毛松[1]2002年在《牙龈卟啉单胞菌诱发牙周炎病理机制的研究》文中研究表明目的 牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)是G~-、产黑色素的厌氧短杆菌，是牙周炎、尤其是慢性成人牙周炎和早发性牙周炎最主要的优势菌之一，是目前公认的牙周炎病原菌。很多研究显示慢性成人牙周炎的进程与病变部位龈下菌斑中Pg的存在密切相关，Pg影响牙周组织细胞多种炎性介质的表达，这些介质关系到牙周炎症的启动和发展。然而，Pg的致病机理还不十分清楚，目前的研究表明，Pg具有多种毒力因子，包括菌毛、外膜蛋白、蛋白酶、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等，这些毒力因子可以通过多种途径逃脱宿主的防御系统，破坏宿主的牙周支持组织。探讨Pg诱发牙周炎性反应和牙周组织破坏的病理机制，确定Pg主要的效应位点，可以为牙周疾病的免疫治疗奠定理论基础，在牙周病学的基础研究中有重大的意义。 慢性成人牙周炎的病理学特征是白细胞在牙龈结缔组织中的大量浸润，白细胞在成人牙周炎的发生和发展过程中具有不可忽视的作用，而其活性的发挥依赖着一系列粘俯分子介导的与细胞和细胞外基质的接触和粘附。目前，粘俯分子因其广泛的作用而受到人们普遍的关注，特别是在炎性反应中白细胞的附壁和移行中的作用更是人们关注的热点。细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)是表达于细胞表面的粘附分子家族，涉及到白细胞的聚积和激活，是炎性反应中重要的前炎性介质；而白细胞介素8(interleukin 8，IL-8)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)分别是中性粒细胞和单核细胞的趋化因子，可以选择性地诱导白细胞向炎症部位聚积，对炎性反应中白细胞的浸润和分布起重要的调节作用。很多研究显示Pg影响牙龈组织细胞表达ICAM-1、VCAM二＊ 和MCPl，这在牙周炎症的病理机制中有重要的意义。血管内皮细胞是对炎性介质、LPS和细菌刺激都非常敏感的细胞，牙周病原菌对血管内皮细胞的作用一直是牙周病学研究的重要内容。然而，关于内对内皮细胞表达 ICAM士、ILS和 MCP－l的报道在国内外都不多见。本实验观察了 Pg对人脐静脉血管内皮细胞（hUInan umbilical vein endothelial cells，HUVEC）表达ICAMl、ILS和MCP－l的影响，并分析杆作用可能的效应部位，比较Pg毒力株W83和非毒力株ATCC33277间的差异，同时观察慢性成人牙周炎患者牙龈组织ICAM＊和VCAM上表达的改变，以深入探讨Pg诱发牙周疾病的可能机制。 方 法 1．细菌培养：Pg W83株和 ATCC33277株被培养在心脑浸液培养基中，补充以酵母浸膏5 g／L、氯化血红素5 mgiL、维生素民lmgiL。培养过程在厌氧袋中进行，温度35℃，直至到达理想的浓度、利用Gram染色法和羊血琼脂板培养法检测Pg的纯度。经7000xg，10而n离心后，将Pg以10’CFU／Inl的浓度悬浮于无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）中，备用。 2．细胞培养：原代的 HUVEC来源于新鲜的人脐静脉刃．二％胶原酶处理脐静脉，收集细胞，离心后置于胶原包被的100－mm的培养皿中，培养液为补充 30 mg／L内皮细胞生长补体、含 20％胎牛血清（FCS）的 M199。HU－VEC被置于 37tj％CO。培养箱中培养至形成单层对．025％胰蛋白酶一EDTA处理后系列传代，3至5代的HUVEC用于实验。内皮细胞的起源性由 AC－LDL摄人实诞实。 3．HUVEC和 Pg的相互作用：先于共同培养，HUVEC被置于胶原包被的12孔培养板中，37℃J％CO。培养箱中过夜，使细胞贴壁成单层。将10’CFU／Inl的 Pg悬液sIJ用紫外线＊0 W，10 cm，5 dn入超声波③ dn，5次）和热处理K6℃，30 dn）灭活，用20％FCS的M199稀释为系列浓度，用以刺激HUVEC＊ 矿L的大肠杆菌LPS用作阳性对照，不含作的20％FCS M199中的 HUVEC做阴性对照，共同培养一定时间后收集细胞和培养上清，利用流式细胞仪测定HUVEC表面ICAM＊阳性细胞百分数和阳性细胞表达强度，80℃保存培养上清，用于测定ILS和MCP－l的含量。 ·2· 另外，用125，250，500，100 U／d的多粘菌素B预处理1吟L粉或 10儿FtU／nd的 Pg，另将含 2000 U／nd TNF心上 mgiL LPS和 10‘cFU／dPg置于水中煮沸 15 mn，用20％FCS M199 10倍稀释，分别用预处理的Pg、LPS或 TNF心刺激 HUVEC，未处理的 Pg、LPS和 TNF心做对照，阴性对照为不含刺激物的M199培养液中的HUVEC，共同培养20h后收集细胞，以观察多粘菌素 B和热处理对 Pg诱导 HUVEC表达 ICAM＊o4和MCP＊的影响。 4．流式细胞技术分析 HUVEC表面 ICAM＊的表达：HUVEC和 Pg或LPS、TNF心共同培养一定时间后，用 0．025％胰蛋白酶E删处理并收集细胞，含lmgiL牛血白蛋白的PBS洗细胞，加荧光标记的特异性鼠抗ICAM－1单克隆抗体 10 gi，4t暗室中孵育 30 dn。清洗后悬浮于 800 giPBS中，流式细胞技术测定ICAM＊阳性细胞百分数和阳性细胞表达强度。 5．酶联免疫吸附实验尸nZym－linked immunosorbent assny，ELISA）测?
