“动物细胞培养”一节教学中的常见问题及解析，本文主要内容关键词为：常见问题论文,动物论文,细胞培养论文,教学中论文，此文献不代表本站观点，内容供学术参考，文章仅供参考阅读下载。
在学生看来，学习动物细胞培养，根本就没有感到与植物组织培养有大同小异的轻松，也没有一目了然的从一块组织到一个个体的完整过程，更多呈现的是动物细胞的“娇”（常死及易变）、“怪”（贴壁生长及接触抑制）和“无能”（无鲜活个体出现）的特点，还有始终不见细胞真容的神秘，为此，每次涉及这个内容时，不管是新授课还是复习课，学生都会有许多问题提出，本文整理了几个常见问题及相关解析，以供大家参考。
一、动物组织块一定要经剪碎然后酶解为细胞悬液才能培养吗？
细胞分散成单个细胞容易培养，因为细胞所需的营养容易供应，其代谢废物也容易排出，但这并不意味着动物细胞培养时非得分散成单个细胞才行，有时候培养的细胞甚至还不能分散。
1.组织块培养
跟植物组织培养一样，动物组织块也可直接培养，而且是最常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，早期的动物细胞的培养多采用此法，将剪成的组织团块（1
的小块）接种（间距0.2～0.5 cm）于培养瓶（或皿）壁即可。
2.细胞悬液培养
如果是上皮组织，获得细胞悬液的最佳方案还不是酶解，而是用EDTA（乙二胺四乙酸）来分散，因为该化学物质能与细胞膜上的钙、镁离子结合成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。
3.器官培养
有时整个器官不进行组织分离而直接在体外特定环境条件下也能培养，当然，为确保器官中心不发生因缺乏营养和氧气而坏死的现象，其厚度或直径不宜太厚，另外，除仍保持5%
外，一般要加注纯氧，使氧分压达到90%。
二、贴壁是一个怎样的过程？有不贴壁也能生长的细胞吗？
贴壁的过程目前还不是十分清楚，一般认为细胞附着于底物时并非一种需要能量的过程而与电荷有关，其中一些特殊的促细胞附着的物质（如层粘连蛋白、纤维链接蛋白、Ⅲ型胶原、血清扩展因子等）可能参加了细胞的贴附过程，这些因子均为蛋白质，存在于细胞膜表面或培养液尤其血清之中，在培养过程中，这些带有阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，然后悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附因子的底物附着。虽然贴附并伸展是多数动物细胞体外培养的基本生长特点，不少细胞也的确必须附着在底物上才能生长，如肝细胞、胃上皮细胞等，但当它们因基因突变而获得了不死性或癌变为肿瘤细胞时，贴壁才能生长的现象就会消失。也有的细胞永远可以悬浮生长，比如骨髓细胞、白血病细胞等。另外，随着技术的发展，有些只有贴壁才生长的细胞，经过无血清驯化后，也会从贴壁生长转到悬浮生长，目前在生物工程制药领域已广为应用。
三、为什么会有接触抑制现象？所有细胞都有这种特性吗？
接触抑制是细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂的现象，是一种密度依赖性的生长抑制，但其原因目前也不是十分清楚，一般认为这是细胞间的一种识别作用，当细胞增殖到一定程度而互相挨在一起的时候，细胞膜上的糖蛋白就识别了这种信息，进而使细胞停止繁殖。当然，接触抑制现象跟细胞贴壁生长一样，也不是所有细胞都必需的，当其中的少数细胞获得了不死性或癌变了，也会在相同培养条件下对密度依赖性生长抑制失去敏感性，不会在形成单层时停止生长，而是可以相互堆积形成多层生长的聚集体。另外，原本可以悬浮生长的细胞更谈不上接触抑制了。
四、胰蛋白酶与胶原蛋白酶作用一样吗？
要使细胞相互分离，可以用酶将细胞间粘连着的蛋白质（如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等）消化了。教材采用的酶是胰蛋白酶或胶原蛋白酶，这里的“或”不是任意选择的意思，因为这2种酶的作用对象并不一样。胰蛋白酶是一种胰脏制品，能强烈地消化细胞间质较少的软组织如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织等，而对含结缔组织较丰富的如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等则无效，而且如果消化时间过长，还会损害细胞的呼吸酶和细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此，消化后要马上对培养细胞进行洗涤。胶原蛋白酶则是一种从细菌中提取出来的酶，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质中的胶原成分有较好的消化作用，虽然作用缓慢但因对细胞本身影响不大，故还是能达到分散细胞的目的。
