张卫国[1]2001年在《TM4SF表达与肝细胞癌侵袭转移相关性的研究》文中认为【引言】原发性肝癌术后复发和死亡的主要原因是由于肿瘤的侵袭与转移。目 前，该领域的研究仍是肝癌基础研究的重点和热点，然而迄今为止对于肝癌侵 袭转移机制尚知之甚少。TM4SF（transmembrane 4 superfamily）是一个近年 被命名结构独特的糖蛋白家族。已有18种以上的糖蛋白被确认为TM4SF成员， 如 MRPI／CD9、CD37、CD53、ME491／CD63和 KAI1／CD82均为该家族成员。 TM4SF的共同特征是所有成员的蛋白结构中均存在四个跨膜功能区和一个大的 细胞外功能区，后者含有N－糖基化位点。尽管TM4SF的确切生物学功能尚不清 楚，但已有大量证据显示TM4SF成员对细胞增生、运动及粘附有重要影响。据 报道，TM4SF 的叁个成员—KAI1／CD82、MRP1／CDg和ME491／CD63 与前列腺 癌、乳腺癌和黑色素瘤等恶性肿瘤侵袭转移抑制关系密切，但有关 KAI1／CD82、MRPI／CD9和ME491／CD63在肝细胞癌中表达及其意义的研究报道罕 见。 【目的】研究肝细胞癌中 KAl1／CD82、MRP1／CD9和ME491／CD63表达与肿瘤侵 袭转移的关系。 【方法】构建肝癌组织芯片，应用免疫组织化学方法研究167例肝细胞癌及配 对癌旁肝、29例癌栓、4例肝内转移癌、17例肝外转移癌和6例正常肝组织中 KAI1／CD82、MRP1／CD9和ME491／CD63蛋白的表达；建立KAl1／CD82、MRP1／CD9 和 ME491／CD63 mRNA在肝细胞癌中表达的复合 RT－PCR半定量检测方法，检测 18例肝细胞癌及配对癌旁肝组织中KAI1／CD82、MRP1／CD9和ME491／CD63 mRNA 的表达水平；探讨KAI1／CD82、MRP1／CD9和ME491／CD63表达与肝细胞癌侵袭 转移及其临床病理学特征的关系。 【结果】 1、肝细胞癌癌旁肝组织中 KAI1／CD82、MRP1／CD9及 ME491／CD63蛋白表达显着 高于肿瘤组织（分别为100％和61．29％，99．35％和26．97％，78．85％和 55．77％；P＜0．01）。 2、KAI1／CD82蛋白在肝癌癌栓中表达低于原发癌（分别为31．82％和61．29％，P ＜0．05）。4例原发癌及其肝内转移癌均呈 KAI1／CD82蛋白阴性。KAI1／CD82 蛋白表达与癌栓形成（P＜0．01）、肝内转移（P＜0．01）及肝外转移（P ＝0．038）呈负相关，并与肿瘤包膜（P＜0．05）、肿瘤大小（＜5cm vs ≥5cm，P＜0．01）、病理分级（P＜0．01）、肿瘤分型（P＜0．01）及血清 AFP 学位论文TM4SF表达与肝细胞癌侵袭转移相关性的研究 中文摘要 癌组织中 I｛AI九D82 InRNA表达水平显着高于伴有癌栓形成的肿瘤组织（表 达相对值分别为 0997L0．384和0．659f0．217，尸＜0．05）。 3、MRP人 蛋白表达在伴有癌栓形成的肝细胞癌中低于无癌栓形成的肿瘤（分 别为21．82％和4队48％，尸刃．05）。同时y n／C09蛋白表达与肿瘤大小 （510cm vs＞10cm，尸＜0．01）、病理分级（尸二0．043）及血清 AFP水平 （叁20pg／L VS＞20pg／L，尸二0．029）呈显着负相关。不伴有癌栓形成的肝细胞 癌中 MRP几 InRNA表达水平显着高于伴有癌栓形成的肿瘤（表达相对值分 别为 0．855f0．201和 0．452f0．250，尸＜0．of）。不伴有肝内转移肝细胞癌中 MRPI九 mRNA表达水平显着高于伴有肝内转移的肿瘤（表达相对值分别为 0．665L0．291和 0．31土0．128，尸＜0．05）。 4、ME49几D63蛋白表达在癌栓及肝外转移癌组织中均低于原发癌（分别为 29．17％和55．77％，尸＜o．05；17．65％和55．77％，尸＜0．m）。不伴有肝内转移 的肝细胞癌 ME49／CD63 mRNA表达水平显着高于伴有肝内转移肿瘤组织（表 达相对值分别为1．8％LO．741和0．965f0．158，尸＝0．m）。 ［结论］TM4SF糖蛋白家族中 I｛All／CD82、MRPI／CDg及 ME491／CD63表达下调与 肝细胞癌侵袭转移潜能增加及肿瘤的恶性进展明显相关。肝癌组织中TM4SF成员 蛋白的表达及其基因转录水平的检测，将有助于准确评估肝细胞癌的侵袭转移能 力和判断患者预后。组织芯片及复合RT－PCR半定量技术是高效、快速、敏感的
