(南通市妇幼保健院产前诊断中心 江苏南通 226006)
【摘要】目的:探讨胎儿染色体非整倍体异常采用MLPA技术快速检测价值。方法:2015年5月-2016年5月,选择产前诊断标本224例,其中绒毛标本10例,脐带血标本70例,羊水标本144例。均行细胞遗传学分析及MLPA检测。结果:本次研究共选择224例产前诊断标本,经MLPA检测系统提示母血或69XXY污染的羊水2份,另2份羊水标本因具有的细胞量太少,实施检测后,DNA量太低,而不可对可信的结果获取。经细胞培养,再实施MLPA检测,上述4例样本为正常二倍体,在出具核型分析结果前,其他220份标本获得可信结果,并一致于细胞染色体核型所分析的相关结果,未出现假阴性及假阳性的情况,24h报告达98.2%临床符合率。采用MLPA进行检测,染色体整倍体异常标本14例,包括47XYY征1例,21-三体6例,13-三体1例,45X单体2例,18-三体4例。结论:针对产前诊断中的胎儿染色体非整倍体异常,采用MLPA技术进行快速诊断,获取的结果具较高准确性,且经济成本较低,通量高,应用前景十分广阔,值得临床深入研究。
【关键词】MLPA技术;胎儿染色体非整倍体异常;检测
【中图分类号】R714.5 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231(2016)22-0038-02
传统的染色体核型分析结果可靠准确,除可对染色体倍数改变检测外,还可检测染色体重组、缺失等结构改变,为染色体产前诊断一项金标准[1]。但此方法也有一定不足,如对技术水平要求较高、工作强度大,且有培养失败风险,故对稳定、快速、成本低的新方法探寻,是临床研究的重点。本次研究应用多重连接依赖式探针扩增(MLPA)技术,对胎儿染色体非整倍体异常进行检测,旨在探讨其价值,现回顾结果如下。
1.资料与方法
1.1 一般资料
选取224例产前诊断标本,其中绒毛标本10例,脐带血标本70例,羊水标本144例。均行细胞遗传学分析及MLPA检测,患者对本次实验均知情同意。
1.2 方法
1.2.1提取DNA 脐带血基因组DNA应用QuickGene-SPkit血液基因组所具有的提取试剂盒进行提取,绒毛基因组DNA采用TIANamp Gemomic组织基因组所具有的DNA提取试剂盒进行提取。
1.2.2处理羊水标本 对妊娠15~20周孕妇羊水标本抽取,抽取量为1.5ml,经13000rpm/min行5min离心操作,将上清弃除,取PBS缓冲液1ml加入,再次离心,上清在5min后弃除,取蛋白酶K加入,裂解30min,在下一步试验中应用。
1.2.3检测MLPA 应用(SALSA MLPA P095 Kit)染色体非整倍体检测试剂盒,含检测探针36对,除Y染色体上有4对外,X、18、21染色体均有8对,经杂交、扩增等步骤,促PCR产物生成。PCR产物变性后,于ABI3130遗传分析仪放置,行毛细管电泳,分离后,获取原始数据,经Genemapper4.0软件分析,获取含片段长度、峰面积、峰高等系列指数。
1.3 统计学分析
在Version5.01软件中导入Genemapper4.0软件导出数据,开展相关分析。此Version5.01软件先将每个产物峰的峰面积标准化,避免系统误差对结果产生的影响,而而对样本自身情况反应。样本标准化值与探针产物峰标准化平均值对比,获得标准差(s)及比值(Ratio),此比值为所获反应样本在DNA拷贝数上发生的变化。正常男性X染色体相关Ratio值范围为1.0±0.13,Y染色体为1.0±0.24;正常女性X染色体及正常二倍体样本13、18、21号染色体Ratio值正常范围为1.0±0.1,经分析不同染色体及Ratio值等,对数据差异性计划,P<0.05时,为此染色体具非整倍性,可得出结论。
2.结果
