杨德琪, 洪晶[1]2006年在《程序化降温保存角膜缘干细胞的实验研究》文中研究说明目的:研究程序化降温和传统深低温保存角膜缘组织对干细胞活性的影响,探讨程序化降温保存角膜缘组织进行角膜缘干细胞移植的可能性。方法:分别使用程序化降温仪及传统液氮深低温保存同一供体双眼角膜缘组织2个月,正常复苏后制成标本,采用免疫组化P63蛋白抗体检测干细胞的存活数量,并采用同样方法检测新鲜供体角膜缘组织干细胞数量。使用图像分析软件分别计数叁次检测得的角膜缘组织干
罗琳[2]2003年在《深低温保存角膜缘组织活性的实验研究》文中研究表明目的 评价深低温保存兔眼及人眼角膜缘组织活性，以探讨深低温保存角膜缘组织应用于临床的可行性。 方法 3只健康新西兰大耳白兔(6只眼)，制备角膜缘组织片(约带2mm宽的周边角膜和2mm宽巩膜)，采用简化二步深低温保存法保存90天；取2只人尸眼角膜缘组织片(约带有2-3mm宽周边角膜及2-3mm宽巩膜)，来源于简化二步深低温保存法保存92天(1只眼)及726天(1只眼)的带巩膜环的角膜组织片。分别行光镜(HE染色、PAS染色)、透射电镜观察其组织结构及超微结构，酶组织化学染色[乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)]测定酶活性，并与新鲜眼角膜缘组织对比。 结果 ①光镜下，简化二步深低温保存兔及人角膜缘组织上皮层形态完好，细胞排列紧密，深层柱状上皮细胞胞浆少、核小、染色深。部分上皮从上皮下乳头间向下突出，每隔1-2mm横过角膜缘，呈放射状排列，形成“Vogt栅栏”。有色素颗粒沉着。未见细胞膜破裂，细胞浆均匀，未见空泡形成，细胞核未见脱失，基底膜完整，呈波浪状。基质层为疏松的纤维组织，胶原纤维排列不规则，直径粗细不均。可见血管。兔及人角膜缘上皮层PAS染色阴性；与其毗邻的角膜侧上皮层PAS染色阴性；巩膜侧上皮层偶见PAS染色阳性。②电镜下，简化二步深低温保存兔及人角膜缘组织上皮层细胞胞膜完整，上皮层表面有微绒毛和微皱褶，上皮细胞之间可见多数桥粒及半桥粒连接，细胞连接完好，底部柱状细胞为单层细胞，排列不规则，其基底连同上皮基底膜呈波浪状。胞质致密，细胞内器丰富，含有高浓度的线粒体、高尔基复合体、内质网及细丝状结构。部分线粒体肿胀，少数嵴断裂，内质网池轻度扩张。胞质内可见色素颗粒。核完整，形状不规则，核膜清晰，染色质分布均匀，中文摘要变化不明显。③简化二步深低温保存兔及人角膜缘组织上皮层LDH、SDH的酶组织化学测定可见上皮细胞内LDH为蓝色反应颗粒，分布于细胞质中;SDH为紫蓝色反应颗粒，分布于细胞质中。与新鲜角膜缘组织相比其活性无显着性差异(P>0.05)。 结论深低温保存法能保存角膜缘组织活性;能随时按需要为临床提供活性角膜缘组织材料;为深低温保存角膜缘干细胞移植治疗临床眼表疾病提供了实验依据。
佚名[3]2004年在《角膜病专题》文中提出S1-01角膜病的免疫学研究进展王宜强谢立信山东省眼科研究所近年来免疫学方面最令人注目的进展是Toll样受体(TLRs)的发现和功能研究。TLRs是一组主要表达于抗原提呈细胞的免疫相关受体,目前已有11个成员被克隆。TLRs作用的方式和介导的主要反应包括:(1)每一成员识别病原体(细菌、病毒、真菌等)的一组具有类似结构的分子(如脂多糖、肽聚
沈培清[4]2008年在《以兔浅层角膜基质为载体体外培养角膜缘上皮细胞深低温保存后生物学活性研究》文中研究表明目的通过对培养于浅层角膜基质上的角膜缘上皮细胞进行深低温保存,检测复苏后细胞的结构及活性,将细胞培养片移植到角膜缘干细胞严重损伤的异体模型兔角膜缘,并观察移植治疗效果,为角膜基质载体上培养的角膜缘上皮细胞应用于临床提供实验依据。方法实验室阶段:(1)角膜缘上皮细胞的原代培养:将切削的兔浅层角膜缘组织剪成1mm×1mm大小组织块,用含20%胎牛血清的细胞培养液培养于细胞培养瓶中,至细胞形成单层;(2)角膜缘上皮细胞种植于去上皮浅层角膜基质上传代培养:将原代培养的细胞经VTP(0.25%胰酶和0.02%EDTA V:V=1:1)消化制成单细胞悬液,滴加在去上皮浅层角膜基质载体上继续培养至细胞形成2～3层;(3)载体上培养的角膜缘上皮细胞深低温保存:将培养于角膜基质载体上的角膜缘上皮细胞放入冷冻保存液中按阶段降温保存在液氮罐中,冷冻保存液由90%胎牛血清+10%二甲基亚砜(DMSO)配成;(4)原代培养的角膜缘上皮细胞鉴定:采用倒置显微镜、电镜及免疫细胞化学染色鉴定培养的细胞的性质;(5)深低温保存前后载体上角膜缘上皮细胞形态比较及鉴定:通过倒置显微镜、电镜、HE染色及免疫细胞化学染色来比较培养的角膜缘上皮细胞的形态结构及生物学活性。