同参与了白血病的髓外浸润。本研究的目的在于探讨它们之间的关系，以及在急性髓系白血病髓外浸润中的意义。方法：本研究的研究对象包括研究对象包括86例急性髓系白血病患者(包括50例初治患者、15例复发患者和21例缓解患者)，15名健康正常人,和HL-60细胞株。首先将其分为AML组、缓解组和对照组。我们首先应用半定量RT-CR和ELISA的方法分别测定了叁组对象骨髓单个核细胞中VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA的表达情况与其血清中VEGF蛋白的水平。分析了VEGF和MMP-2，MMP-9 mRNA之间的关系，VEGF与髓外浸润的关系。然后从65例患者中随机选取18例患者的原代骨髓单个核细胞和急性髓系白血病细胞株HL-60进行了培养。每个患者培养两份，在其中一份作为对照，另一份加入50ng/ml重组人VEGF121，作用24小时后，用半定量RT-PCR<WP=4>的方法测定VEGF121作用组细胞和对照组细胞中MMP-2，MMP-9 的mRNA水平，同时用明胶酶谱的方法测定了两组细胞上清中MMP-2，MMP-9的活性，比较两者之间的差异，以确定VEGF121对MMP-2，MMP-9有无影响。此外我们还观察了VEGF对HL-60细胞中bcl-2 mRNA的影响。结果：1. 初治AML患者中，MMP-2 mRNA表达率为64％（32/50），平均表达水平为0.508，复发患者中，MMP-2 mRNA表达率为66.7％（10/15），平均表达水平为0.643，均高于正常对照。而MMP-9的表达与正常对照无明显差异。2. AML组中VEGF mRNA的表达率为47.7％（31/65），平均表达水平0.33，VEGF蛋白的表达率为80%（52/65），平均水平为227.2pg/ml。MMP-2的表达率为64.6％（42/65），平均表达水平0.531。MMP-9的表达率为44.6％（29/65），平均表达水平0.337。MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA与VEGF mRNA和VEGF蛋白具有明显的相关性。在缓解期患者和正常对照中则没有这种相关关系。按照VEGF mRNA的表达与否，将患者分为VEGF阳性组和阴性组，进一步分析结果发现：VEGF阳性组MMP-2，MMP-9的平均表达水平高于VEGF阴性组（p<0.05）。3. 我们根据临床资料的统计，将患者分为髓外浸润组和无髓外浸润组用t检验比较两组之间MMP-2，<WP=5>MMP-9以及VEGF水平的差异发现：髓外浸润组的12例患者中，MMP-2 mRNA有11例表达，MMP-9 mRNA有9例表达，而在无髓外浸润组的53例患者中，MMP-2 mRNA有31例表达， MMP-9 mRNA有20例表达，两组对比，MMP-2，MMP-9表达率、表达水平均有显着性差异，P<0.05。髓外浸润组VEGF mRNA的表达水平与血清中的VEGF的含量也均高于无髓外浸润组，在VEGF mRNA阳性的31例患者中有9例发现髓外浸润，而在VEGF阴性的34例患者中仅有3例发现有髓外浸润，具有显着差异（p＝0.037）。4. 细胞培养的结果显示：VEGF121可以使HL-60细胞和部分原代细胞中MMP-2和（或）MMP-9的 mRNA水平增加，培养上清中MMP-2，MMP-9活性提高。VEGF121还增加了HL-60细胞中bcl-2的表达。结论：在AML患者中，与MMP-2，MMP-9的表达和VEGF的mRNA水平、蛋白水平具有明显的相关性。VEGF表达阳性的患者，髓外浸润的发现率高于VEGF表达阴性的患者。VEGF121可以上调部分AML患者中MMP-2，MMP-9的表达，VEGF可能与MMP-2，MMP-9共同参与了白血病髓外浸润的发生