郭永华[2]2005年在《牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因遗传多态性和致病性的研究》文中研究说明牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)是目前公认的慢性牙周炎的主要致病菌,研究表明不同P. gingivalis菌株的致病性存在广泛差异,动物实验和体外研究发现P. gingivalis存在低毒力株和高毒力株,而基因的遗传异质性是细菌毒力和致病性差异的物质基础。识别牙周致病菌的毒力克隆株是当前牙周病病因学研究的焦点之一,因此,寻找P. gingivalis高毒力克隆株,探讨其致病机理,对牙周病的防治具有指导意义。细菌对牙周组织的黏附是其致病的先决条件,而菌毛是P. gingivalis黏附宿主组织的主要结构,具有广泛的生物学活性。菌毛编码基因fimA存在广泛的遗传异质性,根据fimA基因开放阅读框架(Open Reading Frame,ORF)核苷酸序列的差异,fimA基因分为5型(Ⅰ～Ⅴ)。流行病学调查结果显示,ⅡfimA型和ⅣfimA型P. gingivalis与日本人牙周炎的发生发展显着相关,ⅠfimA型P. gingivalis与健康的牙周状态相关,表明特殊的fimA基因型P. gingivalis与不同的牙周健康状态相关,提示fimA基因有望成为筛选P. gingivalis毒力克隆株的候选基因。目前,P. gingivalis致病性与其fimA基因型的关系引起国外学者的广泛关注,而国内尚未见相关报道。本研究拟从菌毛编码基因fimA的遗传异质性出发,旨在寻找与中国人慢性牙周炎密切相关的fimA基因型P. gingivalis,初步
杨洁[3]2016年在《牙龈卟啉单胞菌对动脉粥样硬化发病中Th17/Treg平衡的影响》文中提出牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)的感染与系统性疾病动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发病具有紧密的联系,且日益受到医学界的关注。效应性T细胞17(T helper cell 17,Th17)与调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)免疫平衡在AS自身免疫应答中起到关键作用。然而,AS的发生中P.gingivalis的感染与Th17/Treg平衡的关系还鲜有报道。本实验通过分析P.gingivalis感染对Th17/Treg平衡的影响,探讨感染免疫机制在牙周炎与AS关系中的作用。第一部分牙酿卟啉单胞菌感染的动脉粥样硬化患者Th17/Treg平衡特征目的分析P.gingivalis感染的AS患者Th17/Treg平衡情况,明确P.gingivali.s感染与Th17/Treg平衡的相关性。方法通过临床检查及实验室检测,筛选出42例尸gingivalis感染的冠心病患者列为Pg-AS组、32例单纯尸gingivalis感染而无冠心病的患者为Pg组、30例健康志愿者为HC组,详细记录患者临床危险因素和牙周感染情况。流式细胞技术(FCM)检测外周血中 CD4+CD25+FOXP3+Treg 细胞和 CD4+IL17+Th17 细胞的比例和数目,qPCR分析外周血单个核细胞中Treg细胞相关因子FOXP3、TGFβ和IL-10含量,以及Th17细胞相关因子RORrt和IL-17基因表达,ELISA方法检测患者血浆中IL-10、TGFβ和IL-17的浓度。结果叁组患者的AS临床危险因素指标无明显差异,但P.gingivalis感染的患者较HC组相比有明显的牙周感染,特别是Pg-AS组,菌斑指数、牙龈指数、缺失牙数和血浆PgingivalisIgG抗体滴度在叁组中最高。Pg-AS组外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例和数目、以及相关因子FOXP3、TGFβ和IL-10表达量比Pg组及HC组均减少,而CD4+IL-17+Th17细胞含量、相关因子RORrt和IL-17表达量比Pg组及HC组均增大,且差异具有统计学意义,而Pg组与HC组间无统计学差异。Pg-AS组血浆IL-10和TGFβ浓度比Pg组及HC组均降低,而IL-17浓度比Pg组及HC组均升高。TGFβ、IL-10浓度与之间CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞含量之间存在正相关,与CD4+IL17+Th17细胞含量负相关,而IL-17与之间CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞含量之间存在负相关,与CD4+IL17+Th17细胞含量正相关。