动物实验阶段:将30只白兔制成角膜缘干细胞损伤模型,随机分成角膜基质组、新鲜培养细胞组及培养细胞深低温保存组,每组10只,分别用单纯的角膜基质、未冷冻及冷冻后的培养有角膜缘上皮细胞的角膜基质载体做移植实验,观察移植后一段时间受体角膜的眼表改变。结果(1)原代培养的角膜缘上皮细胞经VTP消化制成单细胞悬液,接种于去上皮浅层角膜基质载体上继续培养,细胞生长良好并能很好地附着在角膜基质载体上,传代培养第14天,载体上细胞可形成2～3层,经增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体免疫细胞化学染色呈阳性反应;(2)深低温保存前后角膜缘上皮细胞形态学变化和活性状况有所差异:倒置显微镜下观察可见冷冻复苏后细胞呈圆球形,与基质载体疏松相连,继续培养4～5天后,细胞渐伸展呈多边形,复苏后培养期间可见部分细胞脱落死亡;透射电镜检查也显示冻存后细胞的超微结构与未冻存培养细胞相比有轻度改变;(3)同种异体移植实验:兔角膜缘干细胞损伤模型制作术后5周,可见角膜大量新生血管长入并伴有结膜上皮入侵。以基质载体培养的角膜缘上皮细胞未冷冻及冷冻复苏后培养一周移植,移植术后一月,损伤角膜表面逐渐上皮化,角膜新生血管仅限于角膜缘,而对照组(仅移植角膜基质)术后一月,角膜上皮细胞仍然缺失,新生血管未见明显变化。结论以浅层角膜基质为载体进行角膜缘上皮细胞培养,可培养出复层上皮细胞,经深低温保存后仍保持上皮细胞特性并具有高增殖能力,可用来作异体角膜缘移植治疗角膜缘功能缺陷的角膜病。
顾起宏[5]2004年在《培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究》文中研究说明目的 通过对培养后的角膜缘上皮细胞进行深低温保存，检测复苏后细胞的结构和功能，来探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果。 方法 实验室阶段：(1)角膜缘上皮细胞的培养：将切取的兔角膜缘组织剪成1mm×1mm小组织块，经消化酶处理后培养在12孔板中，培养细胞至形成单层；(2)角膜缘上皮细胞的深低温保存和复苏：形成单层的细胞消化后制成悬液，分别用两组冷冻保护液：A组为32.5％F12+32.5％DMEM+20％小牛血清+15％甘油；B组为90％小牛血清+10％二甲基亚砜(DMSO)按阶段降温保存在液氮里，冻存半月、1月和2月分批取出，进行复温和复温后处理；(3)深低温保存前后的角膜缘上皮细胞的传代培养和鉴定：将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞制成的悬液传代至无上皮细胞的羊膜上再培养，采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质；(4)深低温保存前后的角膜缘上皮细胞活性比较：通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法、台盼兰染色来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性。 动物实验阶段：将40只角膜缘干细胞损伤的模型兔随机分成单纯羊膜组、未冷冻细胞组、DMSO保存细胞组和甘油保存细胞组，每组10只，用传代培养2周后的角膜缘上皮细胞作移植实验，观察细胞体外功能完成情况来进一步比较深低温保存前后角膜缘上皮细胞的活性。 结果 (1)传代细胞免疫组化结果显示：鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体、AE1单克隆抗体染色呈阳性反应，AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应；(2)深低温保存前后的角膜缘上皮细胞活性比较：传代细胞冻存后的比未冻存的贴壁、生长均滞后1～2天，未冻存细胞约10天左右形成单层，而DMSO保护液组需要12～14天，甘油保护液组难形成良好单层；深低温保存后的细胞电镜检查均有不安徽医科大学硕士学位论文同程度细胞水肿，甘油组损伤较重，再培养7天后形态结构均恢复正常;MTT法和台盼蓝染色比较冻存前后细胞的增殖活性和存活率，结果显示复苏当天冻存后的比未冻存的细胞检测值低，差异显着(尸<0.05，但培养5天后无显着差异(P>0.05)，甘油组和DMSO组间有显着性差异(尸<0.05)，各冻存组不同冻存时间测得值无显着差异(尸>.05);(3)传代培养细胞同种异体移植表明:移植细胞组动物术眼4周后的AES染色阳性，PAS染色阴性或弱阳性，移植羊膜组AES染色阴性，PAS染色弱阳性;冷冻后细胞移植术后角膜评分高于未冷冻细胞，其中未冷冻细胞与DMSO保存细胞组比较，差异无显着性(尸>0.05)，和甘油保存细胞组相比差异有显着性(尸<0.05)。