刘康栋[1]2003年在《小鼠IFN-γ真核表达载体的构建和转染小鼠腹腔巨噬细胞抗肿瘤效应研究》文中研究说明背景与目的： 巨噬细胞在机体的抗肿瘤免疫中有重要的作用：①免疫监视功能，能够识别和清除衰老和变异的细胞；②抗原提呈功能，能够将加工过的抗原和MHC-Ⅱ类分子结合，和其它细胞表面信号一起激活辅助性T细胞；③非特异性免疫杀伤效应；巨噬细胞不但能够通过抗原提呈激活T细胞增强机体的特异性抗肿瘤免疫，而且可以通过与肿瘤细胞的密切接触，非特异性杀伤肿瘤细胞。 在被激活后，巨噬细胞可释放一系列的细胞因子及生物活性物质，如IL-1、IL-2、TNF-α、NO等，对机体的抗肿瘤免疫起到非常重要的调节作用。充分利用和调动这些功能在肿瘤生物治疗中的作用受到重视。静止的巨噬细胞不具备这些功能，巨噬细胞只有被激活后才有吞噬功能和分泌生物活性物质的能力。IFN-γ是巨噬细胞强有力的活化因子，可由激活的T细胞、NK细胞或巨噬细胞自身分泌。IFN-γ和巨噬细胞表面受体结合并使受体发生二聚化后，受体的胞内近膜区与胞浆内非受体酪氨酸蛋白激酶JAK(janus kinase)结合并发生磷酸化，进而与信号转导和转录激活因子(STAT)相结合。在JAK的催化下，STAT中的酪氨酸磷酸化，并结合成二聚体转移到核内，与DNA启动子的活化序列结合，启动基因的表达，产生多种生物活性物质。 IFN-γ的分泌可以增强抗原提呈细胞MHC-Ⅱ类抗原的表达及多种细胞MHC-郑州大学2003年硕士毕业论文小鼠IFN一丫真核表达载体的构建和转染鼠腹腔巨噬细胞抗肿瘤效应研究I类抗原的表达。因而可以促进Th细胞与APC以及cTL与靶细胞的识别及相互作用。IFN一丫的表达对ThZ细胞的增殖有抑制效应，但对Thl细胞却没有此效应，这种差别可能与Th，细胞缺失IFN一Y受体链的信号转导表达有关。此外IFN一Y对维持幼稚型T细胞对工L一12的反应是必需的。这有利于Th，细胞的分化，从而增强肿瘤的特异性细胞免疫。IFN一Y对NK细胞有强的激活作用，激活的NK细胞可以非特异性杀伤肿瘤细胞。IFN一Y在激活巨噬细胞分泌TNF一。的同时，还可以上调肿瘤细胞TNF一a受体的表达，增强TNF一Q的抑瘤作用，能够增强靶细胞对CTL和NK细胞的敏感性。 早期将巨噬细胞体外活化后回输到体内治疗肿瘤的过程中，IFN一Y和LPS常被用来作为巨噬细胞的体外活化因子。但由于体外培养的巨噬细胞吞噬活性丧失很快(每小时约丧失3%)，体外培养体内回输的应用受到限制。治疗效果不理想。本实验构建了小鼠IFN一丫的真核表达载体，并将此载体在体外转染小鼠腹腔巨噬细胞，并在荷瘤小鼠腹腔内注射重组表达载体，观察抗肿瘤效应。实验方法: 1.小鼠IFN一Y真核表达载体的构建: 无菌收集小鼠脾脏淋巴细胞，培养于含10%胎牛血清的RPMll640培养液中 (100 pg/m 1 PHA)培养4h。1000 rPm离心收集培养的细胞，按上海生工试剂盒方法提取总RNA。设计两套引物，采用RT一PCR、巢式PCR扩增提取的总RNA得到 IFN一Y的cDNA，将此cDNA和PGEM一T载体连接，用蓝白筛选的方法初步筛选，用PCR的方法进一步鉴定。将鉴定得到的重组质粒进行扩增，双酶切后回收目的片段和双酶切的pcDNA3.1质粒相连接，筛选得到重组的真核表达载体PcDNA3.1一工FN一Y。质粒的提取、纯化、感受态细胞制备、转染、蓝白筛选均参照《分子克隆实验指南》进行。 2.小鼠腹腔巨噬细胞的分离和培养: 取20克左右的雄性昆明小鼠，脱臼处死，消毒小鼠腹部，沿注入3ml冰预冷的PBSH(含1 ou/ml肝素和10%胎牛血清)。轻轻按摩小鼠腹部，无菌切开腹壁，用吸管吸出腹腔液体，再用同样体积的冰预冷的PBSH冲洗腹腔3次。将腹腔液体收集到离心管中，1000 rpm离心10 min，弃去上清。用预冷的适量郑州大学2003年硕士毕业论文小鼠IFN一丫真核表达载体的构建和转染鼠腹腔巨噬细胞抗肿瘤效应研究RPMn64O培养液洗涤细胞3次。用sml RPMll创0培养液重悬细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞的活力。然后置于37℃、器C02的培养箱内培养。 3.pcDNA3.1一IFN一丫质粒腹腔内注射 制备磷酸钙转染液，在肿瘤细胞接种到小鼠腹腔的第七天将IFN一丫基因转染液500 pl(含pcDNA3.l一IFN一Y质粒20 pg)注射到小鼠腹腔。