佚名[3]2004年在《肿瘤生物标志物与肿瘤转移》文中指出14—3—3zeta蛋白对肿瘤转移抑制作用的探讨陈惠华’王妍徐元基杜芝燕陆应麟军事医学科学院基础医学研究所,北京,100850 摘要目的:探讨14—3—3zeta蛋白与肿瘤转移的关系。, 方法:通过联合抑制消减杂交和基因芯片技术筛选在肺巨细胞癌高、低转移株中表达水平存在显着差异的序列,其中一条与14—3—3zeta高度同源。在RNA和蛋白水平对其表达水平进行验证;构建14—3—3zeta的正反义真核表达载体并分别转染肺巨细胞癌高、低转移株;并对转染后细胞的增殖能力、黏附能力以及迁移能力等生物学行为进行研究。
郭政军[4]2015年在《转录因子RUNX2在胃癌侵袭转移中的作用及其分子机制探究》文中进行了进一步梳理尽管近年来发病率有所降低,在全球范围内,胃癌依旧是致死率全球第五的高度恶性的肿瘤。尽管消化道内镜检查已引入到胃癌早期临床诊断过程中,仍有65%的患者首诊就发现有胃癌的侵袭和远处转移,且进展期胃癌患者的5年生存率低至5%-15%。侵袭与转移、术后复发和多药耐药均被认为是胃癌患者预后不良,术后生存时间短的重要原因。胃癌,这一消化道恶性肿瘤的诸多恶性生物学行为其背后的分子机制至今仍不清楚。而报道已证实,转录因子RUNX2参与促进多种易发生骨转移肿瘤的侵袭与转移行为的发生,同时,我们的实验发现RUNX2在胃癌干细胞中高表达,因此,我们的研究旨在揭示RUNX2在促进胃癌细胞恶性生物学行为及其分子机制。经大样本临床免疫组化检测分析发现,RUNX2是胃癌患者预后的一个极为重要的提示因子。与此同时,一系列的体外实验和原位移植瘤动物模型的数据证实,RUNX2是维持胃癌细胞移植瘤成瘤及侵袭转移等恶性行为的重要因子。因此,为了明确此作用内在的分子机制,我们进行了染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告实验,结果证实,转录因子RUNX2的转录激活位点落在CXCR4的启动子区上。CXCR4是RUNX2下游极为重要的靶基因,在胃癌中,RUNX2主要通过激活CXCR4的转录和表达,发挥促进胃癌细胞侵袭与转移的作用。接着,我们通过采用慢病毒干扰下调CXCR4或添加AMD3100处理的方法,在RUNX2高表达的情况下抑制CXCR4信号通路的活化。由此,我们通过体内外的实验证实,抑制CXCR4信号通路的活性可逆转由RUNX2所介导促侵袭转移的作用。因此,RUNX2可作为一个有价值的临床肿瘤诊疗因子,可预示患者的预后,同时RUNX2/CXCR4通路的揭示为我们提供了第一手实验室证据,是今后针对该通路进行的靶向药物研发的重要依据。主要方法,研究结果和结论如下:1.RUNX2在胃癌干细胞和胃癌细胞中的表达。(1)通过比较成球状态胃癌细胞和单层培养的胃癌细胞的DNA表达谱芯片结果后发现,RUNX2在成球状态胃癌细胞中显着高表达50余倍。通过无血清成球培养法,常被认为是富集胃癌干细胞(GCSCs)的主要方法。(2)基于以上基因芯片结果,我们采用GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)方法进行生物信息学分析,发现,以RUNX2为核心的一群基因簇群(共同代表着一类生物学功能)在胃癌干细胞中为显着活化的状态,在gsea中获高的富集得分。(3)通过免疫荧光染色观察后发现,runx2在成球培养的胃癌细胞中高表达。(4)与此同时,runx2在sgc7901,mgc803和xn0422中均被检测后发现,runx2在sgc7901细胞中低表达,在mgc803和xn0422细胞中显着高表达。2.胃癌中,runx2的表达与胃癌临床病理参数和患者的预后密切相关。