胥婧[1]2007年在《哈密瓜细菌性果斑病菌的分子检测及群体遗传分析》文中研究指明哈密瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp．citrulli)是西瓜、甜瓜、哈密瓜等葫芦科植物上的一种重要的病原细菌。近年来果斑病的发生趋势有所上升，对我国哈密瓜生长造成严重威胁。哈密瓜果斑病为典型的种传细菌病害，因此种子检疫成为防治此病害的重要手段。本研究建立了一套快速、准确、灵敏的检测方法，用于检测哈密瓜种子携带的病原细菌。并利用BOX-PCR技术对果斑病菌进行了遗传多样性分析。本研究将hrp基因作为检测靶标，根据hrpB_2基因设计了一对特异性引物HB_2F_2／HB_2R_2，用此特异引物可以从哈密瓜细菌性果斑菌株中扩增出290bp的特异性片断，而其余参试菌株和哈密瓜组织的PCR反应结果为阴性，灵敏度试验证明可以检测到目标菌体的浓度为10~2CFU。用特异性引物对哈密瓜带菌种子浸出液进行PCR检测，结果可发现目的菌的存在。该实验首次将hrp基因做为靶标，为快速检测病原菌提供了新的方向。采用BOX-PCR技术，对新疆、宁夏、美国等的64个哈密瓜果斑病菌进行遗传多样性分析，并与其它7种病原细菌进行比较。在相似率达80％时，BOX-PCR将71个参试菌株分成了7个组群，哈密瓜果斑病菌归于1、2组群，证明哈密瓜果斑病菌与嗜酸菌属(Acidovorax)亲缘关系近，与其它属细菌关系较远。在相似率达90％时，BOX-PCR技术将64个果斑菌株分为5个组群，新疆、宁夏地区的菌株亲缘关系非常近，并与国外的菌株亲缘关系较远。对64个果斑菌株的铜敏感性进行测定，85．9％的(55／64)菌株对铜离子(CuSO_4)表现为不敏感，即能够在含1．25mM的CuSO_4的NA平板上生长，14．1％(9／64)的菌株对铜离子表现为敏感。2001年分离的果斑病菌有69．6％(16／23)的菌株对铜离子表现为不敏感，30．4％(7／23)的菌株对铜离子表现为敏感；而2006年分离的34个菌株全部表现为对铜离子不敏感，这表明哈密瓜果斑病菌对铜制剂的抗性频率上升。
回文广, 赵廷昌, Schaad, N, W, 孙福在, 王建荣[2]2007年在《哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的建立》文中指出【目的】哈密瓜细菌性果斑病在中国为新发生的病害,其病原菌为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.Citrulli),危害瓜果造成品质下降。该病为典型的种传细菌性病害,因此种子检疫成为防治此病害的重要手段。【方法】通过实验,将生物学、免疫学和分子生物学检测技术有机结合,建立了一套针对哈密瓜果斑病的种子带菌检测方法Bio-IMS-Real-timePCR。【结果】经过人工模拟种子带菌检测实验,结果表明该方法可成功地检测出1000粒种子中的1粒带菌种子(带菌量约为1.04×105CFU/种子,经计算,可以检测的最初浓度为2CFU·ml-1ASCM培养液),且信号较强。【结论】该检测方法的建立,大大提高了对哈密瓜细菌性果斑病菌检测的精度,也为生产实践中哈密瓜果斑病的防治提供了重要的技术支持。
回文广[3]2004年在《哈密瓜果斑病菌快速检测方法的建立》文中研究说明哈密瓜细菌性果斑病在我国为新发生病害，其病原菌为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp．citrulli)，为害瓜果造成商品瓜的产量下降。近年来，果斑病的发生趋势有所上升，对我国哈密瓜生产造成严重威胁。哈密瓜细菌性果斑病菌为典型的种传细菌性病害，因此种子检疫成为防治此病害的重要手段。但常规的病种子检测方法大多存在时间过长、精度不高、专一性不强等缺点。有鉴于此，本研究建立了一套快速、准确、灵敏的检测方法，用于检测哈密瓜种子携带的病原细菌。 本研究配制了ASCM选择性培养基，用于果斑病菌的富集培养，同时抑制其他杂菌的生长；制备了果斑病菌的抗血清，并使用间接ELISA法模拟种子带菌检测：设计并合成了特异性的果斑病菌PCR检测引物，在模拟种子带菌检测实验中，菌体PCR的检测精度可达3×10~5CFU／ml；设计了Taq Man水解探针，并使用实时定量PCR对果斑病菌进行了检测，检测精度达到3×10~4 CFU／ml。