五、肉眼及一般的光学显微镜可以观察吗？
不管是原代培养还是传代培养，一般都得经过悬浮、贴壁伸展后，很快进入潜伏期、对数生长期最后逐渐相连成片而长满瓶底，一旦发现细胞长满瓶底80%就应该及时传代，应该说整个过程是精彩的，但观察却是有难度的。
1.肉眼观察
肉眼观察很简便但基本上无法看清未经染色的活细胞，只能通过观察培养液的颜色和透明度的变化来判断培养液pH的高低。正常情况下，培养液pH为7.2～7.4，呈桃红色清亮透明，如果培养液pH值下降，会引起颜色变浅变黄，此时若不及时通过换液来调节pH，便会导致细胞蜕变死亡。
2.显微镜观察
显微镜观察虽然明亮清晰但不是用一般的光学显微镜，因为活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变。大学实验室用于观察的是一种特殊的相差显微镜，它是20世纪30年代荷兰物理学家Zernike设计的，其原理是把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰可见。
六、核型发生变化是什么意思？
核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型，是染色体数目、大小、形态特征的总和。体外培养的细胞由于血清质量、温度不恒定、pH不稳定、病毒污染等的影响，由原来的正常二倍体核型会变成多倍体或异倍体核型，细胞的生长特性也随之发生改变获得永生化，失去接触抑制，可无限制繁殖传代，但核型的改变不仅时间长（超过3个月）、出现频率低（10-6～10-4），而且还要直接涉及细胞DNA或基因发生改变，因而这种变化可稳定地遗传下去，代代相传。
七、细胞获得不死性就是癌变了吗？
原来二倍体核型的体外培养细胞的正常寿命为（65±15）代，在培养中通过基因突变而导致的某些获得不死性的细胞，这样的细胞是否就是癌细胞了呢？从原因看两者均是基因突变导致的，从特点看也皆为无限增殖，但答案是否定的。因为细胞在培养的环境中受到一定诱变因素影响后，虽然会使基因诱发突变，使遗传特性、生长特性、生物学性状均发生了改变而获得新的性状，也失去了正常细胞的接触抑制和寿命限制，但经大量动物致癌试验，却无致癌性，这说明获得不死性的细胞并非就是恶性肿瘤细胞，它们之间还是有着本质的区别。
八、培养动物细胞全部用血清可以吗？用猪血清行吗？
动物细胞培养所用的合成培养基的配制对于中学来说其实是一大难题，购买也不很方便，要是能全部用血清且是猪、鸡等动物的血清的话则难题就攻克了。然而，血清虽对细胞生长极为重要，但其成分复杂，作用机制尚未完全了解，其中有些成分对细胞生物学反应是不利甚至是有害的，所以，在培养液中血清使用的浓度一般为10%～20%。另外，所用血清最常用的是小牛（6个月小牛或出生5 d内新生小牛或210～300 d胎牛）血清，因为，除了其营养价值较其他动物血清高以外，关键还在于牛的胎盘能阻止母体的免疫球蛋白进入胎牛而没有抗体等的抑制效应物质，因此，我们纵然有足够的猪、鸡等动物的血清，全用血清培养恐怕难获成功。
九、培养箱是怎样维持培养液pH？
教材采用将松盖的培养瓶放入通有含95%空气加5%的混合气体的培养箱中，以确保培养液pH7.2～7.4的适宜生长条件。但学生不易理解和接受，因为他们只知道果酒制作过程中的通过松盖排出高气压的，而想不通这里在基本上没有压力差的情况下，能通过松盖来为培养瓶内的培养液提供且维持pH值的基本稳定。教学中要让学生观察出所用培养瓶的颈是弯的，这可保证培养瓶能水平放置；再让学生观察出培养液的厚度是小的，这说明总的培养液体积并不大；还要让学生想得出盖松而不开的目的是为了无菌，因此就可以将瓶盖拧得十分的松动，事实上，这么薄层的培养液，用如此高的环境，维持pH值的稳定在实验中仅是简单的松一下盖子便可以了。
十、动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？
脱分化是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程，也就是说脱分化的细胞具有发育成任何组织的能力，但高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，虽然动物细胞培养有多种用途，但所有分化细胞的培养均没有了培养成完整动物个体的设想。所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了，或者说，同一植物不同组织的细胞经脱分化后增殖产生的细胞其形态和结构是基本相同的，而同一动物不同组织不经脱分化后增殖产生的细胞是基本不同的。