吴春利, 耿小平, 朱立新[2]2008年在《KAI1/CD82与肝细胞癌转移相关性的研究进展》文中进行了进一步梳理肝细胞癌是恶性程度最高的消化道肿瘤之一,虽然已有多种治疗方法和手段,但其高复发和转移性使患者预后差,生存率低。如何及早预测、诊断及治疗肝细胞癌,成为研究的重点和难点。分子生物学的迅速发展和检测技术的进步,为肿瘤分子生物学的研究提供了有利的条件。KAI1/CD82基因蛋白与多种恶性肿瘤的复发和转移相关。本文综述了KAI1/CD82的特点及其与肝细胞癌转移相关性的研究进展。
柯爱武[3]2008年在《四跨膜蛋白CD151与肝细胞癌侵袭转移及其对HGF/c-Met信号转导的影响》文中研究表明肝癌是国内常见的恶性肿瘤之一,其侵袭转移与复发是患者死亡的主要原因之一。因此,探索肝癌侵袭转移与复发的发生机制,寻求有效的抗肝癌转移与复发治疗措施,对改善肝癌患者的预后具有重要意义。在肝癌侵袭转移与复发中,HGF/c-Met信号系统的“对话”有着重要地位,这一作用在肝癌切除术后,残留肝脏再生,致HGF/c-Met系统处于活跃的状态,从而促进残留肝癌细胞增殖使其与肝癌术后转移、复发的关系也表现尤为突出。HGF/c-Met信号系统在肝癌侵袭转移与复发中的重要地位,也为肝癌侵袭转移与复发的治疗提供了新的靶点。当前,已发现多种HGF/c-Met信号的抑制剂,但所发现的HGF/c-Met抑制剂都有不同程度局限,如HGF竞争性拮抗剂NK4,c-Met受体的选择性抑制剂PHA-665752只能在一定程度上抑制HGF/c-Met信号,究其原因是HGF/c-Met与其它信号间的交互作用,如HGF/c-Met信号与整合素信号间的交互作用。有研究表明四跨膜蛋白CD151可与c-Met形成一功能复合物,并在HGF/c-Met信号转导以及其与其它信号间的交互作用中扮演重要的角色,可能为抑制HGF/c-Met信号的全新靶点。目前,国内外还没有CD151在肝癌中研究的报道,同时,CD151在HGF/c-Met信号中的作用也缺乏系统研究。本实验首先在肝癌、相应癌旁、正常肝组织以及不同转移潜能肝癌细胞系中检测CD151表达差异;研究其与肝癌发生、发展以及预后的相关性;通过转染与干扰调节CD151表达后,探讨CD151与肝癌细胞侵袭与转移的关系;最后对CD151在HGF/c-Met信号转导中的具体作用进行研究。第一部分四跨膜蛋白CD151在肝癌中的过表达目的:检测肝癌、癌旁和正常肝组织中四跨膜蛋白CD151的mRNA与蛋白表达,分析其与肝癌发生的关系。方法:应用普通RT-PCR,荧光定量PCR与免疫组织化学技术检测CD151在肝癌、相应癌旁、正常肝组织中的表达,并比较叁组间CD151的表达差异。结果:CD151在肝癌、相应癌旁和正常肝组织中均有表达,相对表达量分别为3.6±0.9(0.5-8.2),2.7±0.1(0.0-6.5)与1.8±0.8(0.0-3.1),肝癌与相应癌旁组织间差异明显(p＜0.05),CD151在癌旁与正常肝组织的表达也存在差异(p＜0.05)。免疫组织化学显示CD151主要分布于细胞膜,其在肝癌组织中的表达明显高于后两者(p＜0.05)。结论:四跨膜蛋白CD151在肝癌发生中可能有重要作用。第二部分CD151/或c-Met与肝癌临床病理特征及预后的关系目的:研究CD151和c-Met在原发性肝癌中表达,探讨CD151和c-Met与原发性肝癌的关系及临床生物学意义。方法:应用荧光定量PCR检测120例肝癌组织中CD151与c-Met mRNA的表达,组织芯片检测520例肝癌组织中CD151与c-Met蛋白的表达,SSPS11.5统计分析两者与肝癌临床病理特征及预后的关系。结果:CD151蛋白的过表达与肝癌患者的无包膜、高分期与分级、肿瘤细胞低分化、有门脉癌栓及多卫星灶等临床病理因素有关(p＜0.05);而c-Met与有门脉癌栓、肿瘤直径＞0.5cm、多卫星灶、高分期与分级与肿瘤细胞低分化(p＜0.05)等相关。CD151与c-Met在肝癌中表达呈中度相关,有显着性意义(r=0.051,p=0.013),CD151~+组的3、5、7年生存率明显低于CD151组(p＜0.01),CD151~+/c-Met~+组的3、5、7年生存率明显低于CD121~-/c-Met~+及CD151~-/c-Met~-组(p＜0.01)。结论:四跨膜蛋白CD151与原发性肝癌的侵袭、转移及不良预后相关;CD151对c-Met生物学功能可能存在影响。第叁部分CD151表达与肝癌细胞侵袭与转移的关系目的:研究四跨膜蛋白CD151与肝细胞癌细胞侵袭与转移的关系。