结论Pg-AS患者外周血中Th17/Treg平衡失调,其中Th17细胞含量升高,Treg细胞含量降低,AS患者Th17/Treg失衡与尸gingivalis感染密切相关。第二部分牙龈卟啉单胞菌对ApoE-/-A小鼠Th17/Treg平衡影响的实验研究目的通过动物模型研究长期Pgingivali 口腔感染对AS发病过程中Th17/Treg平衡的影响。方法高脂饮食下ApoE-/-小鼠和野生型(C57BL/6)小鼠每天给予10∧8CFUPgingivaais牙周涂菌,并以同样体积PBS溶液口腔处理对照组小鼠,持续9w每周五次,末次涂菌后5d处死小鼠,microCT分析下颌骨牙槽骨吸收情况。通过主动脉根部HE染色和油红O染色分析AS斑块面积,Masson染色、CD68和aSMA免疫组化染色分析斑块稳定性。分离小鼠主动脉,qPCR检测主动脉部位Th17细胞和Treg细胞相关因子,以及斑块稳定性密切相关的因子MCP-1、RNATES、COX-2、P-selectin、E-selectin、和 iNOS 基因表达。分离脾脏细胞,FCM和qPCR分析Th17细胞和Treg细胞数目及相关细胞因子的表达。结果尸gingivalis感染可促进野生型小鼠和ApoE-/-小鼠同等程度的牙槽骨吸收。尸gingivalis感染促进ApoE-/-小鼠AS斑块面积增大,但不导致野生型小鼠形成AS斑块。免疫组化染色结果显示,与ApoE-/-小鼠相比,Pginngivalis感染的ApoE-/_小鼠斑块中巨噬细胞含量增大,aSMA表达量降低,胶原含量无明显变化。P.gingvalis感染后,ApoE-/-小鼠主动脉中Th17细胞相关因子表达上调,Treg细胞相关因子表达下调,细胞因子 MCP-1、RNATES、COX-2、P-selectin、E-selectin、和iNOS mRNA表达水平显着提高。脾脏中Th17细胞和Treg细胞的变化趋势与主动脉中的一致,Th17细胞数目和Th17细胞相关因子RORrt和IL-17表达上调,而Treg细胞数目和Treg细胞相关因子FOXP3、TGFβ和IL-10表达下调。结论P.gingivalis感染可能通过影响Th17/Treg失衡,促进AS斑块形成和斑块稳定性下降,在AS发病中起重要作用。第叁部分牙龈卟啉单胞菌对T细胞分化的影响目的分析P.gingivalis影响Th17/Treg失衡是否是通过改变微环境中细胞因子的含量,影响T细胞分化。方法提取ApoE-/-小鼠脾脏CD4+T细胞,以去增殖的CD4-T细胞为APC,CD4+T:APC=1:3比例建立共培养体系,P.gingivalis分别感染CD4+T细胞和共培养细胞,48h后流式细胞技术检测T细胞中Treg细胞及Th17细胞含量,qPCR分析相关转录因子的表达,并检测共培养上清中IL-6的表达。利用IL-6单克隆抗体中和P.gingivalis感染APC细胞分泌的IL-6,加入CD4+T细胞共培养48h,FCM分析Th17细胞和Treg细胞的变化。提取P.gingivalis感染的ApoE-/-小鼠脾脏细胞,aCD3和aCD28共刺激后分析脾脏分泌IL-6。分离6w ApoE-/-小鼠骨髓间充质细胞,经细胞因子IL-4和GM-CSF共诱导分化为DC细胞,7d后CD11c抗体检测DC纯度。用不同感染复数(0,1:10和1:100)Pgingigalis感染DC 12h,ELISA检测分析感染对DC细胞IL-6分泌的影响,FCM分析p38和Erk的活化。结果尸gingivalis感染CD4+T细胞后,Th17和Treg细胞含量无明显变化。尸gingivalis感染的APC细胞与CD4+T细胞共培养后Th17细胞比例增加,RORrt表达上调,而Treg细胞减少,FOXP3表达下调,同时共培养体系中IL-6表达也上调。阻断尸gingivalis感染的共培养体系中IL-6后,共培养的细胞中FOXP3表达上调,而IL-17表达下调。与ApoE-/-小鼠相比,/:gingivalis感染的ApoE-/-小鼠脾脏细胞分泌IL-6增加。IL-4和GM-CSF共刺激小鼠骨髓间充质细胞中9天后获得纯度为85%的CD11c+DC细胞,尸gingivalis感染可促进DC细胞分泌IL-6,且随着P.gigivalis感染复数的增大,IL-6分泌逐渐越多,p-p38和p-Erk的表达量也升高。结论P.gingivalis可能通过增加细胞因子微环境中IL-6表达,促进初始T细胞分化为Th17细胞并抑制Treg细胞分化,从而影响Th17/Treg失衡,促进AS。
