广州大学生命科学学院
摘要 启动子是基因的重要组成部分，在转录中起重要作用。它通过结合决定RNA聚合酶活性的转录因子来控制基因活性。然而，在不能编码DNA的基因之间存在一些区域，曾被认为是“垃圾DNA”。为了更好地了解这些区域，我们设计了一个实验以了解间隔区变化如何影响转录活性。在实验中，我们使用生物信息学，生物化学和遗传学技术来探寻启动子间隔区的构象。我们使用光谱仪收集数据并根据数据计算活性。我们发现间隔序列中“-17”位置的突变体明显地增加转录活性。细菌启动子一直是未来研究的重要课题。转录与生物体内的一些疾病有关。我们掌握启动子活性的理论可以有助于降低疾病的发病率。
关键词 启动子，间隔区，-17位置，突变体
引言 转录是遗传信息从DNA转移到RNA的过程。作为蛋白质生物合成的第一步，转录是mRNA和非编码RNA的合成步骤。转录以双链DNA为模板，以四种核苷三磷酸为材料和RNA聚合酶作为合成RNA的催化剂。在转录过程中，DNA模板从3'末端转录到5'端，而RNA链则从5'端到3'端。 RNA转录过程合成一般分为两个步骤，第一步是合成原始转录产物。第二步是提供用于后处理的转录产物;这一步可以将原来的产物变成具有生物功能的成熟RNA。然而，原核mRNA的原始转录产物可以直接用作翻译蛋白的模板，而不用进行后处理。
瑞典皇家科学院发表过：“如果我们想了解干细胞在医学中的全部潜能，那么了解转录过程就是必要的一步。”在生物学中，细胞的转录可用于治疗诸如癌症的疾病。通过转录的基本理论，我们可以确定这些疾病的原因。人类基因组中有大约30,000到35,000个基因，其中大多数编码蛋白质。这基本上是可以转录和翻译的基因的总数量。但在转录单位之间存在一些非转录序列，这称为间隔区。在我们的实验中，我们使用生物信息学，生物化学和遗传学来探究启动子间隔区的序列和构象，以及间隔序列变化如何增加启动子活性。
材料与方法
载体pRW50：通过DNA重组技术将有用的靶DNA片段扩增并表达到受体细胞中的工具称为载体。细菌质粒是常用于重组DNA技术的载体。质粒分子具有包含复制功能的遗传结构。质粒还携带一些遗传信息，这使得它能够将该信息传递给宿主细胞。
寡核苷酸cbpAΔ45：通过寡核苷酸合成的DNA可用于链聚合以扩增几乎任何DNA的片段。 在该过程中，寡核苷酸用作引物与DNA标记的互补片段组合，制备DNA的拷贝。
感受态细胞JBC387：通过物理化学方法诱导感受态细胞，使细胞处于最合适的生理状态。在我们的实验中，我们将快速生长的大肠杆菌放在低温下，用氯化钙溶液处理，以使细胞Ca2 +从磷脂双层转变为液晶结构，使细胞膨胀。这促进核酸酶解离并诱导细胞成为感受态细胞。同时，细胞在42℃热休克90秒，改变细胞膜的液晶结构。在细胞中，通过复制将遗传信息转移到靶DNA分子，使得受体细胞具有新的遗传特征。最后，将转化的细胞在选择性培养基上培养以筛选具有目标DNA克隆的分子。
DNA纯化技术：在实验开始之前，将RNaseA溶液加入缓冲液P1中并保存在冰中。在缓冲液PE中加入乙醇。收集样品的试管以5000rpm离心5分钟。将液体倒出并留下残留物。残留物加入容量为250μL的缓冲液P1中，并转移到新的试管。然后加入250μL缓冲液P2，使其充分混合。然后加入350μL缓冲液N3，充分混合（由于添加了LyseBlue，样品会变成无色）。然后将它们以13000rpm的速度离心10分钟。此后，将800μL上清液转移到新的QIA管中，将其离心60秒。添加500μL缓冲液PB并离心60秒。再加入预先制备的缓冲液PE中洗涤并离心60秒。之后，我们将QIA管放入干净的1.5mL小试管中。然后加入50μL水，然后离心60秒即可提纯DNA。最后，我们将2μL的样品，2μL水和2μL染物添加到新的试管中进行电泳。将1μL寡核苷酸和9μL样品液体注射到新的试管中混合进行基因测序。