方法:荧光定量PCR,western blot及流式细胞仪检测不同转移潜能肝癌细胞中CD151的表达差异;转染pcDNA3-CD151cDNA与pGPU6/GFP/Neo-CD151,筛选出稳定细胞株,经western blot,流式细胞仪验证CD151表达改变后,明胶酶谱研究基质金属蛋白酶分泌变化;MTT检测CD151表达改变后,细胞增殖能力变化;transwell研究细胞侵袭能力改变。细胞接种于裸鼠体内,研究CD151表达改变后,细胞成瘤与肺转移能力的改变。结果:转染pcDNA3-CD151cDNA与pGPU6/GFP/Neo-CD151于低转移能力的HepG2与高转移的HCCLM3肝癌细胞,筛选的稳定细胞株CD151表达改变明显;明胶酶谱研究显示CD151的表达与MMP9的分泌呈正相关,而对MMP2的影响较小。肝癌细胞增殖受CD151表达水平影响较小(p＞0.05):CD151高表达组细胞的移动与侵袭能力明显增强,肺转移灶明显增加,且以Ⅲ,Ⅳ期为主。结论:四跨膜蛋白CD151与肝癌的侵袭与转移正相关。第四部分CD151对HGF/c-Met信号转导的影响目的:研究CD151与c-Met在肝癌细胞中的关系及其对HGF/c-Met信号的影响。方法:免疫荧光与激光共聚焦研究两者在不同转移潜能肝癌细胞中的表达与相对分布;免疫共沉淀研究两者形成复合物情况。以HGF作用于CD151表达改变前后的细胞,western blot研究HGF/c-Met下游与肝癌转移相关的重要信号分子Akt、FAK、ERK1/2磷酸化差异,分析其在肝癌细胞中对HGF/c-Met信号的影响。结果:CD151与c-Met主要表达于肝癌细胞的细胞膜,分布一致;免疫共沉淀研究显示两者形成复合物。在HGF作用后,下游信号分子Akt与FAK在CD151表达不同的细胞,磷酸化差异明显(p＜0.05),而ERK1/2的磷酸化在两组间无差异(p＞0.05)。结论:四跨膜蛋白CD151与c-Met在肝癌细胞中形成复合物,其通过Akt与FAK对HGF/c-Met产生影响。
张卫国, 王一, 吴伟清, 冼志红, 关新元[4]2002年在《KAI1/CD82蛋白表达与肝细胞癌侵袭转移》文中研究说明目的 探讨KAI1/CD82蛋白表达与人肝细胞癌侵袭转移的关系。方法 构建肝癌组织芯片 ,收集肝细胞癌及癌旁肝组织 15 5例 ,癌栓 2 2例 ,肝内转移癌 4例 ,肝外转移癌 16例。正常对照肝组织 5例。应用免疫组织化学方法检测肝癌组织芯片中样本KAI1/CD82蛋白的表达。结果6 1% (95 /15 5 )肝细胞癌原发灶表达KAI1/CD82蛋白 ,仅有 32 % (7/2 2 )癌栓呈阳性表达 (P <0 0 5 )。不伴有肝外转移、肝内转移及癌栓形成肝细胞癌中KAI1/CD82蛋白表达率分别高于伴有肝外转移 (P =0 0 38)、肝内转移 (P <0 0 1)及癌栓形成者 (P <0 0 1)。KAI1/CD82蛋白在包膜完整与无包膜 (P <0 0 5 )、癌灶直径 <5cm与直径≥ 5cm(P <0 0 1)及血清AFP <4 0 0 μg/L与AFP≥ 4 0 0 μg/L (P =0 0 36 )肝细胞癌中表达率差异亦有显着意义。结论 肝细胞癌KAI1/CD82蛋白表达丧失可能与癌灶侵袭转移有关
彭威, 邱氟[5]2017年在《跨膜4超家族成员1在原发性肝细胞癌组织中的表达及其对患者预后的影响》文中认为目的:探讨跨膜4超家族成员1(TM4SF1)在原发性肝细胞癌(HCC)组织中的表达及其与HCC患者预后的关系。方法:用免疫组织化学方法检测TM4SF1在120例HCC组织和相应癌旁组织,以及30例非恶性肿瘤患者正常肝组织(正常对照组)中的表达,并分析其与HCC患者临床病理指标及预后的关系。结果:TM4SF1在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织及正常对照肝组织(P均<0.01)。TM4SF1在甲胎蛋白(AFP)高水平组、有淋巴结转移组、有门静脉癌栓(PVTT)组、临床TNM分期Ⅲ-Ⅳ期组、分化程度低-未分化组、术后转移组、复发组的表达分别高于AFP低水平组、无淋巴结转移组、无PVTT组、Ⅰ-Ⅱ期组、高-中分化组、术后无转移组、无复发组(P均<0.05)。TM4SF1高表达组的无瘤生存期和总生存期明显短于低表达组(P均<0.01)。TM4SF1高表达、PVTT、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期是无瘤生存期和总生存期的独立风险因素(P均<0.05)。结论:TM4SF1在HCC中高表达,并参与HCC发生、发展过程。TM4SF1的表达水平可能作为判断HCC预后的指标。