成功地利用免疫超顺磁珠将免疫检测与PCR检测方法有机地结合起来，构建了IMS-PCR检测方法，并将检测精度提高到了3×10~2CFU／ml。 本研究最终将MOPS分离细菌、ASCM选择性培养基富集、免疫磁性分离与(实时定量)菌体PCR等技术融合成为一套种子带菌的快速检测方法(BIO-IMS-PCR)，可成功地检测出1000粒(商品)种子中的一粒带菌种子，且信号较强。此检测方法的建立，为哈密瓜生产中检测细菌性果斑病，进而为防治该病提供有力的技术支持。
陈涛[4]2008年在《哈密瓜细菌性果斑病菌群体感应信号分子的检测及其合成基因luxI的功能》文中研究说明哈密瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)是西瓜、甜瓜、哈密瓜等葫芦科植物上的一种重要的病原细菌。近年来果斑病的发生趋势有所上升,对我国哈密瓜及其他瓜类生长造成严重威胁,常造成严重的经济危害。目前,对果斑病菌的研究主要集中于传播机理,防治措施等方面,对于其致病机理的研究少有报道。本研究利用AHL超敏感生物检测菌株JZA1(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410)对哈密瓜细菌性果斑病菌(A.avenae subsp.citrulli)产生群体感应信号分子的能力进行了检测,定量的β-半乳糖苷酶活性检测与定性的反向薄层层析检测表明该菌株可以产生一定活性的、1种类型(C_8-AHL)的群体感应信号分子,说明哈密瓜果斑病菌中存在QS系统。同时,在我们检测的57株哈密瓜果斑病菌菌株中,39株菌株能产生群体感应信号分子,18株未检测到AHL类信号分子,说明QS系统在哈密瓜果斑病菌中存在差异。利用分子生物信息学,通过同源性比对,在哈密瓜果斑病菌的全基因中发现了信号分子的合成基因acluxⅠ。通过PCR技术,从AHL产生菌株xjL12中扩增了acluxⅠ基因。将克隆的acluxⅠ基因在autoinducer-Ⅰ(AI-1)AI-1缺陷的菌株Escherichia coliDH5α中原核表达,发现DH5α可恢复产生AI-1的能力。利用同源重组技术,构建了acluxⅠ基因的缺失突变株,信号分子检测和致病性测定试验表明,acluxⅠ缺失突变株完全丧失了合成AI-Ⅰ的能力,同时其在西瓜果实和幼苗上的致病性也显着降低,但不影响其生长能力。我们研究表明,群体感应调节系统在哈密瓜果斑病菌的致病性中扮演着十分重要的角色。
赵丽涵[5]2006年在《两种检疫性病原细菌的检测及其试剂盒制备》文中研究说明西瓜果斑病和番茄溃疡病都是我国对内和对外的植物检疫性细菌病害。西瓜果斑病(Bacterial fruit blotch of watermelon)是近年来新发生的一种细菌性病害,由噬酸菌属燕麦种西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli)引起,主要侵染葫芦科植物,对农业生产造成很大的威胁。番茄溃疡病(Bacterial canker of tomato)是番茄生产中最具有毁灭性的病害之一,严重影响番茄的产量和品质,它由密执安棒形杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganense subsp.michiganense)引起。对于这两种细菌病害,带菌种子是病害传播的主要侵染源,而它们已在我国局部地区发生。因此,建立一种准确、快速、灵敏的西瓜果斑病菌和番茄溃疡病菌种子带菌检测方法,对我国有效阻止危险性有害生物侵入和蔓延及防治策略的制定具有重要意义。 本研究将免疫吸附富集(ISE)和经典PCR结合以提高检测效率。利用多克隆抗体技术成功获得3种抗血清,即抗Acidovorax avenae subsp.citrulli(Ab)全菌体血清1001和1002,抗Clavibacter michiganense subsp.michiganense(cmmbi)全菌体血清1011。其中1001和1002效价均达到1:64(ODD)(凝聚反应达到1:5210);且专化性较高。