β半乳糖苷酶测定：每个样品准备3个组。样品加入5mL LB培养液和100μ样品液。将它们置于37℃振荡器中2小时。然后用250mL Z缓冲液，100mg ONPG颗粒和676μL巯基乙醇制成ONPG液。振荡2小时后，在火焰附近将1mL液体从普通样品中取出。分光光度计用于测量OD650单位的数据。然后将一滴脱氧胆酸钠和甲苯加入到普通物中。然后将250μL样品液体放入具有2.5mL ONPG液体的长管中。每15秒振荡一支长管使其完全反应。再加入1mL碳酸钠停止反应。最后，将1mL样品液从长管中取出至比色皿。并用分光光度计测量OD420单位的数据。然后使用公式计算转录起始的活性。
结果与分析 为了研究启动子间隔区的作用，我们创建了显示寡核苷酸cbpA序列的DNA片段文库。该文库用于在cbpA间隔区中从-22到-13选择随机单碱基突变。为了避免间隔物的性质的完全改变，我们不考虑多个碱基变化的样品。然后我们将制备好的DNA片段文库克隆到质粒pRW50中lacZ的上游。通过使用文库转化Lac-JCB387细胞，并在MacConkey琼脂培养基上扩散。根据以往经验，在lacZ融合质粒文库中，野生型cbpA调节区仅对低水平的lacZ表达有反应。因此，用MacConkey琼脂培养基上融合质粒转化的JCB387细胞具有Lac-表型。这种表型是白色的，我们转化的大多数调节区也具有这种表型。然而，在我们的样本中，衍生物中有46个调节区域产生红色Lac +表型。我们筛选了这46种衍生物并进行了纯化。通过β-半乳糖苷酶测定法测定lacZ的表达水平。最后，确定这些cbpA调控区域的序列。
红色表型产物
我们把检测区域分为3个部分：
第一部分:
第一部分数据显示，启动子位点在-13G和-17T的突变最多。而-13G和-17T比-15T和-18A突变有更大的转录活性。
第二部分：
我们可以发现在启动子位置-17处存在最多的突变和最大的活性。当我们比较-17位置之间的活动时，我们可以发现在这个启动子位置活性有T> C> G的特点。
第三部分：
我们注意到所有的突变发生在-17的位置。我们可以发现拥有活性有T> C> G的趋势。根据上述所有数据，在-17位置的转录对活性有最大的刺激作用。 因此，我们有必要继续分析-17位置的特定突变。
讨论 根据实验结果，我们可以得出以下结论。从-22位到-13位的单碱基突变可以提高转录活性。而在位置-17处具有最显着的突变，具有趋势：T> C> G> A。
根据Singh（2011），启动子强度、构象和转录调节蛋白可以影响转录活性。这可能是由于修饰的启动子对转录带来不同的刺激。此外，启动子构象的变化可以影响sigma因子和DNA之间的联系。此外，与大肠杆菌启动子相连的上游延伸区可能影响转录的最佳活性。 DNA结构和灵活性的变化可能有助于sigma因子与下游启动子DNA的相互作用。
这个实验发现在-17位置从A到T的突变具有最大的活性。 Hook-Barnard和Hinton（2009）表明，富含T型的间隔物可以提供额外的灵活性，因为螺旋区域产生弯曲点并且更容易展开。间隔物可以为促进通道通过的DNA提供轨迹。
为了验证我的猜测，未来我需要设计进一步的关于-17位置的实验。我可以使用晶体结构测定技术来研究原子水平上的结晶材料的微结构。通过DNA拓扑结构的计算建模检测-17位置双螺旋构象的变化。我也可以设计一个实验来分析天然PAGE中的DNA弯曲。检验内在的DNA曲线的变化是否与转录活动有关。我可以使用KMnO4足迹法快速简便地定位双链DNA分子中的单链区域。
我们的实验对未来的意义是，在生物学中，细胞的转录可用于治疗与转录有关的遗传变化的疾病。分析转录的基本理论，我们可以确定这些病因。然后研究如何治疗这种疾病。此外，该技术可用于农业。我们可以抑制一些有害细菌的RNA合成，对作物进行遗传调控，增加产量或抵抗害虫。在工业中，我们可以通过影响其转录活性来增加酵母的产量，这将增加葡萄酒行业的收入。
参考文献
Hook-Barnard IG, Hinton DM. (2009).大肠杆菌的RNA聚合酶sigma70对启动子的转录起始间隔的影响。
Shivani S. Singh, (2011). 大肠杆菌σ70序列和构象的基因间隔区。
论文作者:吴世豪
论文发表刊物:《医药界》2018年2月上
论文发表时间:2018/8/20
标签：转录论文; 活性论文; 间隔论文; 细胞论文; 缓冲液论文; 突变论文; 样品论文; 《医药界》2018年2月上论文;