李明明[1]2013年在《中国肝豆状核变性ATP7B基因突变及其与临床关系研究》文中研究表明背景：肝豆状核变性(Hepatolenticular Degeneration, HLD),又称Wil son病(Wilson's Disease, WD),是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍疾病,其基因定位于13q14.3,基因突变可引起铜蓝蛋白合成障碍、胆汁中铜排泄受阻,过量的铜不能排出体外而在体内沉积,导致肝硬化、神经症状、角膜K-F环、尿铜升高等临床表现。WD基因突变表现为少数几个热点突变为主,伴有广泛存在的散在突变,国内与国外基因突变热点不同,且国内不同地区、民族间主要热点突变也存在一定的差异。基因型-表型研究方面目前未形成统一意见,需进一步研究。目的：通过对103例WD患者和34例对照者ATP7B基因21个外显子直接测序,分析肝豆状核变性ATP7B基因突变的规律及其与临床的关系,探讨基因突变检查对肝豆状核变性临床诊断和发病机制的意义,为建立适合我国ATP7B基因突变检查方法提供科学依据。方法：1.收集103例WD患者和34例对照者的外周血样本,提取DNA,应用聚合酶链式反应(PCR), DNA产物直接测序,测序结果与正常ATP7B基因对照,统计基因突变情况。2.收集WD患者的临床资料,统计软件分析高频突变热点(Arg778Leu突变和Pro992Leu突变)与临床表型的相关性。结果：1.经直接测序法,发现了15种多态,包括Ala971Ala(2913T>A)、 Gly1266Gly(3798G>T)两种未报到的新多态,36种致病突变(错义突变32种,无义突变3种,移码突变1种)和13种新突变(1510_1511insA、Leu692Pro (2075T>C)、Gln680Stop (2038C>T)、Leu745Ile (2233C>A)、Thr850Ile (2549C>A)、Ala874Pro (2620G>C)、Pro1070Arp (3209C>G)、Trp1153Cys (3460C>T)、 Gly1149Glu (3446G>A)、Ser1226P (3677C>T)、Gly1265Cys (3793G>T)、Leu1275Ser (3824T>C、Ala1295Val (3884C>T)。2.8号外显子Arg778Leu (2333G>T)染色体突变频率18.93%,13号外显子上Pro992Leu (2975C>T)染色体突变频率为13.10%,是本研究的两大突变热点,其他类型突变染色体突变频率均低于5%。3.36种致病突变主要分布于8、12、13、16外显子,4个外显子总的染色体突变频率为54.37%。在外显子1、4、5、6、21上未检测到致病突变。4.应用直接测序方法,103例WD患者总的突变检测率为92.23%。对非肝豆状核变性34例对照ATP7B基因直接测序,有3例(8.82%)检测出WD杂合突变,1例为Thr977Met(2930C>T)突变,1例为Arg1319Stop(3955C)突变,1例出现Arg778Leu(2333C>T)突变。5.高频突变Arg778Leu和Pro992Leu与临床分型、性别、K-F环、血清铜蓝蛋白浓度、谷丙转氨酶浓度、24小时尿铜量、发病年龄之间未存在显着性相关(P>0.05)。结论：8号外显子上Arg778Leu突变和13号外显子上Pro992Leu突变是本课题中103例WD患者的主要突变位点,Pro992Leu突变可能是中国WD患者另一高频突变。致病突变主要分布于8、12、13、16外显子,对国内WD患者基因检测应首选以上四个外显子。基因型-表型相关性尚需要进一步研究。DNA直接测序技术具有高敏感性高和特异性,可广泛应用于临床肝豆状核变性患者基因筛查。
张华军, 鲍远程[2]2004年在《肝豆状核变性基因外显子突变的研究进展》文中研究表明肝豆状核变性 (wilsondisease ,WD)是一种以铜代谢障碍为特征的常染色体隐性遗传病 ,世界人群的患病率各国报道不一 ,一般在 (0 .5～ 3) 10万。该病的基因定位于 13q14 .3区 ,共含有 2 1个外显子 ,基因表达产物为铜转