1011效价达到1:32(ODD)f凝聚反应达到1:1280):但专化性不够理想。 用直接PCR技术和免疫捕捉PCR技术检测西瓜果斑病菌,结果表明,所有果斑病菌都能产生360bp左右的特异性片段,而对照Pseudomonas、Xanthomonas、Erwinia、Clavibacter、Burkholderia及Bacillus的23菌株无特异性片段产生。对两种检测方法的灵敏度比较发现:在配制的浓度梯度菌悬液检测实验中,直接PCR技术能检测到1×10~4cfu/ml左右的悬浮液,免疫捕捉PCR技术能检测到50-100cfu/ml左右悬浮液;人工接种病种的检测实验中,直接PCR技术能检测到2粒及以上带菌种子制得浸悬液,而免疫捕捉PCR技术仅1粒带菌种子即可。用免疫捕捉PCR技术对市场购买的7种西瓜、甜瓜和哈密瓜种子检测发现,其中新疆的哈密瓜种子86-1携带西瓜果斑病菌,与育苗发病检测的结果基本一致。 用直接PCR技术和免疫捕捉PCR技术检测番茄溃疡病菌的结果表明,具有致病性的溃疡病菌能产生614bp左右的特异性片段,而无致病性的番茄溃疡病菌、Pseudomonas、Xanthomonas、Erwinia、Burkholderia、Acidovorax及Bacillus属的19菌株无特异性片段产生。对两种检测方法的灵敏度比较发现:配制的浓度梯度菌悬液检测实验中,直接PCR技术能检测到1×10~5cfu/ml左右的悬浮液,免疫捕捉PCR技术能检测到1×10~6cfu/ml左右悬浮液。对市场购买的种子检测,未发现番茄溃疡病菌。
王笑[6]2007年在《我国西瓜果斑病的发生概况及种子带菌检测的研究》文中认为西瓜细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch)是西瓜、甜瓜上的一种毁灭性病害，由噬酸菌属燕麦种西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp. citrulli)引起，是我国对内和对外的重要植物检疫性有害生物。该病主要通过种子带菌传播。随着我国农业科技和商业贸易的发展，种质资源的交换和种子的远程运输十分频繁和活跃，但由此引起的病害蔓延已对我国的西瓜和甜瓜产业构成严重威胁。本研究旨在明确我国西瓜、甜瓜的种植分布及西瓜果斑病的发生情况；建立准确、快速、灵敏的西瓜果斑病检测方法，并在实际的种子带菌检测中完善该技术，以有效监控和治理该病害。本文通过收集资料得出，中国西瓜甜瓜的种植面积及总产量均居世界首位，该产业已成为我国一种具有国际竞争力和较大经济增长空间的重要园艺产业，但是，据统计我国目前已有十个省份的局部地区有细菌性果斑病的发生报道，其中新疆、内蒙古、福建、台湾等地发病较严重，对当地造成了很大的经济损失。另据调查表明，我国种类繁多的西瓜甜瓜品种对该病的抗性存在差异，但尚未发现免疫品种。从调查不同年份西瓜果斑病发生情况看，该病的发生受气候因子的影响很大，西瓜生产期雨水较多、气温较高的年份发病尤为严重。本实验室于2006年建立了免疫捕捉PCR法检测西瓜果斑病菌，其检测灵敏度达50-100cfu／ml，比直接PCR的灵敏度高出100倍左右。本研究在该方法的基础上，优化了种子带菌检测的条件，采用MOPS缓冲液在28℃、220r／min摇培4h所得到的病菌要显着多于其他缓冲液处理和其他温度处理，因此该浸提条件更易于带菌量较少的种子检测。本研究采用不同缓冲液浸提模拟病种进行免疫捕捉PCR检测，结果发现20粒种子在2ml缓冲液种浸提均能检测出特异性片断，但是用1ml不同缓冲液浸提1粒模拟病种时，只有MOPS缓冲液的处理可以检测出带菌，证明了MOPS缓冲液可以从种子上洗脱出更多的病菌，从而可以提高检测的灵敏度。病菌在种子上的分布研究结果显示，果斑病以附着在种皮上为主，种仁上未检测到该病菌。对杭州市售种子进行带菌检测，结果发现产地为新疆的浙蜜4号、早佳84—24和和产地为台湾的台湾寿山王叁个品种的种子有出现阳性结果，可见其对浙江省西瓜和甜瓜产业存在潜在危险性。