黄镜静[4]2012年在《模拟高原低氧环境对兔牙周炎致病菌影响的实验研究》文中提出目的及意义：高原地区自然环境恶劣，大气压低、氧分压低、寒冷、风大、辐射强等，严重影响人们的口腔和全身健康。国内大量研究[1-2]显示高原地区牙周病的发病率及病程进展速度远高于平原地区。但目前的研究多停留在流行病学调查层面，仅对此临床现象有一定认识，对其发生、发展的病理生理特点及发病机制仍缺乏足够的研究和认识，影响临床防治效果。菌斑细菌是牙周病的始动因子。牙周致病菌以厌氧菌为主，其发生发展与宿主防御机制、细菌之间相互作用、细菌在牙周定植的数量水平等诸多因素有关[3]。由于牙周局部生态环境和牙周微生物生态关系的复杂性，以及技术上的障碍，很多问题仍然没有完全阐明。本课题组在前期研究中，通过PCR-变形梯度凝胶电泳技术(polymerase chainreaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)发现，模拟高原低氧环境下SD大鼠牙周炎致病菌具有多样性，且与平原牙周炎致病菌种类存在显着差异。由此我们推测，高原低压、低氧的特殊环境会影响口腔微生物，尤其是牙周厌氧菌在龈袋的选择性定植，其数量及内毒素水平存在差异。本实验模拟高原低氧环境建立兔牙周炎动物模型后，采用厌氧菌的分离、培养、鉴定及内毒素检测等技术对不同条件下兔龈下菌斑中定植的细菌种类、数量及内毒素水平，以及兔龈沟液pH值、活菌数、内毒素水平与牙周临床指标的相关性作初步探讨，并对牙周主要致病厌氧菌，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）在不同条件下兔龈下菌斑中的检出率及内毒素水平作相关研究，验证实验假设，进一步丰富高原牙周病微生物学的基础研究。方法及步骤：1、40只雄性大白兔随机分为4组（平原对照组、平原实验组、高原对照组及高原实验组），每组10只，实验组联合正畸丝结扎兔双下颌中切牙及牙周炎食谱饲养的方法建立牙周炎模型，高原组送入低压氧舱内饲养（模拟海拔高度5000m，23h/d），平原组在平原环境下饲养（重庆，平均海拔400m）。2、建模8周后检测各组兔附着丧失（attachment loss，AL），并记录菌斑指数（plaqueindex，PLI）和牙龈指数（gingival index，GI）；pH试纸检测兔龈沟液pH值；拍摄兔下颌前牙X线片观察牙槽骨吸收情况；切取牙周组织标本，采用HE染色观察组织病理改变。3、采集兔双下颌中切牙牙周袋内龈下菌斑，进行厌氧菌的分离、培养、计数、镜检、内毒素检测，分析牙周临床指标与兔龈沟液pH值、活菌数及内毒素水平的相关性。4、从成功培养出的牙周厌氧菌中分离、培养、鉴定Pg，并比较各组Pg的检出率及内毒素水平。研究结果：一、动物模型的实验结果：1、组织病理学观察：平原对照组及高原对照组龈沟内上皮无病理性改变，牙周膜纤维排列整齐，细胞排列有序，牙槽嵴无吸收，牙槽骨无破坏；平原实验组龈沟内上皮出现糜烂，大量炎症细胞浸润，牙周膜间隙增宽，牙槽骨少量破坏；高原实验组龈沟内上皮出现糜烂，可见大量炎症细胞如中性粒细胞、淋巴细胞等浸润，牙周膜间隙增宽，牙周膜纤维排列紊乱或断裂，可见牙槽嵴水平降低。2、X线片观察：平原对照组及高原对照组牙周膜间隙未见明显异常，牙槽嵴顶未见明显吸收；平原实验组及高原实验组可见牙周膜间隙增宽，牙槽嵴顶吸收，呈不规则降低，其中以高原实验组更为严重。3、各项牙周临床指标检测：高原实验组AL、PLI、GI均高于其余各组，且与平原实验组比较有显着差异（P<0.01）。二、厌氧菌分离、培养的实验结果：1、兔牙周厌氧菌经革兰氏染色后，在光学显微镜下观察发现，平原组龈下菌斑中细菌种类单一，主要以G-杆菌及球菌为主，而高原组细菌种类则较为丰富，G-杆菌、球菌，G+杆菌、球菌均占一定比例。2、高原实验组兔龈沟液pH值、活菌数及内毒素水平均高于其余各组，且与平原实验组比较有显着差异（P<0.05）。3、龈沟液pH值、活菌数与AL、PLI、GI有一定的相关性，呈正相关（P<0.01）；内毒素水平与AL呈正相关（P<0.01），与PLI、GI无相关性（P>0.05）。叁、Pg分离、培养的实验结果：1、Pg在CDC血平板上纯化培养5d后，可形成直径约1-2mm菌落，棕色或黑色，呈凸起状，表面光滑，似金属光泽，边缘整齐，完全溶血；革兰氏染色后光学显微镜下观察，Pg为G-杆菌或球杆菌，染色不均。2、除平原对照组外，其余叁组均成功检出Pg；与平原实验组比较，高原实验组中Pg的检出率及内毒素水平均有显着差异（P<0.05）。研究结论：1、本研究成功建立了兔高原及平原牙周炎模型，各项结果显示高原实验组与平原实验组在临床表现、牙周临床指标及牙周菌群等方面均存在显着差异，证实高原低压低氧的特殊环境加快了牙周炎的进展速度，加重了炎症的破坏程度。2、高原低压低氧的特殊环境更有利于G-厌氧菌的定居，使得牙周袋内氧气消耗增加，氧化还原电势降低，pH值升高。3、低压低氧的特殊环境更有利于Pg在龈下菌斑中的定植，且在低压低氧环境下Pg释放出更多的内毒素，毒力增强。