(1)共305例有完全随访信息的胃癌病理标本的免疫组化发现,runx2与临床病理参数,如tnm分级、分化程度、淋巴转移和侵润深度正相关。runx2主要定位在胃癌细胞核内,仅少部分表达呈现胞核胞浆同时表达,且在不同分化程度的胃癌中,其表达具有统计学意义(p=0.006)。在81例高/中分化胃癌中,有49例(60.5%)的患者高表达runx2,这一比例在低分化胃癌病例中,runx2高表达比例占总群体的76.3%(171/224)。同时,runx2的高低表达与胃癌患者的tnm分期正相关(p=0.000)。在tnmi期和ii期的共124位胃癌患者中,有49位患者被检测出具有runx2的低表达(49/124,39.5%),75例患者则为runx2的高表达(75/124,60.5%)。然而,在181例tnmiii期和iv期的胃癌患者人群中,有145例患者表现出runx2高表达(145/181,80.1%)。此外,runx2的高表达还与淋巴结转移(p=0.000)和深部浸润(p=0.000)相关。在有淋巴结转移的胃癌患者中,大约79.3%的患者被检出runx2高表达(161/203)。而在发现浆膜浸润的胃癌患者中,超过79.1%的患者有runx2的高表达(178/225)。最后,runx2的表达与患者的年龄(p=0.352)和性别(p=0.480)无关。(2)比较胃癌癌组织和癌旁组织runx2的表达也发现,在癌组织中,runx2高表达的比例为72.1%(220/305),而癌旁组织该比例仅为21.6%(66/305)(p=0.00);(3)在305例胃癌病例中,有220例呈runx2高表达状态。高表达的胃癌患者群体总体预后不良,术后生存时间短。runx2低表达的患者预后好,有较长的术后生存期。以上研究证实,runx2表达水平提示胃癌患者的总体预后;(4)通过多因素分析的方法发现,runx2表达(hr3.454,95%ci1.408-8.230,p=0.007),与淋巴转移(hr1.539,95%ci1.089-2.591,p=0.045)和侵润深度(hr1.620,95%ci1.022-2.567,p=0.040)共同预示患者的预后情况,数据显示tnm分期(hr1.293,95%ci0.846-1.975,p=0.235)和分化程度(hr0.704,95%ci0.488-1.016,p=0.061)这一指标似无作用,分析原因可能为采集的样本例数较少。.3.runx2促进胃癌细胞移植瘤成瘤及体内外侵袭转移。(1)runx2参与胃癌移植瘤成瘤能力维持。通过将胃癌细胞系移植于裸鼠皮下,进行移植瘤成瘤实验证实,在稳定上调runx2表达的胃癌细胞株sgc7901-exrunx2中,其皮下移植瘤成瘤能力显着增强。移植瘤重量与大小的统计分析结果也证实了以上结论。(2)runx2促进胃癌细胞侵袭和转移。体外细胞划痕实验用于评估胃癌细胞的平面迁移运动能力。试验结果证实,在sgc7901中稳定上调runx2后,肿瘤细胞迁移的距离远大于对照组细胞(control)。而在mgc803和原代细胞xn0422中稳定敲低runx2的表达后,细胞迁移距离缩短,提示迁移能力受损。侵袭实验也证实,runx2的表达与细胞体外侵袭能力正相关。同时,汇总综合国内外文献的方法,基于胃癌发生发展的规律,改良了胃癌原位移植瘤的裸鼠模型,并通过该动物模型证实,runx2上调后,胃癌细胞在胃部的局部侵袭能力显着增强,可向邻近肝脏转移。稳定敲低runx2后,胃癌细胞的局部侵袭与肝脏转移能力显着受损。因此,runx2在体内外均促胃癌细胞侵袭与转移。4.转录因子runx2直接转录激活cxcr4基因。(1)通过采用转录因子生物信息学分析预测对与侵袭转移相关的基因进行评分后发现,cxcr4的得分最高(11.462)。