同时设立PcDNA3.1空质粒对照组、磷酸钙转染液对照组和生理盐水对照组。 4.巨噬细胞IPN一丫表达的检测和杀伤活性的检测 (1)RT一PCR法检测IFN一Y贝RNA的表达 peDNA3.1一IFN一Y质粒转染体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞。转染后24h去除转染液，加5ml RPMI 1640培养液继续培养24h，收集细胞，用PBS洗两次。用试剂盒提取总RNA。提取的总RNA加1 p IDNA酶消化30 mirl，RT一PCR检测表达的mRNA.同时设空质粒转染组和磷酸钙转染组。 (2)间接MTT法 pcDNA3.1一IFN一Y质粒转染体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞，转染后24h去除转染液，加5ml即Mll640培养液继续培养24h，吸去培养液到15ml的离心管中。1500 rPm离心10 min，取上清一20℃保存。同时取另一组小鼠腹腔巨噬细胞，贴壁纯化后，用上一组收集的培养液培养18h，然后收集巨噬细胞，以H22为靶细胞，把效靶比为20:1混匀混合培
赵明耀, 刘康栋, 董子明, 赵国强, 杨洪艳[2]2006年在《小鼠IFN-γ真核表达载体的构建及其抗肿瘤效应研究》文中研究表明目的:构建小鼠IFN-γ的真核表达载体,将载体在体外转染小鼠腹腔MΦ,观察MΦ的抗肿瘤效应。在荷瘤小鼠腹腔内注射重组表达载体,观察抗肿瘤效应。方法:RT-PCR扩增小鼠IFN-γmRNA,将扩增的cDNA通过亚克隆重组到表达载体pcDNA3·1上。体外转染小鼠的腹腔MΦ,RT-PCR检测小鼠IFN-γmRNA的表达,用转染的MΦ的培养上清培养另一组MΦ,MTT法检测MΦ对肿瘤细胞的杀伤活性。将重组质粒注射到荷瘤小鼠腹腔,观察小鼠腹水出现时间和存活时间。结果:将小鼠基因的开放阅读框(ORF)重组到真核表达载体pcDNA3·1内,测序证实和GenBank所公布序列相符。体外将IFN-γ基因导入MΦ内并表达,其培养上清对MΦ有激活作用,杀伤肿瘤细胞活性增强。腹腔内注射重组表达载体,荷瘤小鼠的腹水增长延迟、荷瘤生存时间延长。结论:构建的小鼠pcDNA3·1-IFN-γ表达载体体外转染腹腔MΦ并获表达,体内外实验显示有抗肿瘤细胞活性。
肖徽, 冯作化, 张桂梅, 李东[3]2003年在《质粒DNA及其协同IFN-γ、CH50在巨噬细胞免疫功能激活中的作用》文中认为目的 :研究真核表达质粒DNA在巨噬细胞免疫功能激活中的作用及其机制。方法 :体外培养巨噬细胞 ,检测巨噬细胞一氧化氮 (NO)分泌水平、FACS检测巨噬细胞表面分子的表达、MTT法测定巨噬细胞的细胞毒作用 ,以这些指标测定质粒DNA、质粒DNA IFN γ、质粒DNA CH5 0多肽对体外巨噬细胞的直接激活作用。或腹腔注射质粒DNA ,取腹腔巨噬细胞进行功能检测。结果 :pCH5 10质粒和pcDNA3 1质粒在体内、外均可刺激巨噬细胞产生NO。激活的巨噬细胞表面分子MHC Ⅱ、B7 1表达增加 ,细胞毒作用增强。在体外 ,质粒DNA协同IFN γ对巨噬细胞产生更强的激活作用 ,而CH5 0多肽与质粒DNA没有协同作用 ;腹腔注射质粒DNA后 ,取出巨噬细胞再与IFN γ共培养时 ,巨噬细胞的激活程度没有改变 ,而再与CH5 0作用时 ,巨噬细胞的激活明显增强。结论 :质粒DNA在体内外能够激活巨噬细胞 ,但在体内、外的作用显然具有不同的机制 ,体外可以直接刺激巨噬细胞 ,且与IFN γ有协同作用 ;体内则是间接激活巨噬细胞 ,这些巨噬细胞随后可被CH5 0多肽进一步激活。真核表达质粒用于肿瘤的基因治疗时 ,除了其表达产物的功能之外 ,质粒自身的免疫激活作用将进一步增强肿瘤治疗作用。