郑恬恬[5]2017年在《慢性间歇性低氧条件下大鼠龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的研究》文中认为目的:本实验的目的是模拟阻塞型睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)病人的间歇性低氧条件,来探讨大鼠龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的变化。方法:将32只雄性SD大鼠随机分成四组:常氧对照组(A组)、常氧牙周炎组(B组)、间歇性低氧组(C组)、间歇性低氧合并牙周炎组(D组)。采用正畸结扎丝结扎双侧上颌第二磨牙颈部和高糖饮食方法建立牙周炎模型,常氧组和低氧组分别在常氧条件和模拟阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征条件下饲养,8周后,对各组大鼠进行牙周检查,记录牙周各项临床指标,同时采集每只大鼠上颌右侧第二磨牙龈沟液标本,然后用空气栓塞法处死各组大鼠,取出上颌骨,观察牙槽骨吸收情况。采用实时荧光定量PCR方法检测龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的变化。结果:1.建模第8周,B组和D组大鼠实验牙食物堆积,牙龈红肿,探诊出血,有深的牙周袋形成,而A组和C组大鼠实验牙牙周组织变化不大,牙龈基本正常。说明牙周炎模型建立成功。2.四组大鼠牙周临床检查:D组大鼠牙周临床检查指标高于其他各组,差异有统计学意义(p<0.05);B组大鼠临床检查指标高于A组,差异有统计学意义(p<0.05)。C组大鼠临床检查指标高于A组,差异有统计学意义(p<0.05)。3.D组牙槽骨较其他各组吸收明显。4.所有的大鼠均能检出牙龈卟啉单胞菌。D组牙龈卟啉单胞菌的量明显高于其他各组,差异有统计学意义(p<0.05);B组牙龈卟啉单胞菌的量高于A组、C组两组,差异有统计学意义(p<0.05)。而A组和C组相比,牙龈卟啉单胞菌的量差异无统计学意义。结论:1.本实验成功地建立慢性间歇性低氧条件下大鼠牙周炎模型。2.牙龈卟啉单胞菌为口腔龈沟液中的常驻菌。慢性间歇性低氧条件下龈沟液中牙龈卟啉单胞菌数量增加,加重大鼠牙周炎的病变程度。
郭红梅[6]2007年在《增强sIgA应答抗牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白DNA疫苗实验研究》文中提出慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，在我国有很高的发病率，影响国民健康水平。牙周炎还可能是某些系统性疾病或状况的危险因素。由于牙周炎的治疗目前还比较困难，因此探索预防慢性牙周炎的有效途径具有重要意义。慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P．gingivalis)是其主要可疑致病菌，菌毛蛋白(fimbrillin，FimA)是细菌表面主要毒力因子之一，能够介导P．gingivalis与宿主细胞及P．gingivalis与口腔内其他细菌的粘附，并且可刺激炎性细胞因子的产生。本研究的目的就在于构建能够增强粘膜免疫应答的抗牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白的DNA疫苗，并观察其对P．gingivalis引起的牙槽骨吸收的保护作用。通过基因重组技术将FimA编码基因插入真核表达载体pIRES，在抗原基因下游插入IL-15编码基因，两段基因之间利用载体自身携带的核糖体内部进入位点IRES连接，使得两个基因的表达互不干扰。构建了真核共表达质粒pIRES-fimA：IL15，同时构建真核表达载体pIRES-fimA。通过酶切、PCR及DNA序列测定鉴定构建的质粒，用Lipofectamine 2000介导转染CHO细胞，用Westernblot和酶联免疫吸附试验(ELISA)验证了重组质粒在哺乳动物细胞能够正确表达FimA和IL-15。为研究其免疫原性，重组质粒pIRES-fimA：IL 15与pIRES-fimA经滴鼻免疫和肌肉注射免疫BABL／c小鼠，以间接ELISA方法检测血清中IgG和唾液中sIgA抗体水平。发现重组质粒经滴鼻免疫能够激发机体产生特异性的血清IgG和唾液IgA抗体反应，并且pIRES-fimA：IL 15滴鼻免疫产生的唾液IgA抗体滴度显着高于pIRES-fimA滴鼻免疫产生的唾液IgA抗体滴度。pIRES-fimA：IL 15所表达的IL-15可以作为一种辅助性的细胞因子，增强IgA反应。滴鼻免疫是一种有效的粘膜免疫途径，与pIRES-fimA：IL 15肌肉注射免疫相比，两种方法产生的血清IgG反应水平相当，但唾液IgA反应水平显着高于肌肉注射。滴鼻免疫既能产生系统免疫，又能激发粘膜免疫，IL-15对于sIgA反应有正向调节作用。本研究以重组质粒pIRES-fimA：IL 15作为DNA疫苗，观察其对P．gingivalis引起的实验性牙周炎的保护作用。将疫苗经滴鼻免疫Wistar大鼠，用P．gingivalis接种大鼠口腔，PCR方法检测接种后大鼠口腔中的P．gingivalis菌。