赵磊[6]2004年在《KIAA0008基因与肝细胞癌侵袭表型的关系及其机制研究》文中研究说明目的 KIAA0008基因是复旦大学肝癌研究所(以下简称“我所” )前一时期通过基因芯片技术发现的与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)侵袭转移潜能高度相关的候选基因之一,可能在HCC侵袭转移中起重要作用。本课题进一步验证此基因与HCC侵袭转移潜能的关系,并探讨其作用机制。 方法 用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测27例HCC手术标本中KIAA0008基因的表达水平,并采用更精确的荧光定量实时RT-PCR(Real-time RT-PCR)作定量分析;27例HCC中有23例伴有相邻无瘤肝组织标本,5例还伴有肝内转移灶标本;根据临床病理学指标,将27例HCC分为高、中、低侵袭性叁组,对不同侵袭性HCC之间KIAA0008基因的表达水平进行比较分析。为验证HCC临床标本中的检测结果,采用实时RT-PCR检测我所建立的遗传背景相同,而侵袭转移潜能逐级升高的叁株HCC细胞系(MHCC97L、MHCC97H及HCCLM3)中KIAA0008基因表达水平的差异。为进一步证实KIAA0008基因的表达与HCC侵袭性的关系,利用真核表达质粒载体pIRES2-EGFP构建包含KIAA0008基因全长序列的重组表达质粒载体,以阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000转染MHCC97L细胞系(其KIAA0008基础水平较低),以空质粒pIRES2-EGFP转染作为对照,采用实时RT-PCR检测重组质粒转染后KIAA0008基因表达水平的改变;通过细胞增殖实验,克隆形成实验以及体外Matrigel侵袭实验,研究重组质粒转染对MHCC97L细胞增殖与侵袭能力的影响。为探讨KIAA0008基因影响HCC侵袭性的可能机制,特别是其对细胞周期的影响,利用真核表达质粒载体pEGFP-C3构建包含KIAA0008基因全长序列的第二种重组表达质粒载体,以阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000转染HCCLM3细胞系,同时以空质粒pEGFP-C3转染作为对照,在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白EGFP-KIAA0008在细胞内的分布情况;通过不同的方法将HCCLM3细胞同步化于细胞周期的各个不同阶段后,以流式细胞仪检测同步化效果,并以实时RT-PCR检测KIAA0008基因在细胞周期的各期中的表达水平。 结果 HCC组织中KIAA0008基因的表达水平显着高于无瘤肝组织(1.05E-3 vs. 0.397E-3, 中位数, Z=-3.83, P<0.001);高侵袭性HCC显着高于低侵袭性HCC(1.29E-3 vs. 0.162E-3, 中位数,Z=-3.14,P=0.002)。在MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3叁株细胞系中,KIAA0008基因的表达水平随其侵袭与转移潜能的逐级提高也相应的逐步增高,其表达水平在MHCC97H细胞系中高于MHCC97L细胞系,但差异尚不具有统计学意义(P=0.324),在HCCLM3细胞系中显着高于MHCC97L与MHCC97H细胞系(P<0.001)。经重组表达质粒载体pIRES2-EGFP-KIAA0008转染后,MHCC97L细胞中KIAA0008基因的表达水平明显增高,可明显促进MHCC97L细胞的增殖能力(1.79±0.06 vs. 0.96±0.10,均数±标准<WP=6>差; P<0.001),克隆形成能力(14.4±3.97 vs. 8.6±2.40,均数±标准差;P=0.024)以及体外侵袭能力(18.8±5.31 vs. 11.8±3.34,均数±标准差;P=0.037)。激光共聚焦显微镜观察显示:在pEGFP-C3-KIAA0008质粒转染的HCCLM3细胞中,EGFP-KIAA0008融合蛋白集中分布于胞膜与胞核,特别是细胞核;而在对照组中,EGFP信号均匀的分布于整个细胞,包括胞膜、胞浆及胞核。KIAA0008基因的表达水平在G0期、G1期、G1/S期及S期中均维持于较低水平,而在G2/M期,其表达水平显着增高;KIAA0008基因的表达水平与被测细胞样本中G2/M期细胞群所占的比例数之间存在显着相关性(r=0.993; P=0.001)。 结论 KIAA0008基因的过表达与HCC的侵袭表型相关;在HCCLM3细胞系中,KIAA0008的基因表达产物分布于细胞核与细胞膜,且其集中高表达于细胞周期中的G2/M期,提示KIAA0008基因可能通过对细胞周期的调节作用影响HCC的侵袭性。该推论尚需进一步的研究证实,以阐明KIAA0008基因作用于HCC侵袭性的具体机制。