李亚利[7]2006年在《甜瓜细菌性叶斑病的寄主范围测定、16SrDNA鉴定及西瓜细菌性果斑病菌的PCR检测》文中进行了进一步梳理近年来,甜瓜细菌性叶斑病在新疆发生普遍,危害严重,给瓜农造成极大的损失。据2004～2005年调查,在甘肃省河西地区的西瓜、甜瓜地中有零星发生,由于该病症状与西瓜细菌性果斑病在叶片上的症状很相似,认为可能是西瓜细菌性果斑病。因此,2004～2005年对采集到的病叶经分离纯化得到纯菌株,测定了该菌株的致病性和寄主范围,用16S rDNA分子生物学方法进行了鉴定,并利用PCR技术对病瓜及病瓜种子带西瓜细菌性果斑病菌的情况进行了检测,现将结果报道如下:1甜瓜细菌性叶斑病菌Ps1、Ps2的致病性及寄主范围测定从甘肃河西、新疆阿勒泰甜瓜上分离获得的17种菌中,选择了具有代表性的2种菌株(编号Ps1、Ps2)和西瓜细菌性果斑病的标准菌株,测定其致病性和寄主范围,结果表明:甜瓜细菌性叶斑病菌与西瓜细菌性果斑病菌的寄主一致,即除可侵染葫芦科植物西瓜、黄瓜、甜瓜、西葫芦、苦瓜、冬瓜、瓠瓜、丝瓜等外,还能侵染番茄、玉米、茄子、辣椒、菜豆等非葫芦科植物,2细菌性叶斑病菌16SrDNA分子鉴定对分离到的甜瓜细菌性叶斑病的病原菌Ps1、Ps2和西瓜细菌性果斑病的标准菌株,经DNA提取,PCR扩增16S rDNA基因片断后测序,其基因序列与GenBank中报告的已知序列比较,结果表明Ps1、Ps2与已报道的Pseudomonas syringae(登录号为AF094749)、标准菌株与Acidovorax avenae subsp. citrulli(登录号为AF137505)序列同源性高达99%,基本确定了这叁个菌株在系统发育学中的地位,初步确定当地甜瓜细菌性叶斑病菌主要是丁香假单胞杆菌Pseudomonas syringae (Van Hall)。3西瓜细菌性果斑病菌的PCR检测2004～2005年从甘肃、新疆、内蒙等西甜瓜主产区收集到的认为染有西瓜细菌性果斑病的甜瓜、西瓜果实和种子25份,应用西瓜细菌性果斑病菌的特异性基因序列,进行PCR检测,结果只有西瓜细菌性果斑病菌的标准菌株(Acidovorax avenae subsp.citrulli)在360bp的位置出现了特异性的条带,其余待测菌株都没有此条带产生,说明通常根据症状诊断的西瓜细菌性果斑病并不是细菌性果斑病菌为害所致,初步确定2004～2005年在甘肃和新疆甜瓜主产区很少或没有西瓜细菌性果斑病的发生。
王政[8]2005年在《内蒙古哈密瓜细菌性果斑病病原鉴定及种子带菌检测技术的研究》文中提出在内蒙古巴彦淖尔市哈密瓜细菌性果斑病病叶上分离到 8 个细菌菌株,致病性测定证明均为该病的病原菌。经革兰氏染色、菌体形态和培养性状观察、生理生化反应,确认该病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp. citrulli willems et al. 1992)。该病原菌除侵染哈密瓜外,人工接种可侵染多种葫芦科作物以及番茄和茄子。实验中制备了该病菌的抗血清。血清学反应,载玻片凝集反应、试管凝集反应、琼胶双扩散反应因为灵敏度较低不适合种子带菌检测。本论文发展了一种免疫亲和分离结合免疫鉴定的血清学种子带菌检测技术,其灵敏度为 102cfu/ml。用该技术进行种子带菌部位检测和种子带菌率检测,结果表明,供试的 8 个哈密瓜品种种子中均不同程度地含有带病种子,且均为种子表面带菌。对检测结果的可靠性进行评估,用该技术从种子中检测出的细菌接种到哈密瓜上,发病症状与自然发病症状完全相同,种子带菌率与哈密瓜苗期的发病率在 α = 0.05 水平上线性正相关,表明本实验的免疫亲和分离结合免疫鉴定的血清学种子带菌检测技术具有准确、灵敏、简便、快速的特点。
汪新[9]2010年在《瓜类细菌性果斑病菌hrp基因簇部分基因的克隆及功能研究》文中研究指明由燕麦噬酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp. citrulli, Aac)引起的瓜类细菌性果斑病是葫芦科植物上的一种严重的细菌性病害。它主要危害西瓜、甜瓜等的果实和叶片,产生病斑并造果实腐烂,导致减产,近年来发病趋势持续上升,对我国经济造成严重损失。因此,需要我们尽快地找到有效的防治措施,而对瓜类细菌性果斑病菌致病机理的研究则对该病害的防治具有重要的指导意义。