实验结束时，取大鼠颌骨去除软组织后测量釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离作为牙槽骨吸收情况，并做组织切片观察组织学改变。比较实验前后各组大鼠体重变化，并取大鼠主要脏器做组织切片观察有无明显病理改变。在P．gingivalis引起的大鼠实验性牙周炎模型上，pIRES-fimA：IL 15经滴鼻免疫牙槽骨吸收量显着小于未免疫组，同时也小于pIRES-fimA免疫组。实验结束时，pIRES-fimA：IL 15和pIRES-fimA免疫组大鼠唾液中未检测到P．gingivalis。在实验前后大鼠体重增加各组之间没有显着差异，大鼠主要脏器也没有明显病理改变。基因疫苗pIRES-fimA：IL 15能够对P．gingivalis引起的实验性牙周炎提供安全有效的保护。本研究成功的构建了FimA蛋白与IL-15真核共表达质粒，以其作为DNA疫苗经滴鼻免疫能够激发机体产生特异性的系统免疫应答，又能激发粘膜免疫应答，滴鼻免疫可以作为抗牙龈卟啉单胞菌DNA疫苗有效的粘膜免疫途径。疫苗所表达的IL-15可以作为辅助因子增强sIga应答，对P．gingivalis引起的实验性牙周炎提供有效的保护，为解决增强sIgA应答来对牙周组织提供保护的难题提供思路。将IL-15基因加入抗牙周炎DNA疫苗中的研究国内外未见报道。滴鼻免疫无痛，易于接受，有利于疫苗的使用和推广。本研究的结果可以为研发用于人类的有效安全防治牙周炎DNA疫苗提供依据。
王晓丽[7]2014年在《细辛挥发油提取及对牙周炎主要致病菌的作用》文中认为牙周炎是一种侵犯牙周支持组织的慢性感染性疾病,是成人牙齿丧失的首要原因,其主要由龈下的具核梭杆菌、中间普氏菌和牙龈卟啉单胞菌等厌氧菌引起。目前针对利用天然植物高效、安全地防治牙周炎的报道较少,而细辛是我国的一种传统中草药,药理作用广泛,具有镇痛、止咳、抗炎、抗过敏、抗氧化等作用。本研究采用单因素试验考察不同液料比、蒸馏时间、颗粒直径和浸泡时间对挥发油提取率的影响,通过L9(3)3正交试验确定挥发油提取的最佳工艺。结果表明,对挥发油提取率影响作用大小为液料比>蒸馏时间>颗粒直径。最优水平组合为液料比17、颗粒直径2.5<D95≤3.8mm和蒸馏时间2h。应用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析细辛挥发油单体组分,共鉴定出31种成分,主要为甲基丁香酚、3,5-二甲氧基甲苯和黄樟醚。采用液体二倍稀释法和平板涂布法测定细辛挥发油对牙周炎主要致病菌(具核梭杆菌、中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌)及血链球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。结果表明,细辛挥发油对具核梭杆菌、中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和血链球菌的最小抑菌浓度分别为0.01%、0.04%、0.005%和0.04%,最小杀菌浓度分别为0.02%、0.08%、0.005%和0.32%。评价细辛挥发油对小鼠牙槽骨吸收的抑制作用,管饲100μL含2%羧甲基纤维素钠具核梭杆菌的菌悬液(109CFU/mL)于小鼠口腔,每隔2天1次,共3次,以此建立小鼠牙周炎模型。给予实验组小鼠2%细辛挥发油100μL,阴性对照组小鼠2%低粘度的羧甲基纤维素钠,每隔3天1次,持续6周；空白对照组小鼠一直饮用无菌水,不做其他处理。结果表明,阴性对照组与空白对照组相比,小鼠釉质骨质界到牙槽嵴顶(CEJ-ABC)的距离明显增大,牙槽骨吸收呈极显着差异(P<0.01)；实验组与阴性对照组相比,小鼠釉质骨质界到牙槽嵴顶的距离减小,牙槽骨吸收显着下降(P<0.05)。评价细辛挥发油在体内的安全性,给予小鼠20%细辛挥发油100μL,每天1次,持续20天,制作小鼠肝脏、肾脏组织的病理切片,经苏木精-伊红(HE)染色,结果表明,挥发油实验组和空白对照组未见明显不同。综上所述,细辛挥发油对作为牙周炎主要致病菌的具核梭杆菌、中间普氏菌和牙龈卟啉单胞菌具有明显的抗菌活性,且治疗由具核梭杆菌所致的小鼠实验性牙周炎效果良好,细辛挥发油有望成为一种治疗牙周炎的新型天然药物。
