翟凌云 王利权
(浙江大学医学院附属第二医院妇产科 310000)
【摘要】 目的：为了明确成年男性无精症的发生与PIWI蛋白的关系。方法：收集2014年6月份至2015年4月份于浙江大学医学院附属第二医院妇产科就诊的11例为非阻塞性无精子症患者和11例为阻塞性无精症患者的睾丸活检标本。用免疫组化的方法显示两组患者生精细胞中的PIWI1蛋白浓度差异。结果：阻塞性无精子症患者睾丸组织中PIWI1蛋白的表达明显高于非阻塞性无精子症患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：人类男性无精症的发生与PIWI/piRNA路径有关，提示PIWI/piRNA路径可能在正常精子发育的过程中起重要的保护作用。
【关键词】 无精症;PIWI;piRNA;精子发育
【中图分类号】R715.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）34-0380-02
在已婚人群中有将近10%～15%的夫妇存在着不孕。不孕症不但是一个家庭问题，更是一个社会问题，它严重影响了夫妇的身心健康。引起不孕的夫妇双方因素中男性因素占了将近一半。在男性因素引起的不育中，无精子症大约占了10％。
为了更好的了解精子发生机制，阐明睾丸精子发生的基因表达调控，从而在根本上解决无精子症患者的生殖健康问题，许多研究者进行了不懈的努力。近年来，RNA生物学倍受研究者的广泛关注，尤其是一些非编码小RNA（non-coding RNA，ncRNA）分子，这些ncRNA参与调节细胞生长和发育的重要生理过程。一类新型小分子调控RNA，因其能与PIWI亚家族蛋白结合，故命名为piRNA（PIWI-interacting RNA），通过与PIWI亚家族蛋白结合形成piRNA复合物来调控精子发生过程中的基因表达[1]。
PIWI蛋白质特异性地在动物生殖系细胞中表达，特异性地结合piRNA，在生殖细胞发育和配子生成过程中发挥多种重要功能[2]。遗传学研究表明生殖细胞的维护需要PIWI亚家族蛋白,以及PIWI亚家族蛋白在独特基因组位点的表遗传激活中起作
用[3]。PIWI亚家族蛋白基因敲除的雄性小鼠存在不育，表明小鼠PIWI蛋白在其精子发生过程中起重要作用[4]。
本研究组旨在通过对无精子症患者睾丸生精细胞中PIWI蛋白表达量的检测，明确非阻塞性无精子症患者与阻塞性无精症患者的睾丸生精细胞中PIWI蛋白表达差异。希望阐明piRNA及其PIWI蛋白在人类睾丸精子发生调控中的作用，有助于从根本上解决无精子症患者的生殖健康问题。
1.方法
收集2014年6月份至2015年4月份于浙江大学医学院附属第二医院生殖科就诊的22例无精症男性病人睾丸活检标本，放入液氮中保存，其中11例为非阻塞性无精子症患者，另11例为阻塞性无精症患者。利用免疫组化方法测定无精子症患者睾丸组织中PIWI1蛋白表达的水平。
免疫组化结果判定标准：
将两步法染色切片置于 CH20 型号Olympus显微镜400×下观察，胞浆或胞膜出现棕黄色为阳性。记数目标部位细胞200个以上，读出其中阴性（－）、弱阳性（+）、阳性（++）、强阳性（+++）的细胞数。阴性（－）：细胞膜或浆
内无棕黄色出现；弱阳性（+）：细胞膜或浆内棕黄色着色较弱；阳性（++）：细胞膜或浆内棕黄色清晰；强阳性（+++）：细胞膜或浆内有明显棕黄色。
再用组织学积分H-Score 方法进行半定量分析。计算公式：H-Score=∑Pi(i+1)。其中i为染色强度，用1、2、3分别代表（+）、（++）、（+++）。Pi 代表同一染色强度的阳性细胞数占待测细胞总数的百分比，即Pi=i阳性细胞数×100/待测细胞总数。1为纠正系数。
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2.结果
发现阻塞性无精子症患者睾丸组织中PIWI1蛋白的表达明显高于非阻塞性无精子症患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。
3.讨论
为了更好的了解精子发生机制，阐明睾丸精子发生的基因表达调控，从而在根本上解决无精子症患者的生殖健康问题，许多研究者进行了不懈的努力。哺乳动物PIWI/piRNA路径在蛋白编码基因的转录后的调控中起一定的作[5]。piRNA对使转座子沉默，对表观遗传的作用是肯定的[6]。但对于piRNA产生的机制，目前还没有直接的生物化学证据，一个基于生物信息学分析提出逆转录转座子介导的“乒乓模型”假说得到了许多研究者的认同[7]。