从处理样本至样本分析完成,MLPA检测在24h内结束,检测探针PCR产物以136~454bp为长度范围,相邻产物间隔6~9bp。另有64~70~76~82bp分离产物中4个片段为DNA数量质控片段(DQ),对连接反应的发生无依赖,当初始DNA量<100ng时,片段出现在图谱中,表明因模板量少,促使目的探针未充分杂交。另外,另一为92bp产物长度的连接依赖质控片段,用于对反应体系的扩增和连接有无异常检测。当某一目标染色体出现杂合重复或缺失时,在图谱上呈现的情况为此染色体的探针产物相应峰面积平均值呈35%~50%减少或增加。
本次研究共选择224例产前诊断标本,经MLPA检测系统提示母血或69XXY污染的羊水2份,另2份羊水标本因具有的细胞量太少,实施检测后,DNA量太低,而不可对可信的结果获取。经细胞培养,再实施MLPA检测,上述4例样本为正常二倍体,在出具核型分析结果前,其他220份标本获得可信结果,并一致于细胞染色体核型所分析的相关结果,未出现假阴性及假阳性的情况,24h报告达98.2%临床符合率。
采用MLPA进行检测,染色体整倍体异常标本14例,包括47XYY征1例,21-三体6例,13-三体1例,45X单体2例,18-三体4例。结果见表。
3.讨论
自2002建立MLPA技术以来,其因具准确性高、经济、用时短等优点,在基因组拷贝数变化中检测中的优势渐被公认[2]。此技术以PCR为基础,针对染色体上分布的特定序列对若干对探针设计,每对探针包括两个寡核苷酸,呈一长一短显示,长探针有一段填充序列(长短不等),当于两条探针上分布的目标基因达到完全配对杂交后,将其经过连接酶进行连接,进而促使可以扩增的一条完整杂交探针形成[3]。此探针经一对可结合所有长短探针上分布的相同序列的通用引物行PCR,后依其填充序列的长度,将所有扩增产物经毛细管电泳予以分离,经不同产物峰所表现出的相对面积,在图谱上对染色体在数目方面的变化进行判断,分析此方法的新颖之处,即应用连接的手段,将不同染色体间数所具有的目的比例向不同杂交探针数目的比例转化,经PCR扩增,放大这种比例的变化[4]。相较QF-PCR法,采用MLPA法检测,可使不同引物扩增效率不同诱导的误差消除,促结果的准确性显著提高[5]。另外,已具成熟化的商品化试剂盒对结果的可靠性和稳定性提供了保证,使应用技术难度明显降低。
本次研究应用MLPA技术对220例产前诊断标本检测,其中4例羊水标本因细胞含量少或有母血污染而在标本接收24h内无法对可信结果获取,其它220例均由软件显示诊断结果,相较核型分析,明显缩短了诊断时间。染色体整倍体异常标本14例,包括47XYY征1例,21-三体6例,13-三体1例,45X单体2例,18-三体4例,异常染色体显著性P<0.05,与设定条件符合。随着社会的发展,孕妇渐增强了产前筛查意褒,因细胞染色体分析具适应性强、准确性高等特点,在产前诊断中,至今仍为金标准。但因需细胞培养,且对实验人员的技术要求较高,在短时间内较难对诊断需求满足,而MLPA技术可对目前核型分析代替,具通量高、成本低、准确率高的特点[6]。
综上,针对产前诊断中的胎儿染色体非整倍体异常,采用MLPA技术进行快速诊断,获取的结果具较高准确性,且经济成本较低,通量高,应用前景十分广阔,值得临床深入研究。
【参考文献】
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[6]刘翠翠.FISH、QF-PCR和MLPA技术在胎儿染色体疾病快速产前诊断中的应用研究[D].青岛大学,2013.
论文作者:曹娴
论文发表刊物:《心理医生》2016年22期
论文发表时间:2016/11/29
标签:染色体论文; 标本论文; 产前诊断论文; 探针论文; 核型论文; 羊水论文; 技术论文; 《心理医生》2016年22期论文;