张静[8]2013年在《大鼠IgA肾病与慢性牙周炎复合模型的建立及炎性机制的研究》文中指出目的：建立大鼠IgA（IgA nephropathy，IgAN）肾病与慢性牙周炎（chronicperiodontitis，CP）迭加的复合模型，探讨牙周炎对IgA肾病进展中肾脏病理改变作用及炎性机制的研究。方法:将80只SD大鼠健康雄性随机分为4组：A组:正常对照组；B组：IgAN组；C组：CP组；D组：CP＋IgAN复合组，每组20只。CP模型建立采用大鼠双侧上颌第二磨牙接种特异性牙周炎致病菌标准株+牙颈部丝线结扎，运用牛血清白蛋白灌胃（BSA）+注射脂多糖（LPS）+四氯化碳（CCl4）方法建立实验性IgAN模型。建模后第8周、12周末各处死10只大鼠。观察指标：血尿、蛋白尿、肝肾功、肾组织病理；检测牙周指标：附着丧失及改良出血指数（MBI）；血清、肾组织中MCP-1、IL-6的表达水平，进行统计学分析。结果:经检测成功建立CP和IgAN动物模型。肾功显示：第8周A、B、C叁组肾功Scr、BUN均无明显差异，D组与其叁组差异明显，至12周B组肾功与A、C组比较差异明显，D组高于B组，差异有统计学意义(P=0.000；P=0.000)；第8周B、C、D组24h尿蛋白含量与A组比较均出现明显尿蛋白，差异有统计学意义（P＜0.05)，至12周B、C组比较差异无统计学意义(P=0.703)，但与D组比较差异有统计学意义（P=0.000）；第8周B、D组出现镜下血尿，约75%肉眼血尿，至第12周B、D组大鼠镜下红细胞计数持续增加，D组较B组显着，与A组比较均有统计学意义（P＜0.05）；肾脏病理显示：第8周A组大鼠肾小球形态基本正常，B组大鼠肾小球偶尔轻度系膜增宽、肾间质有轻度纤维组织增生，D组明显重于B组，均出现不同程度肾小球局灶系膜增殖硬化，至12周D组肾小球系膜显着增宽，局灶节段性硬化，伴炎细胞弥散或灶性浸润，B、D组肾脏PAS染色评分明显高于A、C组（P＜0.01），且D组高于B组（Z=2.803，P=0.005）；C组PAS评分与A组差异无统计学意义（Z=0.669，P=0.503）。牙周病理显示：C、D组MBI评分显着高于A、B组，D组显着高于C组（Z=2.839，P=0.005）。C、D组血清IL-6水平较A、B组显着升高（P﹤0.05），且D组较C组升高（P=0.001）；MCP-1棕褐色物质在B、C、D组肾脏均有表达，B、D组表达无明显差异，D组明显高于C组（z=2.633，P=0.008）。结论:本实验可建立快速、稳定、可靠的IgA肾病与牙周炎复合模型，模型成功率12周优于第8周；慢性牙周炎可通过炎性机制加重IgA肾病肾脏病理损伤。
魏丛丛[9]2013年在《高糖促进P.g LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌炎症因子机制的初步研究》文中认为目的：通过体外培养获得人牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblasts,HGFs),采用高浓度葡萄糖、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P.g)脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)对细胞进行刺激,酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测HGFs分泌肿瘤坏死因子-a(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)的水平,运用实时定量PCR检测Toll样受体2(Toll-like receptor2, TLR2)和Toll样受体4(Toll-like receptor4, TLR4)在HGFs中的表达,并用anti-TLR2和anti-TLR4单克隆抗体阻断后观察IL-1β和TNF-α水平的变化,以期初步探讨高糖对P.g LPS刺激HGFs分泌炎症细胞因子的作用及其机制,为阐明糖尿病性牙周炎的发病机制提供实验依据。方法：1.在天津医科大学口腔医院颌面外科选择第叁磨牙阻生齿完全埋伏、身体健康的患者5例(年龄18-25岁),获得患者的知情同意后,在智齿拔除过程中收集牙龈。用无菌中性蛋白分散酶(Dispase Ⅱ)消化分离牙龈上皮后,组织块法培养牙龈成纤维细胞,倒置相差显微镜下观察其形态及生长状况。2.采用ELISA检测高糖、P.g LPS (1μg/ml、10μg/ml)和高糖/P.g LPS刺激6h和12h后细胞上清液中TNF-α和IL-1β水平的变化,以低糖组、P.g LPS/低糖刺激组作对照。3.以高糖、P.g LPS (1μg/ml、10μg/ml)和高糖/P.g LPS刺激HGFs6h和12h后,采用实时定量PCR检测TLR2和TLR4在HGFs中的表达水平,设低糖组、P.g LPS/低糖刺激组作对照。4.应用anti-TLR2和anti-TLR4的单克隆抗体对HGFs表面的TLR.2、4进行阻断,用高糖或P.g LPS/高糖刺激HGFs12h后,以酶联免疫吸附试验检测TNF-α、IL-1β的水平,设高糖或P.g LPS/高糖刺激作对照组。结果：1.倒置显微镜下观察细胞培养至第7-10天,少数长梭形细胞从组织块边缘爬出,并围绕组织块呈放射状排列,传代后细胞生长迅速。2.与低糖对照组相比,高糖刺激6h后TNF-α分泌增加且随着时间延长,TNF-α分泌明显增加,呈时间依赖性(p<0.05)。