唐展云, 赖冠华, 陈诗书[4]1999年在《小鼠白细胞介素12双顺反子真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达》文中研究说明克隆小鼠白细胞介素１２（ＩＬ－１２）ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ，并构建同时含ｍＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５ｃＤＮＡ的双顺反子真核表达载体及其在哺乳动物细胞中的表达．白细胞介素１２是由巨噬细胞，树突状细胞等抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子，对机体的细胞免疫功能起着重要的调节作用．利用脂多糖（１００ｐｇ／ｍｌ）和小鼠重组干扰素（ＩＦＮ－γ５００Ｕ／ｍｌ）体外联合刺激小鼠腹腔巨噬细胞，从中提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出含信号肽的小鼠白细胞介素１２（ｍＩＬ－１２）ｐ４０及ｐ３５全长ｃＤ－ＮＡ．ＰＣＲ产物经酶切后，分别克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ载体中，序列测定结果与文献报道序列一致．然后利用脊髓灰质炎（Ｐｏｌｉｏ）病毒内核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）连接ｍＩＬ－１２ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ，亚克隆至ｐｃＤＮＡ３载体中，构建成含ｍＩＬ－１２ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ双顺反子真核表达载体，即ｐｃＤＮＡ３／ｍＩＬ－１２，ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ同时受ｐｃＤＮＡ３中ｈＣＭＶ启动子驱动，将ｐ４０及ｐ３５转录至同一ｍＲ－ＮＡ上．通过ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ将ｐｃＤＮＡ３／ｍＩＬ－１２转染ＣＯＳ－７细胞，７２ｈ收集培养上清，测定ｍ?
刘起会[5]2015年在《NMAAP1通过结合IP3R调节巨噬细胞向M1型极化及机制研究》文中提出巨噬细胞作为固有免疫系统中重要的细胞组成部分,在维持体内平衡、防御微生物和直接杀伤肿瘤并递呈肿瘤相关抗原中起着不可或缺的作用。此外,巨噬细胞还具有显着的异质性及可塑性,在不同环境因素刺激下,可向不同表型极化,进而参与机体多种生理及病理生理过程。新型巨噬细胞活化相关蛋白1(NMAAP1)是本课题组在BCG活化的巨噬细胞(BAM)上发现的一种特异性表达分子,该分子是一种新发现的叁磷酸受体结合蛋白,即钙离子依赖性IP3R变构调节蛋白,属于DANGER蛋白超家族成员。DANGER蛋白超家族是一个与进化发育密切相关的蛋白群,可调节神经细胞的分化及组织器官的发育。而在BAM中特异性表达的NMAAP1分子发挥何种作用,是否可调节巨噬细胞分化从而发挥相应的生物学功能还不明确。此外,NMAAP1在BAM中特异性高表达的意义及其发挥生物学效应的机制尚不清楚。为了阐明NMAAP1在BAM中表达的作用和意义,我们应用BCG刺激小鼠腹腔巨噬细胞,发现NMAAP1表达与巨噬细胞活化表型之间存在一定的相关性;以稳定表达NMAAP1的RAW264.7巨噬细胞模型为研究平台,发现NMAAP1可以调节巨噬细胞向M1型极化,极化的巨噬细胞吞噬功能显着增强,并且具有高效的肿瘤杀伤能力,而这种杀伤效应与其分泌的可溶性细胞因子密切相关;此外,通过CO-IP发现该蛋白与IP3R相作用,调控细胞内钙离子浓度升高,从而影响钙离子相关信号通路的激活,进而引起巨噬细胞M1型极化。本研究明确了NMAAP1在巨噬细胞中表达的作用及意义,为完善巨噬细胞抗肿瘤机制提供了新的实验依据,必将为肿瘤的生物治疗带来新的契机,为新型抗肿瘤治疗提供新的方法和思路。
参考文献：
[1]. 小鼠IFN-γ真核表达载体的构建和转染小鼠腹腔巨噬细胞抗肿瘤效应研究[D]. 刘康栋. 郑州大学. 2003
[2]. 小鼠IFN-γ真核表达载体的构建及其抗肿瘤效应研究[J]. 赵明耀, 刘康栋, 董子明, 赵国强, 杨洪艳. 中国病理生理杂志. 2006
[3]. 质粒DNA及其协同IFN-γ、CH50在巨噬细胞免疫功能激活中的作用[J]. 肖徽, 冯作化, 张桂梅, 李东. 中国免疫学杂志. 2003
[4]. 小鼠白细胞介素12双顺反子真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达[J]. 唐展云, 赖冠华, 陈诗书. 中国生物化学与分子生物学报. 1999
[5]. NMAAP1通过结合IP3R调节巨噬细胞向M1型极化及机制研究[D]. 刘起会. 吉林大学. 2015