王欣丽[1]2004年在《紫外线诱导小麦条锈菌致病性突变及其突变菌系的RAPD分析》文中指出由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp. tritici）引起的小麦条锈病是我国小麦生产上最重要的病害，造成严重的产量和经济损失。种植抗病品种是当前防治小麦条锈病最经济有效的措施，但抗病品种常因小麦条锈菌新小种的不断产生和发展而“丧失”抗锈性。新小种产生主要是由于毒性变异所致，一般认为小麦条锈菌的毒性变异是通过基因突变、异核作用等途径发生的，其中基因突变是产生新的毒性基因的唯一途径。由紫外线照射引起的小麦条锈菌变异的生物学效应，前人已进行了研究，但尚未见对变异在分子水平上的研究报道，RAPD是揭示基因组DNA差异的有效方法，可以对整个基因组进行多态性检测，对单一引物来讲，DNA扩增片段的差异反映了基因组水平的差异，因此，本研究通过紫外线处理小麦条锈菌获得致病性变异的突变体，进而用RAPD技术对突变体进行分析，从而为研究小麦条锈菌的毒性基因变异机制奠定基础。并通过苗期接种试验，进一步明确致病性变异菌系预测小麦品种抗锈稳定性的可能性。1. 用紫外线以不同时间处理小麦条锈菌水源致病类型1-4、条中29-3、条中23-2，当夏孢子致死率达90%左右时，确定为最适诱变时间分别为12min、8min、5min。以紫外线12min处理水源致病类型1时，经6批次筛选未获得突变体。以8min处理条中29-3，得到在Hybrid46上表现3型的菌系，在尤皮Ⅱ号上表现4型的菌系和在阿夫上表现2型的菌系，分别命名Hybrid46菌系、尤Ⅱ菌系和阿夫菌系，叁菌系经4代转接该品种，最后获得2个稳定的突变菌系，包括毒性突变产生的尤Ⅱ菌系和非毒性突变产生的阿夫菌系。以5min处理条中23-2得到两个突变菌系：在尤皮Ⅱ号上表现3型的菌系和在水源11上表现2型的菌系，分别命名为尤Ⅱ-23菌系和水源11菌系，其中尤Ⅱ-23菌系经4次转接仍保持毒性。以上获得的叁个稳定突变菌系经鉴别寄主鉴定，毒性谱均发生了较大变化。2. 对原始菌系和突变菌系进行RAPD分析后发现，条中29-3的突变菌系尤Ⅱ菌系、阿夫菌系与原始菌系DNA之间的多态性存在显着差异，多态率分别为10.58%和11.57%；条中23-2的突变菌系尤Ⅱ-23菌系与原始菌系DNA的多态性差异亦为10.73%，由此可知紫外线可使小麦条锈菌基因组DNA发生广泛的变异且突变位点比较复杂。3. 通过用条中29号、条中31号和条中32号及条中29号的两个突变菌系、条中23号的突变菌系对2004年黄淮麦区区试品种进行苗期抗锈性鉴定，明确致病性变异菌系预测小麦品种抗锈稳定性的可能性。用混合菌系（条中29、条中31、条中32、水源致病类型14）进行成株期鉴定后与苗期比较发现，苗期仅有一个品种周麦17对叁小种均表现抗病而成株期有10个品种表现抗病，大部分可能为慢锈型或高温抗锈性品种。
王国芬[2]2004年在《化学诱导小麦条锈菌毒性突变研究》文中提出小麦条锈病是我国小麦上最重要的病害之一，小麦条锈病菌的毒性变异是造成小麦品种抗锈性丧失导致病害流行主要原因。关于锈菌的毒性变异机制已提出了多种途径，普遍认为突变是产生新毒性基因的主要途径。由于在自然界中尚未发现小麦条锈菌的有性态，对由于毒性基因的突变而产生的新小种很难进行深入的遗传分析，所以关于小麦条锈菌的毒性变异研究较其它锈菌少，而关于毒性突变研究则更少。本研究应用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)对小麦条锈菌夏孢子进行诱变处理，对小麦条锈菌受诱变剂影响的各项生物学效应和毒性突变的特点进行研究，主要取得了以下几项结果： 1. 建立了化学诱导小麦条锈菌毒性突变的优化体系：研究中发现诱变剂对处理当代条锈菌夏孢子的各项生物学特性有明显的削弱性影响，使其夏孢子存活力降低，致病力减弱和繁殖能力下降。不同处理时间和浓度的夏孢子萌发率经 CurveExpert(1.3)MMF 和Harris 两个模型拟合的曲线为倒 S 型，表明小麦条锈菌夏孢子萌发率在 EMS 处理的浓度曲线和时间曲线上均有一个最适拟合系数，且夏孢子对低剂量 EMS 十分敏感。据此构建的 EMS 对小麦条锈菌毒性突变的优化体系为：室温下，pH＝7.0，C=0.03mol/L ,T=6～8min。