通过real-timepcr在mgc803和原代细胞xn0422中对与肿瘤侵袭转移密切相关的基因进行筛选后发现,cxcr4差异倍数最高,且是两种细胞中均降低的分子。肿瘤侵袭转移相关基因包括,mmp家族成员,趋化因子受体cxcr4以及emt现象相关基因,其中,mmps在诸多肿瘤,如骨肉瘤,乳腺癌和前列腺癌中被报道是runx2的下游靶基因。(2)通过染色质免疫共沉淀实验发现,在cxcr4启动子区上存在一段277碱基的片段,高度疑似runx2的转录结合位点。(3)基于生物信息学预测的结果所提示的15bp的片段,我们设计了突变型的荧光素酶报告载体。荧光素酶报告试验及后续的凝胶电泳迁移率试验证实,这15个碱基的片段,正是转录因子runx2在cxcr4基因启动子区结合的位点。(4)与此同时,我们还对之前ch-ip试验所明确的277个碱基片段进行50个碱基的递增分段截短构建相应的荧光素酶报告载体,后续的荧光素酶报告试验证实第一个被截短的50个碱基内存在runx2的结合位点。而这一结论,与先前的试验结果相一致。(5)最后,wb检测发现,cxcr4的表达与runx2水平的正相关关系。5.cxcr4是runx2调控胃癌侵袭转移的重要的下游因子。(1)在runx2上调的同时,我们通过稳定敲低cxcr4或用cxcr4信号通路特异性抑制剂amd3100的方法抑制cxcr4信号通路活化,趋化实验证实胃癌细胞趋化迁移能力显着受损。(2)细胞侵袭试验证实,细胞侵袭能力受cxcr4信号通路抑制而受损。(3)抑制cxcr4信号通路后,在裸鼠胃癌原位移植瘤模型中的结果更具有说服力,胃癌细胞的局部侵袭能力受显着抑制,同时肝脏转移能力显着受损。以上数据证实,cxcr4作为runx2下游一个极为重要的转录因子发挥维持胃癌细胞侵袭转移的作用。总之,通过大样本临床组化检测证实,RUNX2与多种临床病理参数密切相关,是胃癌患者的重要的预示因子。体内外实验证实,RUNX2通过直接转录激活CXCR4进而促进胃癌细胞侵袭转移的发生。通过抑制CXCR4信号通路活性可显着降低胃癌细胞侵袭转移,显着延长小鼠的生存时间。以上结果表明,RUNX2可作为临床肿瘤诊疗的提示因子,为今后靶向RUNX2/CXCR4通路的药物研发提供有价值的试验数据和可行性依据。
李文仿[5]2016年在《MiR-30a-5p靶向调控肝癌metaherin蛋白表达的实验研究》文中提出肝细胞肝癌(hepataocellular carcinoma,HCC)在我国是很常见的一种恶性肿瘤,具有发病率较高,侵袭性极强,进展及其迅速,预后极差等临床特点,对患者生命造成严重的威胁。生长较为迅速,早期就容易出现淋巴管、血管及远处脏器转移等恶性临床病理特点,与肝癌患者预后较差有关。探索肝癌发生、发展的复杂的具体生物学机制,并系统阐明肝癌发生和进展的分子生物学变化,可为肝癌的诊治提供新的重要途径。MTDH(metaherin),也称人异粘蛋白,编码基因位于人体8号染色体长臂22区(8qq22),编码蛋白质的分子量约64 kda大小。2004年被报道在小鼠肿瘤模型中与乳腺癌细胞发生早期肺转移有关。目前研究发现人体一些癌组织中MTDH表达异常的增高,与肿瘤恶性的病理特征及不良预后均有一定的关系。癌蛋白表达上调机制比较复杂,很多因素均可涉及调控癌蛋白表达。本部分研究中我们分析比较了MTDH在肝、乳腺及甲状腺肿瘤及相应良性组织中表达情况。目前MTDH在肝癌、乳腺癌中表达与患者临床病理特征关系及预后已经见报道,而MTDH表达情况与甲状腺癌临床病理特征及预后未见相关研究。为探讨MTDH作为肿瘤分子靶向治疗的普遍性,同时本文作者有多年从事甲状腺外科工作经验,本部分我们分析了甲状腺癌组织中MTDH表达情况,并分析甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)患者MTDH表达与临床病理特征及预后关系,探讨MTDH作为恶性肿瘤分子靶向治疗靶点的普遍性。