赵鹏, 张本恕[3]2004年在《肝豆状核变性基因突变研究进展》文中认为肝豆状核变性是一种常见的神经遗传病,其基因定位于13q14.3区,目前常用于检测ATP7B基因突变的方法有染色体单体型分析法、PCR-SSCP法及DNA直接测序法;ATP7B基因突变形式很多,以点突变为主,不同地域、不同人种存在不同的突变热区。现有的研究还未证实ATP7B基因型与表型之间存在明确的相关性,这些关于ATP7B基因突变的研究为实现肝豆状核变性基因诊断奠定了必要的基础。
吴志英, 王柠, 慕容慎行, 林珉婷[4]1998年在《肝豆状核变性基因第3～20号外显子突变及多态的DNA测序研究》文中提出肝豆状核变性（ＷＤ）是与铜代谢障碍有关的常染色体隐性遗传病。基因定位于１３ｑ１４．３，有２１个外显子，ｃＤＮＡ全长６．６４ｋｂ，编码１４６５个氨基酸的Ｐ型叁磷酸腺苷（ＡＴＰ）酶，此酶参与铜跨膜转运的代谢过程。ＷＤ基因突变形式具有遗传异质性，欧洲人以１...
祁艾红, 吴健民, 崔天盆[5]2006年在《PCR-SSCP技术检测中国人肝豆状核变性基因第18、14外显子突变》文中提出目的了解中国人肝豆状核变性(WD)患者基因第18、第14外显子的突变情况,为掌握该病的突变特点并进行基因诊断提供依据。方法聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测中国人WD基因第18、14外显子突变,并对异常带型进行直接DNA测序。结果45例患者和20例正常人的18外显子PCR-SSCP出现两种泳动带型,异常带型测序证实无突变存在。14号外显子PCR-SSCP出现的带型均一致,结论14外显子和18外显子可能不是中国人WD基因突变的热区。
杨静芳, 陈彪[6]2004年在《中国人肝豆状核变性基因第8号外显子突变分布及应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术快速检测》文中指出目的利用变性高效液相色谱(DHPLC)技术研究国人肝豆状核变性基因(Wilson’s Disease,WD)第8外号显子基因突变的分布情况及建立检测方法。方法利用聚合酶链式反应(PCR)扩增WD基因第8外显子片段,扩增产物直接进行DHPLC分析;对有峰型改变的样品经测序分析确认突变。
隋佳梅[7]2007年在《串联重复ASO探针的构建及其在肝豆状核变性诊断中的应用》文中指出肝豆状核变性是一种以铜代谢障碍为特征的常染色体隐性遗传病，早期干预有效，因此早期诊断对疾病的预后有重要意义。致病基因为ATP7B(WD)，突变形式以点突变为主，白种人与亚洲人有不同的突变热点。我们针对文献报道的中国人突变热点设计8个位点(占全部突变基因的60％)的探针单元，进而用连接的方法合成串联重复ASO探针，应用这些探针进行反向斑点杂交，标记检测样品的外显子PCR产物，根据信号的有无判断样品点突变类型。为检验反向斑点杂交的特异性及检出率，应用PCR产物酶切或测序对所检测的样品进行验证。本实验共检测了23例无关样品，都是临床诊断为肝豆状核变性的患者。实验共发现12种基因改变形式，实验结果验证了R778L为中国人突变热点的报道(39.13％)。实验设计的8个位点检出4种已报道的突变形式，它们的突变率占总检出突变形式的58.7％；测序发现包括微缺失和微插入在内的额外8种改变类型，其中3种微缺失和微插入为尚未报道的类型，是否为致病突变需进一步分析；另有3种点突变已有报道，这其中包括一种欧洲人第二热点突变；1种点突变被认为是多态；1种点突变是否为致病突变尚无定论。