小麦条锈菌夏孢子在此处理环境下的致死率在 80%～90%之间，根据微生物诱变筛选最佳诱变剂量的选择标准，上述参数可作为小麦条锈菌化学诱变的主要参量。 2. 筛选了具有不同毒性变异特点的小麦条锈菌 CY17 和 CY31 突变菌系：CY17 有 5个毒性突变菌系17M1～17M5，17M1中9个突变菌株都对早洋发生了无毒性突变；17M2对维尔发生了毒性突变；17M3 对南大 2419 发生了毒性突变；17M4 同时对南大 2419和水源 11 都发生了毒性突变；17M5 对阿勃、水源 11 也同时为毒性突变。CY31 有 4个毒性突变菌系 31M1～31M4，31M1 中 6 个菌株对尤二和 T.E 为毒性突变体，31F14-1对丹麦 1 号只为中感，而 31MutS1是 CY32；31M2 对多个品种产生了无毒性突变；31M3和 31M4 分别为两个无毒性突变体 31C7-1和 31C7-2，它们在繁殖一代时对其筛选品种中四有致病能力，但在繁殖 3～4 代后，其致病力丧失，且对大部分鉴别寄主的反应型也随着降低，表明了 EMS 的多位点诱变作用。聚类图表明各突变菌系与其原始菌株的相关系数都在 85%以上，每个菌系中都有对不同品种发生多种微小突变的菌株，说明突变菌系与原始菌株既有一定的同源关系，又有微小的毒性变异区别，是化学诱变剂 EMS诱导单点突变和逐步突变后的结果。而且 CY17 以无毒性突变体居多，CY31 则以毒性突变体居多, 表明诱导后的弱毒菌株多为无毒性突变，而强毒性小种则主要为毒性变异。 3. 研究了突变体与其原始菌株的寄生适合度：发现 CY17 各突变菌株之间的差异主要显示在夏孢子的生活能力和夏孢子在小麦叶片上的侵染和扩展能力上。根据贡献值排
王阳[3]2007年在《小麦条锈菌遗传转化体系的构建》文中指出小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis West. f.sp tritici)引起的气流传播性病害,是世界各主要麦区,也是我国小麦上最重要的病害和主要监控研究对象。国内外研究和生产实践证明,种植抗锈良种是综合控制小麦条锈病最经济、有效、易行和对环境安全的核心措施。但是小麦条锈菌毒性变异频繁,可以通过变异产生新的毒性小种,导致小麦品种抗病基因失效,引起小麦条锈病周期性流行危害。因此,阐明小麦条锈病菌毒性变异的原因和规律,提出有效对策,以延长小麦品种使用寿命,是小麦条锈病防治和小麦育种中亟需解决的关键问题。小麦条锈菌主要是通过突变和异核作用产生致病性变异,病原菌突变体库的构建是对其进行分子遗传分析的重要手段,也是克隆致病相关基因的捷径。本研究探索了产生小麦条锈菌突变体的途径,建立了一套有效的条锈菌遗传转化体系,主要研究结果如下:1.比较了电击转化,EMS化学诱变以及基因枪轰击产生条锈菌毒性突变体的效果,结果表明,电击转化不能有效的产生条锈菌毒性突变体,EMS化学诱变以及基因枪轰击均可有效的产生毒性变异,可以用来建立转化体系。2.建立了化学诱导小麦条锈菌毒性突变的最佳体系:研究中发现诱变剂对处理当代条锈菌夏孢子的各项生物学特性有明显的削弱性影响,使其夏孢子存活力降低,致病力减弱和繁殖能力下降。不同处理时间和浓度的夏孢子萌发率经CurveExpert(1.3)MMF和Harris两个模型拟合的曲线为倒S型,表明小麦条锈菌夏孢子萌发率在EMS处理的浓度曲线和时间曲线上均有一个最适拟合系数,且夏孢子对低剂量EMS十分敏感。据此构建的EMS对小麦条锈菌毒性突变的最佳诱导体系为:室温下,pH=7.0,C=0.03mol/L,T=6-8min。小麦条锈菌夏孢子在此处理环境下的致死率在80%～90%之间,根据微生物诱变筛选最佳诱变剂量的选择标准,上述处理可作为小麦条锈菌化学诱变的主要参数。3.建立并优化了小麦条锈菌基因枪法转化体系:影响基因枪转化率的因素很多,包括微弹的速度、射程、金粉用量、小麦条锈菌夏孢子的密度和水化时间、轰击时的氦气压,爆破膜承载压力,金粉颗粒的直径等多种因子。本实验研究表明在爆破膜承载压力为650、900Psi,爆破膜与承载膜之间的距离为2.5cm,承载膜与阻挡网之间的距离为0.8cm,阻挡网与靶细胞之间的距离为6cm,氦气压力2.7×104 Pa以及金粉颗粒直径为0.6μm时,萌发率较高但是转化率低,而在爆破膜承载压力为1100、1350和1550 Psi,爆破膜与承载膜之间的距离2.5cm,承载膜与阻挡网之间的距离为0.8cm,阻挡网与靶细胞之间的距离为6cm,氦气压2.7×104Pa以及金粉颗粒直径为0.6μm时,萌发率相对较低但是转化率较高。