Micro RNA(miRNA)是一类非编码单链小分子的RNA,碱基大小约为19-25bp,科学家已经发现在哺乳动物细胞中存在成百上千的miRNA,这些miRNA参与了机体复杂的生物学活动过程,并且miRNA表达具有一定的组织特异性(tissue specific)及器官发展时序特异性(developmental stage specific manner)等特点。通过与m RNA的3′-UTR碱基部分或完全结合,miRNA在调节机体基因表达中发挥重要生物学作用。目前研究已经发现肿瘤组织与相应的正常组织miRNA表达谱有很大差异,部分miRNA表达上调,表达上调的miRNA可能发挥促进肿瘤进展的癌基因的作用,而表达下调的miRNA则可能具有抑制肿瘤进展的抑癌作用。MiRNA-30家族成员在肿瘤中一般表达下调,而miRNA-30家族成员在肝癌中的具体作用机制研究较少,其中,家族成员之一miR-30a-5p在其他肿瘤中常见报道,而肝癌中研究有限。本研究挑选miR-30a-5p为研究对象,检测其在肝癌组织中与癌旁组织中的表达差异,检测其对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721增殖、凋亡、迁移和侵袭转移能力的影响,及对HepG2肝癌细胞裸鼠皮下肿瘤组织成瘤影响。通过生物学信息预测发现MTDH是miR-30a-5p靶点,并分析miR-30a-5p与肝癌组织中MTDH表达相关性。肿瘤细胞不断增殖并明显的抗凋亡是其发生恶性进展的重要原因,而越来越多的研究发现PTEN/AKT参与调控肿瘤细胞抗凋亡,而且在调控肿瘤细胞失巢凋亡中同样发挥一定作用。PTEN/AKT信号通路也被报道与肿瘤细胞的迁移与侵袭有关,AKT可通过调控细胞迁移相关分子Rac1、cdc42和Rho等的表达,使肿瘤细胞骨架发生一定的重排,促进细胞发生迁移及转移。我们研究发现miR-30a-5p可能通过靶向调控MTDH蛋白表达,进而调控PTEN/AKT通路,参与发挥抑制肝癌细胞增殖并促进肿瘤细胞发生凋亡的作用。而miR-30a-5p对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721迁移和侵袭的抑制作用,也可能通过靶向调控MTDH蛋白表达,进而调控PTEN/AKT信号通路来实现。第一章Metaherin蛋白在肝癌、乳腺癌及甲状腺癌组织中表达及意义目的MTDH在肝癌、乳腺癌中表达与患者临床病理特征关系及预后已见报道。MTDH表达情况与甲状腺癌临床病理特征及预后未见研究。为探讨MTDH作为肿瘤分子靶向治疗的普遍性,本部分我们分析甲状腺乳头状癌(PTC)患者MTDH表达与临床病理特征及预后关系,探讨MTDH作为恶性肿瘤分子靶向治疗靶点的普遍性。方法⑴采用免疫组化检测MTDH在肝癌、乳腺癌及甲状腺癌组织表达情况,并与良性组织中表达作比较;⑵分析PTC组织中MTDH表达与临床病理指标关系;⑶Kaplan–Meier比较PTC患者MTDH高表达与低表达组DSS,Cox比例风险模型分析PTC组织中MTDH表达的预后意义。结果⑴肝癌旁组织中MTDH表达阳性率为20%(2/10),肝癌组织中MTDH阳性表达率为66.67%(14/21)。⑵在乳腺增生组织中MTDH表达阳性率为20%(2/10),在乳腺癌中表达阳性率为72.7%(13/18)。⑶MTDH在结节性甲状腺肿及甲状腺腺瘤组织中表达阳性率均为10%(1/10),PTC中MTDH阳性表达率为37.2%(58/156),未分化癌为50%(3/6)。