韦柳君[7]2017年在《广西扶绥县肝癌家系人群TSPAN8基因单核苷酸多态性与肝癌遗传易感性研究》文中研究表明目的:探讨TSPAN8基因rs1051334、rs2270587位点单核苷酸多态性与广西扶绥县肝癌高发区肝癌家系遗传易感性的关系。方法:采用病例-对照研究方法,收集广西扶绥县肝癌高发地区20个肝癌高发家系(共79例,其中肝癌患者20例及直系亲属59例)及10个正常对照家系(共40例)作为研究对象,运用飞行时间质谱分析技术(MALDI-TOF)检测TSPAN8基因rs1051334、rs2270587位点基因型。运用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。所有统计学分析结果采用双侧概率检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。根据Hardy-Weinberg遗传平衡定律检测各组人群基因型吻合度。使用χ~2检验计算各组人群等位基因型分布差异。并应用非条件Logistic回归模型分析该基因候选位点基因型多态性与肝癌家系遗传易感性的关系。结果:1.(1)肝癌高发家系组人群TSPAN8基因rs1051334位点携带TT、TG、GG3种基因型,其分布频率分别是55.7%、34.2%、10.1%;对照家系组人群TSPAN8基因rs1051334位点携带TT、TG、GG3种基因型,其分布频率分别是62.2%、35.1%、2.7%。两组各基因型实际值与期望值吻合度好(P>0.05)。(2)肝癌高发家系组人群TSPAN8基因rs2270587位点携带CC、CT、TT3种基因型,其分布频率分别是67.1%、31.6%、1.3%;对照家系组人群TSPAN8基因rs2270587位点携带CC、CT、TT3种基因型,其频率分别是50.0%、45.0%、5.0%。两组各基因型实际值与期望值吻合度好(P>0.05)。2.(1)肝癌高发家系患者组、肝癌高发家系非患者组及正常对照家系组人群TSPAN8基因rs1051334位点T等位基因频率分别为72.5%、72.9%和79.7%,G等位基因频率分别为27.5%、27.1%、20.3%。肝癌高发家系患者组与非患者组等位基因频率分布无显着差异(χ~2=0.002,P=0.963),肝癌高发家系患者组与正常对照家系组等位基因频率分布无显着差异(χ~2=0.771,P=0.380)。在肝癌高发家系非患者组人群中,携带GT基因型的个体发生HCC的风险是携带TT基因型个体的1.15倍(95%CI为0.32~4.13);携带GG基因型的个体发生HCC的风险是携带TT基因型个体的0.62倍(95%CI为0.08~4.87)。在正常对照家系组人群中,携带GT基因型的个体发生HCC的风险是携带TT基因型个体的2.82倍(95%CI为0.52~15.27),携带GG基因型的个体发生HCC的风险是携带TT基因型个体的3.61倍(95%CI为0.21~63.44),但差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)肝癌高发家系患者组、非患者组及正常对照家系组人群TSPAN8基因rs2270587位点C等位基因频率分别为90.0%、80.5%和72.5%,T等位基因频率分别为10.0%、19.5%、27.5%。肝癌高发家系患者组与非患者组等位基因频率分布无显着差异(χ~2=1.899,P=0.168),肝癌高发家系患者组与正常对照家系组等位基因频率分布有显着差异(χ~2=4.812,P=0.028),正常对照家系组人群携带T等位基因型的个体发生HCC的风险是携带C等位基因型个体的0.29倍(95%CI为0.09~0.92)。在肝癌家系非患者组人群中,携带CT基因型的个体发生HCC的风险是携带CC基因型个体的0.42倍(95%CI为0.11~1.66),但未见显着差异(P>0.05),携带TT基因型的个体发生肝癌的风险无法计算出来。