1.桓台县人民医院呼吸内科；2.神经外科；3.内分泌科 山东淄博 256400
摘要：目的：探讨瘦素（OB）对大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）凋亡的影响。方法：体外培养大鼠ASMCs，RT-PCR和Western blot法测ASMCs瘦素受体（OB-R）的表达。不同浓度OB（0、20、40、60、80及100ng/ml）干预培养大鼠ASMCs不同时间（1、12、24、48及72h）后，Annexin-V FITC/PI双染色法测细胞凋亡率。结果：20-100ng/mlOB作用ASMCs于48h后，各浓度组细胞凋亡率与对照组相比无统计学意义，P>0.05。结论：OB对体外培养的大鼠ASMCs凋亡无明显影响。
关键词：瘦素；气道平滑肌细胞；凋亡
哮喘主要由气道重塑造成，气道重塑主要表现为上皮细胞粘液性化生、ASMCs增生和肥大、上皮下的纤维化、血管形成增加、细胞外基质沉积等。多项研究表明OB在哮喘发病机制中有重要作用，OB对ASMCs的作用尚无报道。本实验观察OB对大鼠ASMCs凋亡的影响。
1资料与方法
1.1研究对象 170gSD大鼠1只/徐州医学院实验中心；DMEM培养基/Gibico；胎牛血清/四季青；胰蛋白酶/Sigma；OB/Alexis；兔抗大鼠OB-R的抗体/博士德；CCK-8试剂盒/凯基；TRNzol总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒/天根。
1.2方法
1.2.1大鼠ASMCs的培养 麻醉大鼠，无菌下纵剖大鼠气管，剥离外膜内膜，剪lmm×1mm×1mm块，贴培养瓶底面，加200mL/L胎牛血清的高糖培养基培养、换液、传代，选4-6代细胞。
1.2.2细胞鉴定-免疫荧光染色法 将消毒玻片置六孔培养板孔内，细胞入孔，加2mL高糖培养基。细胞融合50-60%时取出玻片，固定，100mL/L山羊血清封闭非特异性抗原，抗SMC-α-actin室温孵育2h，荧光标记二抗，4℃孵育细胞过液，封片后在荧光显微镜下检测。
1.2.3OB-R的mRNA测定 收集未经OB干预的ASMCs，TRNzol法提取细胞总RNA，紫外分光光度法测RNA浓度。用一步法RT-PCR反应体系。
1.2.4ASMCs增殖的CCK-8测定 取第5代ASMCs，2.5g/L胰酶消化，计数，细胞活性大于95%。将ASMCs按1×104细胞/孔种于96孔板培养24h，换无血清培养液培养24h，再换10mL/L胎牛血清培养液。细胞随机分6组：对照组及20、40、60、80、100μg/L的OB处理组，每组6复孔，培养1、12、24、48、72h，每孔加10μLCCK-8培养2h，波长450nm测各孔OD值。
1.2.5ASMCs凋亡的测定 Annexin-V FITC/PI双染色法测细胞凋亡率。
1.3统计学方法 用SPSS 17.0分析数据，计量资料±s，组间比较用单因素方差、q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
20-100ng/mlOB作用ASMCs于48h后，各浓度组细胞凋亡率与对照组相比无统计学意义，P>0.05，表1。
3讨论
OB是由白色脂肪细胞分泌的多肽类激素，通过与OB-R结合发挥生理作用：参与调节摄食、能量代谢、激素分泌、生长、生殖和免疫等功能，其可促进ASMCs和肥大细胞产生中性粒细胞趋化因子、TNF-α、IL-1α、IL-6等炎症因子[1]。Bohlen[2]等发现增加OB浓度50或100ng/ml可显著下调短型OB-R亚型，抑制血管平滑肌细胞增殖。Huang[3]等发现OB诱导大鼠动脉平滑肌细胞增殖致动脉内膜增厚和血管重塑。OB增高可使哮喘危险性增加[4]。OB对血管、ASMCs凋亡的作用尚无报道。本实验研究不同OB浓度干预的ASMCs凋亡率，发现OB对体外培养的大鼠ASMCs凋亡无明显影响。
参考文献：
[1]Mai XM，Chen Y，Krewski D.Does leptin play a role in obesity-asthma relationship.Pediatr allergy immunol，2009，20：207-212.
[2]Bohlen F，Kratzsch J，Mueller M，et al.Leptin inhibits cell growth of human vascular smooth muscle cells.Vascul Pharmacol，2007，46：67-71.
[3]Huang F，Xiong X，Wang H，et al.Leptin-induced vascular smooth muscle cell proliferation via regulating cell cycle，activating ERK1/2 and NF-kB.Acta Biochim Biophys Sin，2010，42：325-331.
[4]Dubey L，Hesong Z.Role of leptin in atherogenesis.Exp Clin Cardiol，2006，11：269 -275.
论文作者:何淑敏1,宋立坤2,郑金艳3,孙茂明1,王振1
论文发表刊物:《健康世界》2016年第13期
论文发表时间:2016/8/13
标签：细胞论文; 凋亡论文; 大鼠论文; 平滑肌论文; 浓度论文; 血清论文; 统计学论文; 《健康世界》2016年第13期论文;