⑷MTDH表达与PTC患者肿瘤大小((p=0.030))、淋巴结转移(P=0.041)、远处转移密切相关(P=0.028),但和患者年龄、性别、包膜浸润情况、肿瘤是否多发及肿瘤分期无关,MTDH高表达与PTC患者较差的生存率有关。结论MTDH在肝癌、乳腺癌及甲状腺癌组织中表达增高,高表达MTDH与恶性肿瘤患者不良病理特征及较差的预后有关,可能为肿瘤分子靶向治疗提供重要的靶点。第二章MiR-30a-5p调控肝癌MTDH蛋白表达的分子机制研究目的探讨miR-30a-5p在肝癌组织中与癌旁组织中的表达差异,生物信息学预测miR-30a-5p的靶点,并分析miR-30a-5p与肝癌组织中MTDH表达相关性。方法⑴采用RT-q PCR检测miR-30a-5p在肝癌细胞中与相应的正常肝细胞,肝癌组织及相应的癌旁组织中的表达差异;⑵生物学信息技术预测miR-30a-5p的靶基因,Western blot和Luciferase assay进行初步验证;⑶免疫组化检测肝癌组织中MTDH表达,采用相关方法分析肝癌组织中MTDH免疫组化评分分数与RT-q PCR检测的miR-30a-5p相对表达的关系。结果⑴与相应的癌旁组织比较,miR-30a-5p在肝癌表达下调,肝癌细胞中miR-30a-5p表达也较正常肝细胞LO2表达降低;⑵生物信息学技术预测MTDH可能是miR-30a-5p的靶基因,Western blot证实miR-30a-5p可抑制MTDH蛋白表达,Luciferase assay验证MTDH可能是miR-30a-5p的靶基因;⑶相关分析肝癌组织中MTDH表达与miR-30a-5p呈负相关。结论MiR-30a-5p在肝癌组织中表达降低,miR-30a-5p可靶向抑制肝癌组织中MTDH癌蛋白表达。在肝癌组织中miR-30a-5p和MTDH存在负相关,表明miR-30a-5p可通过靶向调控MTDH的m RNA的3′-UTR,调控MTDH蛋白表达。第叁章MiR-30a-5p调控MTDH/PTEN/AKT通路对肝癌细胞生物学影响的实验研究目的MiR-30家族成员在肝癌中的具体作用机制研究较少,本部分挑选miR-30a-5p为研究对象,检测其对肝癌细胞生物学影响,并探讨可能机制。方法⑴采用Lipofection2000转染技术过表达肝癌细胞HepG2和SMMC-7721内miR-30a-5p,CCK-8、克隆形成实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡;⑵划痕实验和Transwell侵袭小室实验分别观察miR-30a-5p过表达后对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721的迁移和侵袭能力的影响。⑶采用si RNA技术,沉默肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中MTDH蛋白,观察对HepG2和SMMC-7721细胞增殖、克隆形成、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。⑷Western blot检测MTDH下游PTEN蛋白,探索miR-30a-5p对PTEN/AKT信号通路调控作用。结果⑴通过转染miR-30a-5p mimics入肝癌细胞株HepG2、SMCC-7721细胞,CCK-8实验发现miR-30a-5p过表达后可以抑制HepG2、SMCC-7721细胞的增殖能力(P<0.05),抑制克隆形成(P<0.05),流式细胞术显示miR-30a-5p过表达促进了HepG2、SMCC-7721细胞凋亡(P<0.05);⑵划痕实验表明miR-30a-5p过表达可抑制肝癌细胞迁移,Transwell侵袭实验表明miR-30a-5p过表达可明显抑制HepG2、SMCC-7721细胞的体外侵袭能力(P<0.05);⑶通过si RNA技术沉默肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中MTDH蛋白,结果明显抑制HepG2和SMMC-7721细胞增殖(P<0.05)、克隆形成(P<0.05),促进肿瘤细胞凋亡(P<0.05),细胞迁移和侵袭也受到抑制(P<0.05)。