在正常对照家系组人群中,携带CT基因型的个体发生HCC的风险是携带CC基因型个体的0.34倍(95%CI为0.07~1.59),但未见显着差异(P>0.05),携带TT基因型的个体发生肝癌的风险无法计算。结论:1.在广西扶绥县人群中,TSPAN8基因rs1051334位点、rs2270587位点各基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律;2.TSPAN8基因rs1051334位点单核苷酸多态性与广西扶绥县人群肝癌家系的遗传易感性无明显相关性;3.TSPAN8基因rs2270587位点单核苷酸多态性与广西扶绥县人群肝癌家系的遗传易感性有相关性,rs2270587位点T等位基因为广西扶绥县人群HCC发生的保护因素。
彭志红[8]2004年在《KAI1基因对MHCC97-H肝癌细胞侵袭转移的影响及机制》文中提出背景与目的:KAI1基因是近年新发现的肿瘤转移抑制基因。本课题试图探讨KAI1基因对肝癌MHCC97-H细胞侵袭、转移的影响,进而探索其机制,为肝癌后续的抗转移治疗研究奠定基础。方法:将已转染人类KAI1全长正、反义结构基因质粒的肝癌细胞分为4组,分别为转染KAI1正义基因的肝癌细胞MHCC97-H-S组,转染KAI1反义基因的肝癌细胞MHCC97-H-AS组,转染pCI-neo空载体的肝癌细胞MHCC97-H-pCI组,及原亲本细胞MHCC97-H组,观察基因转染后各组细胞粘弹性、粘附力、皮下成瘤性、原位肝接种后成瘤和转移,以及肿瘤组织细胞外基质及粘附分子表达情况的变化。结果:(1)细胞粘弹性:在475N/m2的阶跃负压作用下,肝癌细胞在微管内的变形经历了初始快速响应和其后稳定增加的时间过程。经拟合计算测得MHCC97-H亲本细胞、转染正义KAI1基因、反义KAI1基因以及空载体后该肝癌细胞的弹性系数K1、K2及粘性系数μ。MHCC97-H-AS细胞的弹性系数K1、K2和粘性系数μ较对照组MHCC97-H亲本细胞显着降低(P < 0.01),MHCC97-H-S细胞粘弹性系数K1、K2和μ均较对照组MHCC97-H亲本细胞显着增加(P < 0.05),而MHCC97-H-pCI细胞与MHCC97-H亲本细胞比较则无明显变化(P >0.1)。(2)细胞粘附力:在FN裱衬表面,利用微管吸吮系统测得的各组肝癌细胞的粘附力分别为MHCC97-H-S组678.4±101.8,MHCC97-H-AS组1083.6±113.8,MHCC97-H-pCI组853.0±105.4及MHCC97-H亲本细胞组834.6±130.5(单位为10-10N,细胞数为25)。与MHCC97-H亲本细胞组比较,MHCC97-H-S组细胞对FN的粘附力显着下降(p<0.01),MHCC97-H-AS组细胞对FN的粘附力显着增加(p<0.01),而MHCC97-H-pCI组细胞对FN的粘附力无明显变化(p>0.1)。(3)皮下成瘤性:在皮下注射肿瘤细胞悬液后各组均在2wk左右出现肿瘤组织块,生长速度各组基本一致。从生长方式看,反义组明显呈浸润性,皮下肿瘤表现为与深部组织融合生长,有的甚至侵犯脊柱。(4)原位肝接种肿瘤:接种7wk后裸鼠衰竭,处死裸鼠,打开腹腔,可见肝脏部位白色肿瘤组织块,表面凹凸不平结节状,有丰富的肿瘤血管。肿瘤侵犯大部分肝脏,只存留少量肝组织,有的可见肿瘤组织与腹膜、<WP=9>腹壁、肠系膜等组织粘连,有一只可见膈肌上白色癌灶。分离肿瘤组织时见肿瘤组织呈鱼肉状,质脆,易出血,中间可见坏死。各组肿瘤组织侵犯周围脏器、组织,巨检见双肺呈暗红色,未见明显转移结节。镜下观察转移灶数目,反义组转移灶数目为27.7±3.8个/只,正义组转移灶数目为16.1±2.2个/只,载体组转移灶数目为21.6±3.6个/只,MHCC97-H亲本细胞组为19.3±2.3个/只。其中,与MHCC97-H亲本细胞组比较,反义组转移灶数目明显增加,正义组转移灶数目明显减少,差异均有显着性(p<0.01),而载体组转移灶数目无明显变化(p>0.1)。(5)转移瘤定性观察:肺转移灶的肿瘤细胞质有AFP黄色颗粒沉着,证明这些细胞团块确是肝癌转移至肺形成的转移灶。(6)肿瘤组织细胞外基质及粘附分子的表达情况:a、FN:在正义组肝窦壁、基质的FN阳性染色多呈连续或断续不完整的线状分布;反义组肝癌中,肝窦壁及细胞表面FN几乎消失,癌巢周边及基质中少许FN阳性染色,少数癌细胞胞浆中呈阳性反应;载体组和亲本细胞组中,FN呈线状断续阳性包绕癌巢;b、IV型胶原和LN:在反义组,IV型胶原和LN分布主要为中断的索周型、血管型或阴性,而在正义组ECM分布主要呈连续的索周型,载体组和亲本细胞组则主要呈中断的索周型;c、ICAM-1:在反义组肝癌组织中,癌细胞多为阳性表达,阳性率67%,呈浆膜型或定位于胞浆;正义组肝癌组织中,癌细胞多为弱表达或阴性,部分癌组织癌旁阳性;亲本细胞组和载体组可见癌细胞呈阳性表达,阳性率42%,与反义组比较,差异具有显着性(p<0.01)。