结论角膜缘上皮细胞深低温保存后仍保持上皮细胞特性，传代培养后细胞中含有较多有高增殖力的干细胞;DMSO保护液比甘油保护液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行，选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养，其细胞活性和结构与原代相似。
顾起宏, 朱美玲, 王明丽[6]2007年在《培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究》文中研究表明目的探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果。方法将兔角膜缘组织培养出的细胞,分别用两组冷冻保护液冻存,0.5、1、2个月后分批取出。将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞传代培养,采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质。通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性。结果AE1和传代细胞鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体染色呈阳性反应,AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应;冻存后的传代细胞贴壁、生长均滞后,而且电镜检查均有不同程度细胞水肿,再培养7d后形态结构均恢复正常;MTT法检测复苏当天冻存后的细胞比未冻存的细胞增殖活性低,差异显着(P<0.05,但培养5d后无显着差异(P>0.05),甘油组和DMSO组间有显着性差异(P<0.05),不同冻存时间的各冻存组测得值无显着差异(P>0.05)。结论冻存的角膜缘上皮细胞传代培养仍保持上皮细胞特性并含有干细胞;DMSO保护液比甘油液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行,选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养,其细胞活性和结构与原代相似。
韩真真, 郑穗联, 蔡剑秋[7]2005年在《深低温保存角膜缘组织的结构检测及临床急症应用》文中研究表明双眼角膜缘干细胞功能衰竭,将严重影响患者眼表结构及功能。异体角膜缘移植为其提供了干细胞的来源,尤其在双眼化学伤、热烧伤及感染性角膜溃疡所致的全角膜溶解坏死的危急情况下,深低温保存的异体角膜缘移植、带角膜缘的全角膜移植或全板层角膜移植,为挽救眼球、恢复眼表
沈培清, 廖荣丰[8]2009年在《培养角膜缘上皮细胞深低温保存后异体移植实验研究》文中指出目的方法结果结论深低温保存培养的角膜缘上皮细胞,复苏后进行异体移植实验,为临床应用提供实验依据。将浅层角膜基质载体上培养的角膜缘上皮细胞深低温保存,同时制作兔角膜缘干细胞损伤模型,分别用新鲜培养的角膜缘上皮细胞和冷冻复苏后培养的细胞及角膜基质进行异体移植实验。角膜缘上皮细胞能成功地培养于载体上,将培养细胞保存于-196℃的液氮罐中二月,可见深低温保存前后细胞的形态结构及生物学特性无显着差异。异体移植实验显示:新鲜培养的细胞及深低温保存后的细胞异体移植后,模型兔角膜表面逐渐正常上皮化,而角膜基质组异体移植后,角膜表面仍结膜化并可见大量新生血管生长,各项检测结果与培养细胞组相比差异显着(<0.05)。以浅层角膜基质为载体培养的角膜缘上皮细胞深低温保存后仍具有上皮细胞特性并具有高增殖能力,可用以进行异体移植治疗角膜缘干细胞缺陷的角膜病。