虽然IL-1p水平在6h没有明显增加,但在12h时显着升高(p<0.05)。渗透压对照组与低糖对照组相比,TNF-α和IL-1β水平没有明显变化。3.与低糖对照组相比,高糖刺激6h时TLR2mRNA表达明显升高(p<0.05),在12h时升高更加明显(p<0.05)。而在不同的时间下高糖对TLR4的表达刺激效应无差异(p>0.05)。渗透压对照组与低糖对照组相比TLR2和TLR4mRNA水平差别无统计学意义(p>0.05)。4.采用anti-TLR2单克隆抗体预先处理HGFs后,高糖刺激HGFs产生的TNF-α、IL-1β水平明显下降(p<0.05),而anti-TLR4抗体预处理后TNF-α、IL-1β水平变化无显著差异(p>0.05)。5.与低糖组相比较,P.g LPS/低糖刺激HGFs6h和12h后,TLR2的表达和炎症细胞因子TNF-α、IL-1β分泌显著升高,呈浓度依赖性(p<0.05),而且随时间的延长TNF-α、IL-1β分泌明显增加(p<0.05)。TLR4在P.g LPS/低糖刺激HGFs6h后的表达明显升高(p<0.05),但P.g LPS刺激细胞12h后,TLR4的表达与对照组无差别(p>0.05)。6.与LPS/低糖刺激组比较,高糖可明显促进LPS刺激HGFs表面TLR2、4的表达,同时显着促进炎症因子IL-1β、TNF-α的分泌(p<0.05)。采用anti-TLR2单克隆抗体、anti-TLR4抗体预先处理HGFs后,P.g LPS/高糖刺激HGFs12h产生的TNF-α、IL-1β水平明显下降(p<0.05)。结论：1.组织块培养法培养HGFs方法简单,组织定位明确,组织块贴壁是培养成功的关键因素。2.高糖可通过诱导HGFs表面TLR2mRNA的表达升高,从而促进炎症细胞因子TNF-α和IL-1p的分泌。而TLR4不参与单纯高糖刺激炎症细胞因子的分泌过程。3. P.g LPS促进HGFs产生炎症细胞因子,早期可能主要通过其表面的TLR2和TLR4来介导炎症细胞因子的分泌,随后主要通过其表面的TLR2来介导炎症反应。4.高糖可明显促进P.g LPS刺激HGFs表面TLR2和TLR4mRNA的表达及炎症细胞因子的分泌,从而在一定程度上证实糖尿病患者血糖升高可加重牙周炎症。
李云鹏, 刘大力, 束蓉, 周彦玢[10]2012年在《牙龈卟啉单胞菌临床菌株的毒力分析》文中认为目的:利用啮齿动物模型,比较分析中国人群口腔中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)临床菌株的毒力。方法:采用小鼠脓肿形成实验,将6株从牙周炎患者牙周袋中分离获得的P.gingivalis临床菌株L2、L3、L4、L5、L11和L12分别注射至小鼠后背中央,观察其临床症状,并与国际标准菌株ATCC33277和W83进行比较,分析临床菌株的毒力特性。采用SPSS11.5软件包对数据进行统计学分析。结果:L3、ATCC33277和W83诱发小鼠产生原发性脓肿和轻微的全身反应,L2、L5、L11、L12则诱发小鼠产生远处转移性病变和严重的全身反应。结论:中国牙周炎患者口腔中的P.gingivalis临床菌株与国际标准菌株相比,在诱发实验鼠发生局部脓肿方面,具有一定程度的相似性,但临床菌株间的毒力特征具有较大差异。
参考文献：
[1]. 牙龈卟啉单胞菌诱发牙周炎病理机制的研究[D]. 毛松. 中国医科大学. 2002
[2]. 牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因遗传多态性和致病性的研究[D]. 郭永华. 四川大学. 2005
[3]. 牙龈卟啉单胞菌对动脉粥样硬化发病中Th17/Treg平衡的影响[D]. 杨洁. 南京大学. 2016
[4]. 模拟高原低氧环境对兔牙周炎致病菌影响的实验研究[D]. 黄镜静. 第叁军医大学. 2012
[5]. 慢性间歇性低氧条件下大鼠龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的研究[D]. 郑恬恬. 山西医科大学. 2017
[6]. 增强sIgA应答抗牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白DNA疫苗实验研究[D]. 郭红梅. 山东大学. 2007
[7]. 细辛挥发油提取及对牙周炎主要致病菌的作用[D]. 王晓丽. 大连理工大学. 2014
[8]. 大鼠IgA肾病与慢性牙周炎复合模型的建立及炎性机制的研究[D]. 张静. 新疆医科大学. 2013
[9]. 高糖促进P.g LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌炎症因子机制的初步研究[D]. 魏丛丛. 天津医科大学. 2013
[10]. 牙龈卟啉单胞菌临床菌株的毒力分析[J]. 李云鹏, 刘大力, 束蓉, 周彦玢. 上海口腔医学. 2012