结论:通过裸鼠体内、体外细胞生物力学及免疫病理学系列研究,结果表明:(1) KAI1基因对肝癌MHCC97-H细胞的成瘤性和肿瘤的生长无明显影响。(2) 正义KAI1基因可抑制肝癌MHCC97-H的侵袭和转移,反义KAI1基因的作用则相反。KAI1抑制肝癌侵袭和转移的机制可能与下列途径有关:① 增加肝癌细胞的粘弹性,从而增加细胞的刚性,降低细胞的变形能力;② 降低肝癌细胞对细胞外基质FN的粘附力,从而抑制转移的初始步骤;③ 增加细胞之间的聚集,从而减少肿瘤细胞从原发灶的脱落;④ 上调ECM的主要成分LN、IV型胶原及FN的表达,从而限制癌细胞的活动;⑤ 下调肝癌细胞表面ICAM-1的表达,从而减少异源细胞间的相互粘附。
李楠[9]2010年在《泛素连接酶（E3）gp78的RNA干扰对MHCC97-H细胞生物学行为及KAI1表达的影响》文中研究说明研究背景及目的肝癌是导致人类死亡率第二高的恶性肿瘤,尤其是其肝外转移,更是临床肝癌治疗的难点。肝癌细胞通常早期经过血道转移至邻近或远处的组织器官,因此肝癌细胞具有很强的转移侵袭能力,而这种转移侵袭行为的发生机制则十分复杂。越来越多的研究认为,肿瘤细胞迁移和侵袭能力的增强,是肿瘤发生转移的重要机制之一。先前在动物细胞株进行的研究已经表明,gp78,作为一种与内质网相关性蛋白降解途径(ERAD)相关的泛素连接酶(E3),其过表达诱导了肿瘤细胞表型的变化,而这种变化却增强了细胞的存活能力和增殖能力,细胞的侵袭潜力和活动能力也有所增强。最近有研究报道,肿瘤组织中gp78 mRNA水平表达较邻近正常组织有显着增高,并且有研究表明,肿瘤转移抑制因子KAI1是gp78的特异性作用底物,gp78的E3酶活性可以通过对骨肉瘤细胞中肿瘤转移抑制因子KAI1的降解来促进骨肉瘤的转移。但是在肝细胞癌的转移侵袭过程当中,gp78所发挥的作用现在还不太明了,尤其是在体外gp78对肝癌细胞的生物学特性的影响仍不清楚。在本研究中,我们假设肝癌细胞中gp78表达减少可能导致KAI1表达水平的增高,从而使肿瘤细胞增殖、形成克隆以及迁移和侵袭能力的下降,进而推断可能减弱肝癌的转移能力。为了验证这个假设,我们运用RNAi技术沉默肝癌细胞MHCC97-H中gp78的表达,检测gp78沉默前后肝癌细胞增殖、迁移及侵袭等生物学活性的变化,同时也检测了gp78沉默前后肝癌细胞中KAI1的表达。研究方法1、根据gp78基因序列( GeneBank NM_001144,通过www.genscript.com网站在线siRNA设计工具,设计叁对siRNA,定向插入到质粒pRNAT-U6.1/Neo,抽提质粒并测序鉴定。构建好的叁种gp78干扰载体分别命名为pRNAi-1, pRNAi-2与pRNAi-3。将细胞接种于6孔板,待细胞融合率达80%~90%时,用脂质体介导的基因转染方法将构建好的gp78干扰载体与空载体转入MHCC97-H细胞,经G418筛选出稳定转染的细胞系。2、采用不同的实验技术检测gp78 RNAi前后MHCC97-H细胞增殖能力、克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力的变化。3、运用RT-PCR与Western Blot法检测gp78 RNAi前后MHCC97-H细胞中gp78与KAI1的表达。结果1、构建的干扰重组载体经测序比对,插入的寡核苷酸序列与设计的靶点序列完全吻合,说明干扰重组载体构建成功,经过G418筛选和克隆挑选,获得稳定转染的细胞株,转染细胞在激光共聚焦显微镜下可发出绿色荧光。2、3种siRNA真核表达质粒有两种可以有效抑制gp78的表达,其中以pRNAi-2作用效果最为明显。3、MTT实验表明干扰组细胞增殖能力明显低于MHCC97-H组和空载体组细胞;平板克隆形成实验表明干扰组单个细胞形成克隆的能力与MHCC97-H组和空载体组细胞相比显着降低;细胞划痕愈合实验表明干扰组细胞迁移能力明显低于MHCC97-H组和空载体组细胞;Transwell侵袭小室实验表明干扰组细胞侵袭能力与MHCC97-H组和空载体组细胞相比显着降低;4、运用RT-PCR与Western Blot检测,干扰组细胞的KAI1表达高于MHCC97-H和空载体组细胞。结论gp78特异性RNA干扰能有效抑制MHCC97-H细胞中gp78的表达,并上调了KAI1基因的表达,从而间接降低了肝癌细胞的增殖、克隆形成、迁移以及侵袭的能力,进而有可能减弱了肝癌细胞的转移能力,逆转肝癌细胞的恶性表型。