根据与PIWI蛋白家族之间的相互关系，piRNA可分为长度为26～28 nt与29～31 nucleotides (nt)[2]，形成机制可能是相同位点的差异剪切。但两种不同piRNA在小鼠精子发生过程的表达也不同：(1)从精母细胞期到减数分裂的粗线期MILI均持续表达，并与26～28 nt的piRNA相结合[7]，假如在此期间内MILI产生突变，精子的发生将停滞在减数分裂粗线期[8]。(2) 从粗线中期到成熟精细胞的早期阶段，29～31 nt的piRNA与MIWI结合，并持续共表达[7]。如果此时MIWI产生突变体，精子发生将停滞在未成熟的精子细胞阶段[9]。
目前在人类睾丸生精细胞中PIWI/piRNA路径的作用机理研究甚少。有研究认为piRNA降解特异性mRNA可能是哺乳动物中MIWI/HIWI主要作用方式。可能某种关键piRNA合适的翻转对精子生成和成熟非常重要[6]。
4.结论
本研究首次检测无精症成年男性的睾丸中PIWI1蛋白浓度，结果提示阻塞性无精子症患者睾丸组织中PIWI1蛋白的表达明显高于非阻塞性无精子症患者（P＜0.05）。证实了人类男性无精症的发生与PIWI/piRNA路径有关，提示PIWI/piRNA路径可能在正常精子发育的过程中起重要的保护作用，本研究组拟在下一步试验中检测piRNA，并进一步明确其与人类精子发生的关系。
【参考文献】
[1] Gu A,Ji G, Shi X,et al.Genetic variants in PIWI-interacting RNA pathway genes confer susceptibility to spermatogenic failure in a Chinese population[J]. Hum Reprod.2010:25(12):2955-61.
[2] Aravin A, Gaidatzis D, Pfeffer S, et al. A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes[J]. Nature.2006:442: 203-207.
[3] 戴鹏, 苟兰涛，刘默芳。PIWI/piRNA与雄性生殖细胞发育[J]。生命的化学。2014:34（4）:456-465。
[4] Carmell MA, Girard A, van de Kant HJ, et al. MIWI2 is essential for spermatogenesis and repression of transposons in the mouse male germline[J]. Dev Cell.2007:12:503-514.
[5] Gebert D, Ketting RF, Zischler H, et al. piRNAs from Pig Testis Provide Evidence for a Conserved Role of the PIWI Pathway in Post-Transcriptional Gene Regulation in Mammals[J]. PLoS One.2015:10(5):e0124860.
[6] Zhang P, Kang JY, Gou LT,et al.MIWI and piRNA-mediated cleavage of messenger RNAs in mouse testes[J]. Cell Res.2015:25(2):193-207.
[7] Siomi MC,Sato K, Pezic D,et al.PIWI-interacting small RNAs:the vanguard of genome defence[J]. Nat Rev Mol Cell Biol.2011:12:246-58.
[8] Watanabe T, Takeda A, Tsukiyama T, et al. Identification and characterization of two novel classes of small RNAs in the mouse germline: retrotransposon-derived siRNAs in oocytes and germline small RNAs in testes[J]. Genes Dev.2006:20:1732-1743.
[9] Grivna ST, Beyret E, Wang Z, et al. A novel class of small RNAs in mouse spermatogenic cells[J]. Genes Dev.2006:20:1709-1714.
论文作者:翟凌云,王利权
论文发表刊物:《医药前沿》2015年12月第34期
论文发表时间:2016/5/12
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