⑷Western blot结果表明miR-30a-5p可调控PTEN/AKT通路,过表达miR-30a-5p可抑制MTDH蛋白表达,从而促进PTEN蛋白表达,抑制AKT磷酸化激活。结论MiR-30a-5p可通过调控MTDH/PTEN/AKT通路,从而发挥抑制肝癌细胞HepG2和SMMC-7721增殖、克隆形成,并促进肿瘤细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞迁移和侵袭。第四章MiR-30a-5p抑制肝癌细胞裸鼠成瘤的实验研究目的在本部分中我们继续挑选miR-30a-5p为研究对象,检测其对肝癌HepG2细胞裸鼠皮下成瘤的影响,观察miR-30a-5p对动物实验中肝癌细胞增殖是否同样具有抑制作用。方法⑴采用裸鼠皮下成瘤实验,观察过表达miR-30a-5p对肝癌细胞HepG2裸鼠皮下成瘤的影响;⑵免疫组化检测miR-30a-5p转染HepG2裸鼠肿瘤细胞MTDH表达;⑶免疫组化检测miR-30a-5p转染HepG2裸鼠肿瘤细胞核增殖抗原PCNA表达和核凋亡蛋白TUNEL蛋白表达;⑷Western blot检测miR-30a-5p转染HepG2裸鼠肿瘤细胞MTDH和PCNA蛋白表达,p-AKT蛋白表达。结果⑴通过裸鼠皮下成瘤实验,观察到肝癌细胞HepG2在转染miR-30a-5p后裸鼠皮下肿瘤的生长明显减缓,与对照组相比较miR-30a-5p转染组肿瘤的大小、质量均减少,差异有统计学意义(P<0.05);⑵MiR-30a-5p转染HepG2可明显抑制裸鼠皮下肿瘤组织MTDH表达;⑶MiR-30a-5p转染HepG2裸鼠皮下肿瘤组织核增殖抗原PCNA表达减低,而核凋亡蛋白TUNEL表达明显增加;⑷MiR-30a-5p可抑制裸鼠肿瘤组织AKT激活,抑制p-AKT形成。结论:miR-30a-5p可通过调控MTDH蛋白表达,抑制肝癌肿瘤细胞裸鼠肿瘤生长。
邱开阳, 张国玺, 邹晓峰[6]2019年在《UBA2与肿瘤关系的研究进展》文中研究表明UBA2是小泛素相关修饰物(Small ubiquitin related modifier,SUMO)激活酶的关键组分,是介导SUMO修饰的第一步。研究表明,UBA2在多种肿瘤中过表达,与肿瘤的发生、发展及预后密切相关,但其作用机制目前尚不清楚。本文就UBA2的生物特性及其与肿瘤的关系作一综述。
参考文献：
[1]. Notch/Dll4和VEGF信号通路在急性髓性白血病血管新生中的交互作用及机制研究[D]. 章静茹. 山东大学. 2013
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[3]. 肿瘤生物标志物与肿瘤转移[C]. 佚名. 第叁届中国肿瘤学术大会论文集. 2004
[4]. 转录因子RUNX2在胃癌侵袭转移中的作用及其分子机制探究[D]. 郭政军. 第叁军医大学. 2015
[5]. MiR-30a-5p靶向调控肝癌metaherin蛋白表达的实验研究[D]. 李文仿. 重庆医科大学. 2016
[6]. UBA2与肿瘤关系的研究进展[J]. 邱开阳, 张国玺, 邹晓峰. 赣南医学院学报. 2019
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