杨静芳, 江晓华, 梁秀龄, 王丽娟, 陈嵘[8]2004年在《变性高效液相色谱在检测肝豆状核变性基因突变中的作用》文中研究说明目的 建立变性高效液相色谱 (denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)技术检测肝豆状核变性 (WD)基因第 8外显子突变。方法 利用聚合酶链式反应 (PCR)扩增WD基因第 8外显子片段 ,扩增产物直接进行DHPLC分析 ;对峰型有改变的样品经测序分析确认突变。结果 在 5 1例WD先证者中共发现两种错义突变 (Arg778Leu和Arg778Gln)、一种插入突变 (Ins2 30 2C)和一种多态性位点 (C2 310G)。其中 12例先证者带有Arg778Leu杂合错义突变 ,3例为Arg778Leu纯合错义突变 ,1例为Arg778Gln杂合错义突变 ,1例为杂合 2 30 2C插入突变。多态位点C2 310G与Arg778Leu突变完全连锁。结论 WD基因第 8外显子阳性检出率为 33 3% (17/ 5 1) ,说明DHPLC技术是一种可用于临床WD基因诊断的高效、灵敏和操作简便的方法
何纲[9]2006年在《一例暴发性肝豆状核变性的临床与基因突变研究》文中提出肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration，HLD)又称Wilson病(wilson’s disease，WD)，是一种重要的常染色体隐性遗传疾病，由于基因突变导致铜代谢障碍，铜在体内大量沉积而发病。本病可累及神经、肝脏、肾脏、血液等多个器官和系统，临床表现复杂，误诊率高达50％～90％，而以肝病首发者更甚。暴发性肝豆状核变性(wilsondisease presenting as fulminant hepatic failure，fulminant wilsonianhepatitis，fulminant wilson’s disease，FWD)是其中一种少见而严重的类型，预后极差，如不进行肝移植治疗，病死率几乎100％。FWD的诊断和治疗是临床工作中一个极为棘手的问题。国内外至今尚未见关于FWD采用内科方法抢救成功并进行病理检查及长期观察的报道，国外仅有1篇关于FWD患者基因突变研究的报道。研究目的1．系统观察、总结1例暴发型肝豆状核变性患者的临床特点、铜代谢异常、病理变化及治疗转归，为暴发型肝豆状核变性的诊断和治疗提供科学依据。2．系统分析该例暴发性肝豆状核变性患者及其直系亲属的WD基因突变，找出突变位点，阐明突变的遗传规律及其分子发病机制，初步探讨突变类型与临床的关系。研究方法1．采用D-青霉胺、血浆置换和糖皮质激素等内科综合治疗方法抢抢患者，定期检查患者的血尿常规、肝功能、铜代谢指标，病情允许时检查患者肝脏的病理变化，随访时间1年。2．采用PCR扩增后直接测序的方法检查患者及其直系亲属的的WD基因的全部外显子、外显子／内含子交界区、部分内含子，如没有发现突变，再检查5’-端调控序列。其主要步骤是：抽取外周血，酚氯仿法制备DNA，针对21个外显子及启动子自行设计引物，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下割取目的条带，纯化回收PCR产物，对PCR产物测序、分析。研究结果1．采用内科综合治疗方法成功抢救1例暴发性肝豆状核变性，治疗随访1年，患者病情稳定，肝功能完全恢复正常。这一结果表明，如能早期诊断，采取驱铜、血浆置、糖皮质激素等换等综合治疗措施，至少对部分暴发性肝豆状核变性是有效的，抢救成功的患者，长期预后良好。这一结果对于暴发性肝豆状核变的治疗决策有重要参考价值。2．病后第4个月对患者进行肝活检，肝组织学检查证明已进展到肝硬化，暴发性肝豆状核变性实质上是在肝硬化基础上发生的广泛肝损伤。3．患者急性期铜蓝蛋白(197mg／L)显着高于恢复期(70mg／L)，证明肝脏炎症对铜蓝蛋白的浓度有重要影响。这提示，在肝病的鉴别诊断时，不要因为铜蓝蛋白正常而排除WD。患者尿铜高达8067μg／24h，尿铜显着增高对WD的诊断有重要意义。4．采用自行设计的引物和实验条件，成功地扩增了所有21个外显子，外显子／含子交界区。PCR扩增产物与预期的大小相同，直接测序结果与参照序列相同，说明引物设计正确，实验条件适当，实验结果可靠。