植物病原菌对其寄主的致病过程是由多种成分参与的复杂的生物化学和生理代谢过程,而由hrp (Hypersensitive Response & Pathogenicity)基因编码的Ⅲ型分泌系统(type III secretion system,T3SS)能将效应因子或无毒基因产物转运至植物细胞内,在细菌对寄主的致病过程和非寄主的过敏性反应中起重要作用。目前,对瓜类细菌性果斑病菌的研究主要集中于病原菌鉴定、病原菌检测方法和技术、传播机理、防治措施等方面,对其致病机理的研究少有报道,至今未有其hrp相关基因的报道。hrp基因存在于革兰氏阴性植物病原细菌中,决定病原细菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病植物过敏性反应(hypersensitive response, HR)。本研究从果斑菌的hrp基因簇中克隆了hpaA、hrcT、hrcC和hrpG基因,通过同源重组的方法,分别构建了它们的突变体。电镜观察发现,hpaA和hrpG基因突变体的鞭毛缺失且细胞形态发生显着变化,而hrcT和hrcC基因突变体的鞭毛和细胞形态未发生明显变化。在烟草和哈密瓜叶片上的测定结果显示,hpaA、hrcT和hrcC的突变体均失去在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜叶片上的致病性；hrpG在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜上的致病性则显着减弱；进一步的生长曲线测定结果表明,hpaA、hrcT、hrcC、hrpG的突变体的定殖能力均显着下降。相应地,功能互补后突变体基本恢复至野生表型。证明瓜类细菌性果斑病菌hrp基因作为Ⅲ型分泌系统关键组份影响病原细菌对寄主植物的致病性和对非寄主及抗病植物的过敏性反应。
赵丽涵, 王笑, 谢关林, 徐福寿, 谢国雄[10]2006年在《免疫捕捉PCR法检测西瓜细菌性果斑病》文中提出利用免疫吸附富集结合经典PCR技术建立了免疫捕捉PCR检测西瓜(Citrulluslanatus)果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli)的检测法,并与直接PCR和生长检测法比较。结果表明,所测果斑病菌产生360bp左右的特异性片段,而10个不同属的对照菌株无特异性片段产生。免疫捕捉PCR检测果斑病菌的灵敏度为50￣102cfu/mL,而直接PCR则为104cfu/mL,两者的灵敏度相差100倍左右。免疫捕捉PCR法对市售7种瓜种的检测发现,其中1种哈密瓜种子、2种甜瓜种子和2种西瓜种子检出果斑病菌,与人工气候箱内生长检测的发病结果基本吻合。显示了该法准确、灵敏、快速、低成本等优点。
参考文献：
[1]. 哈密瓜细菌性果斑病菌的分子检测及群体遗传分析[D]. 胥婧. 南京农业大学. 2007
[2]. 哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的建立[J]. 回文广, 赵廷昌, Schaad, N, W, 孙福在, 王建荣. 中国农业科学. 2007
[3]. 哈密瓜果斑病菌快速检测方法的建立[D]. 回文广. 中国农业科学院. 2004
[4]. 哈密瓜细菌性果斑病菌群体感应信号分子的检测及其合成基因luxI的功能[D]. 陈涛. 南京农业大学. 2008
[5]. 两种检疫性病原细菌的检测及其试剂盒制备[D]. 赵丽涵. 浙江大学. 2006
[6]. 我国西瓜果斑病的发生概况及种子带菌检测的研究[D]. 王笑. 浙江大学. 2007
[7]. 甜瓜细菌性叶斑病的寄主范围测定、16SrDNA鉴定及西瓜细菌性果斑病菌的PCR检测[D]. 李亚利. 甘肃农业大学. 2006
[8]. 内蒙古哈密瓜细菌性果斑病病原鉴定及种子带菌检测技术的研究[D]. 王政. 内蒙古农业大学. 2005
[9]. 瓜类细菌性果斑病菌hrp基因簇部分基因的克隆及功能研究[D]. 汪新. 南京农业大学. 2010
[10]. 免疫捕捉PCR法检测西瓜细菌性果斑病[J]. 赵丽涵, 王笑, 谢关林, 徐福寿, 谢国雄. 农业生物技术学报. 2006