于静[9]2007年在《深低温全眼球活性保存角膜的实验研究》文中提出研究背景:角膜深低温保存技术是Capella等于1965年创立的单纯角膜组织保存方法。该方法可使角膜内皮细胞长期处于“休眠状态”,保存期间内皮细胞活性不随时间延长而减弱。4℃湿房保存是一种简便的全眼球保存方法,它不易污染,便于运送和取材,但角膜内皮细胞活性保存时间短。将两者优点结合起来,探索一种既简便经济,又确实有效的长期深低温全眼球活性保存角膜方法,以促进眼库保存技术的发展。目的:探索全眼球深低温活性保存角膜的最佳模式,研究影响深低温全眼球保存法的角膜内皮细胞活性的因素。方法:根据深低温冷冻保存过程中前房内注入二甲基亚砜(DMSO)的方式,降温速率及复温条件的不同,将80只成年纯种新西兰兔眼球随机分为8组,冷冻保存时间30天。另取10只新鲜兔眼做对照。通过角膜内皮细胞活性染色方法评定各组角膜内皮细胞存活率(ESR)及光镜下内皮细胞形态,优选出最佳保存方法。将优选组角膜与对照组同时进行电镜检查及琥珀酸脱氢酶(SDH)组织细胞化学染色,对比观察两组细胞的超微结构及酶活性。结果:评定出角膜内皮细胞存活率最高组,为最佳冻存组,其方法如下:抽空房水,注入7.5% (V/ V) DMSO , 4℃冰箱内冷平衡30min,其间每隔15 min抽出前房内保护液后再次注入7.5%DMSO,共反复2次。再分段降温,-30℃30min,-80℃30min,最后将全眼球移入-196℃液氮中保存;40℃水浴中快速复温。该组角膜内皮细胞存活率平均为87.53%,与对照组(98.20%)比较,结果相近,符合临床穿透性角膜移植标准。最佳冻存组、对照组的SDH酶组织化学检测均呈阳性反应,最佳冻存组与对照组相比,颜色略浅,平均积分光密度值(IOD)分别为133.0±19.2和134.1±24.0,t=0.1,差异无统计学意义(P > 0.05)。结论:深低温全眼球活性保存角膜方法简便,保存的角膜内皮细胞活性较高,符合临床上穿透性角膜移植的标准。
高明宏, 蓝平, 张劲松, 安天义, 刘民培[10]2005年在《原代培养冷冻兔角膜缘上皮细胞的增殖活性研究》文中认为为探讨低温保存的兔角膜缘上皮细胞体外培养方法和增殖活性,采用不同的冷冻条件保存兔角膜缘上皮组织;通过若丹明B染色方法定量检查体外培养的原代细胞增殖活性,并对含血清培养和无血清培养、消化培养和组织块培养进行比较性研究。结果表明,二甲基亚砜浓度梯度和降温速率对冷冻角膜缘上皮原代细胞的增殖能力均无显着性影响(P>0.05)。在细胞增殖活性上,血清培养组优于无血清培养组(P<0.05); 组织块培养组优于消化培养组(P<0.05);RPMI 1640组优于MEM组和DMEM组(P<0.05);3T3细胞滋养层组与臣噬细胞滋养层组结果相似(P>0.05)。结论:兔角膜缘上皮细胞具有血清依赖性和低温耐受性。
参考文献：
[1]. 程序化降温保存角膜缘干细胞的实验研究[C]. 杨德琪, 洪晶. 第叁届全球华人眼科学术大会暨中华医学会第十一届全国眼科学术大会论文汇编. 2006
[2]. 深低温保存角膜缘组织活性的实验研究[D]. 罗琳. 青岛大学. 2003
[3]. 角膜病专题[C]. 佚名. 中华医学会第九届全国眼科学术大会论文汇编. 2004
[4]. 以兔浅层角膜基质为载体体外培养角膜缘上皮细胞深低温保存后生物学活性研究[D]. 沈培清. 安徽医科大学. 2008
[5]. 培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究[D]. 顾起宏. 安徽医科大学. 2004
[6]. 培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究[J]. 顾起宏, 朱美玲, 王明丽. 临床眼科杂志. 2007
[7]. 深低温保存角膜缘组织的结构检测及临床急症应用[J]. 韩真真, 郑穗联, 蔡剑秋. 中华急诊医学杂志. 2005
[8]. 培养角膜缘上皮细胞深低温保存后异体移植实验研究[J]. 沈培清, 廖荣丰. 实用防盲技术. 2009
[9]. 深低温全眼球活性保存角膜的实验研究[D]. 于静. 大连医科大学. 2007
[10]. 原代培养冷冻兔角膜缘上皮细胞的增殖活性研究[J]. 高明宏, 蓝平, 张劲松, 安天义, 刘民培. 沈阳部队医药. 2005
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