5．在患者、患者的弟弟及父亲的WD基因18号外显子发现一个新的尚未报道的杂合错义突变：3884C→T(Ala1295Val)。此突变来源于患者的父亲。突变位于ATP7B的ATP绞链区，推测这是一个致病突变，该突变可能影响ATP的结合而引起ATP7B的功能障碍。6．在患者及其父母、弟弟的WD基因的17号内含子发现一个尚未报道的新的缺失突变：3700-23delg。这可能是一个多态。7．1～17、19、20、21号外显子均未发现突变。结论1．采用内科综合治疗方法成功抢救1例暴发性肝豆状核变性，治疗随访1年，患者病情稳定，这表明内科综合治疗方法至少对部分暴发性肝豆状核变性是有效的。这一结果对于暴发性肝豆状核变性的治疗决策有重要参考价值。2．病后4个月肝活检证实本例在病理上是在肝硬化基础上出现的广泛肝损伤。患者急性期铜蓝蛋白显着高于恢复期，提示不可因为铜蓝蛋白正常而排除肝豆状核变性。患者尿铜极度增高，对肝豆状核变性有重要诊断意义。3．在患者的WD基因18号外显子发现一个新的尚未报道的杂合突变：3884C→T(Ala1295Val)，此突变来源于患者的父亲。突变位于ATP7B的ATP绞链区，推测这是一个致病突变，该突变可能影响ATP的结合而引起ATP7B的功能障碍。在患者及父母、弟弟WD基因的17号内含子发现一个尚未报道的新的缺失突变：3700-23delg，这是一个多态的可能性大。1～17、19、20、21号外显子均未发现突变。
吴志英, 王柠, 慕容慎行, 林珉婷[10]1999年在《肝豆状核变性基因12号外显子突变特征的研究》文中进行了进一步梳理目的研究中国人肝豆状核变性（ＷＤ）基因１２号外显子的突变特征，为建立直接基因诊断的方法提供理论依据。方法应用聚合酶链反应单链构象多态（ＰＣＲＳＳＣＰ）技术，对４４例无亲缘关系的确诊患者和６０名正常对照组进行ＷＤ基因第１２号外显子的突变检测，并用ＤＮＡ测序证实其突变性质和位置。结果８例患者在１２号外显子检测到２种错义突变，占１８％（８／４４），其中６例为Ｔｈｒ９３５Ｍｅｔ突变，２例为Ｇｌｙ９４３Ａｓｐ突变。结论中国人ＷＤ基因第１２号外显子的突变特征与西方人不同。这对于建立准确快速的直接基因诊断方法具有重要价值。
参考文献：
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[2]. 肝豆状核变性基因外显子突变的研究进展[J]. 张华军, 鲍远程. 医学综述. 2004
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[4]. 肝豆状核变性基因第3～20号外显子突变及多态的DNA测序研究[J]. 吴志英, 王柠, 慕容慎行, 林珉婷. 中华神经科杂志. 1998
[5]. PCR-SSCP技术检测中国人肝豆状核变性基因第18、14外显子突变[J]. 祁艾红, 吴健民, 崔天盆. 中国现代医学杂志. 2006
[6]. 中国人肝豆状核变性基因第8号外显子突变分布及应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术快速检测[C]. 杨静芳, 陈彪. 中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编. 2004
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[8]. 变性高效液相色谱在检测肝豆状核变性基因突变中的作用[J]. 杨静芳, 江晓华, 梁秀龄, 王丽娟, 陈嵘. 中国神经精神疾病杂志. 2004
[9]. 一例暴发性肝豆状核变性的临床与基因突变研究[D]. 何纲. 中南大学. 2006
[10]. 肝豆状核变性基因12号外显子突变特征的研究[J]. 吴志英, 王柠, 慕容慎行, 林珉婷. 中华医学杂志. 1999
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