彭利, 翟喜超, 徐卓, 张萌, 王顺祥[10]2008年在《KAI1/CD82和FAK在肝细胞癌中的表达及临床意义》文中研究说明目的肝细胞癌(HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,具有侵袭性强,易复发、转移等生物学特性,但关于HCC发生、发展、侵袭和转移的确切分子机制还不清楚。肿瘤的形成和转移的发生是多基因、多因子共同作用的结果,K AI1/CD82基因是一种肿瘤转移抑制基因, KAI1/CD82蛋白属于4次跨膜超家族(transmembrane 4 superfamily,TM4SF),通过调节细胞的粘附,抑制肿瘤细胞脱离原发灶,而起到抑制转移的作用。粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一种非受体酪氨酸激酶,作为整合素介导的信号转导过程中的中心分子,是一种与细胞癌变、分化、浸润相关的蛋白激酶。本研究通过检测KAI1/CD82蛋白和FAK蛋白在HCC中的表达,探讨其与HCC各种临床病理指标间的关系及二者的相关性,探讨二者在肝癌发生发展过程中的作用。方法选用64例HCC组织、38例癌旁肝组织,20例正常肝组作正常对照。采用免疫组织化学染色法(S-P法)检测HCC组织、癌旁肝组织和正常肝组织中KAI1/CD82蛋白、FAK蛋白的表达,并结合患者的临床病理指标进行统计学分析。结果1、KAI1/CD82在HCC组织、癌旁肝组织、正常肝组织中阳性表达率分别为32.8%(21/64)、86.8%(33/38)、90.0%(18/20);KAI1/CD82蛋白在HCC组织的表达明显低于癌旁肝组织和正常肝组织(P<0.05)。KAI1/CD82蛋白表达水平与HCC组织分化呈正相关(P<0.05),与癌栓、肝或淋巴转移呈负相关(P<0.05),与性别、年龄、肿瘤大小、HbsAg或甲胎蛋白无关。2、FAK的阳性表达率分别为75%(48/64)、39.5%(15/38)、15%(3/20)。FAK蛋白在HCC组织的表达明显高于癌旁肝组织和正常肝组织(P<0.05)。FAK蛋白表达水平与HCC组织分化呈负相关,与癌栓、肝或淋巴转移、HbsAg呈正相关(P<0.05),与性别、年龄、肿瘤大小或甲胎蛋白无关。3、KAI1/CD82蛋白与FAK蛋白在HCC组织中表达呈负相关(rs=-0.357,P=<0.05)。结论KAI1/CD82蛋白与FAK蛋白表达异常可能共同参与了肝癌的发生发展、浸润、转移过程。
参考文献：
[1]. TM4SF表达与肝细胞癌侵袭转移相关性的研究[D]. 张卫国. 第二军医大学. 2001
[2]. KAI1/CD82与肝细胞癌转移相关性的研究进展[J]. 吴春利, 耿小平, 朱立新. 实用肝脏病杂志. 2008
[3]. 四跨膜蛋白CD151与肝细胞癌侵袭转移及其对HGF/c-Met信号转导的影响[D]. 柯爱武. 复旦大学. 2008
[4]. KAI1/CD82蛋白表达与肝细胞癌侵袭转移[J]. 张卫国, 王一, 吴伟清, 冼志红, 关新元. 中华普通外科杂志. 2002
[5]. 跨膜4超家族成员1在原发性肝细胞癌组织中的表达及其对患者预后的影响[J]. 彭威, 邱氟. 癌变·畸变·突变. 2017
[6]. KIAA0008基因与肝细胞癌侵袭表型的关系及其机制研究[D]. 赵磊. 复旦大学. 2004
[7]. 广西扶绥县肝癌家系人群TSPAN8基因单核苷酸多态性与肝癌遗传易感性研究[D]. 韦柳君. 广西医科大学. 2017
[8]. KAI1基因对MHCC97-H肝癌细胞侵袭转移的影响及机制[D]. 彭志红. 第叁军医大学. 2004
[9]. 泛素连接酶（E3）gp78的RNA干扰对MHCC97-H细胞生物学行为及KAI1表达的影响[D]. 李楠. 第叁军医大学. 2010
[10]. KAI1/CD82和FAK在肝细胞癌中的表达及临床意义[C]. 彭利, 翟喜超, 徐卓, 张萌, 王顺祥. 第五届中国肿瘤学术大会暨第七届海峡两岸肿瘤学术会议、国际肿瘤细胞与基因治疗学会会议、第二届中日肿瘤介入治疗学术会议论文集. 2008
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