此外,在对小麦条锈菌转化体系的其它条件研究发现,每一枪锈菌用量0.2mg,金粉用量每枪500μg,质粒1μg,水化2h时所得转化率较高,以上结果作为基因枪转化小麦条锈菌的主要参数。4.明确基因枪法转化条锈菌后报告基因的瞬时表达特点:以携带报告基因GUS基因的质粒(pGUS6L20)转化小麦条锈菌,随爆破膜承载压力增大GUS基因瞬时表达率逐渐升高,小麦条锈菌夏孢子在承载膜压力为1100、1350、1550psi下时均可瞬时表达。在1350psi和1550psi爆破膜承载压力下转化率相对较高可达到0.2%和0.34%,但是转化后的夏孢子萌发率只有25%左右。还发现x-gluc染色后,有些孢子颜色呈深蓝色,有些孢子则呈浅蓝色,表明在锈菌孢子中GUS的拷贝数和表达量有差别。以携带抗性基因hpt的质粒(pKLHyg14)转化条锈菌夏孢子,在爆破膜承载压力为650Psi、900Psi、1100Psi下,转化后的条锈菌夏孢子在含有50μg/ml潮霉素B的培养基上的萌发率都比对照有显着的提高,说明hpt抗性基因已在夏孢子中表达。因此报告基因GUS和抗性基因hpt均可作为条锈菌转化体的筛选标记。5.筛选了具有不同毒性变异特点的小麦条锈菌CY17和CY31突变菌系:CY17有4个毒性突变菌系17M1～17M4:17M1中7个突变菌株都对早洋发生了无毒性突变;17M2对南大2419发生了毒性突变;17M3同时对南大2419和水源11都发生了毒性突变;17M4对阿勃、水源11也同时为毒性突变。CY31有3个毒性突变菌系31M1～31M3:31M1中5个菌株对尤二和T.E为毒性突变体、31F14-1对丹麦1号只为中感,而31MutS1是CY32; 31M2和31M3分别为两个无毒性突变体31C7-1和31C7-2,它们在繁殖一代时对其筛选品种中四有致病能力,但在繁殖3～4代后,其致病力丧失,且对大部分鉴别寄主的反应型也随着降低。表明了EMS的多位点诱变作用。聚类图表明各突变菌系与其原始菌株的相关系数都在85%以上,每个菌系中都有对不同品种发生多种微小突变的菌株,说明突变菌系与原始菌株既有一定的同源关系,又有微小的毒性变异区别,是化学诱变剂EMS诱导单点突变和逐步突变后的结果。而且CY17以无毒性突变体居多,CY31则以毒性突变体居多,表明诱导后的弱毒菌株多为无毒性突变,而强毒性小种则主要为毒性变异。6.基因枪法转化条锈菌毒性突变体的获得及其生物学特性:以小麦条锈菌白化单孢菌系-5为转化受体,以分别含有GUS基因和潮霉素抗性基因(hpt)的质粒为载体,采用基因枪法转化小麦条锈菌。以携带报告基因GUS基因的质粒pGUS6L20转化小麦条锈菌后,在可裂膜为1350和1550Psi时,检测到GUS基因在其后代中表达;以携带抗性基因hpt的质粒pKLHyg14转化小麦条锈菌后,在可裂膜为1100Psi时,得到两个稳定的毒性突变菌株M1100-4-2、M1100-4-3。M1100-4-2菌株对南大2419的毒性减弱,反应型由野生菌系的4型变为2型;M1100-4-3菌株在南大2419的反应型由野生菌系的4型变为2 ,3型,毒性发生分化。采用中国鉴别寄主对突变体的毒性研究表明,各突变菌株的毒性均较原始菌系发生了明显改变。转化获得的突变体生物学特性发生了较大的变异,对多数筛选品种的毒性丧失,且潜育期延长。进一步用Hyg基因特异PCR在两个突变菌系中均扩增到目的片段,表明M1100-4-2、M1100-4-3的突变是由Hyg基因插入引起的。本项目采用化学诱变法建立了小麦条锈菌毒性突变菌系,采用基因枪轰击导入外源基因标记,获得条锈菌致病性变异的突变体,建立了条锈菌致病性遗传研究新的技术体系,为条锈菌毒性基因的克隆和阐明条锈菌毒性变异的机理奠定了基础。
王欣丽, 朱飞, 黄丽丽, 魏国荣, 康振生[4]2009年在《紫外线诱变对小麦条锈菌致病性突变的影响》文中研究表明为深入了解紫外线对小麦条锈菌致病性突变的影响,用不同时间的紫外线处理小麦条锈菌条中23-2,当夏孢子致死率达90%左右时确定为最适诱变剂量,为5min。紫外线处理条中23~25min得到2个突变菌株:在尤皮Ⅱ号上表现3型的菌株和在水源11上表现2型的菌株,分别命名为尤Ⅱ-23菌株和水源11菌株,其中尤Ⅱ-23菌株经4代转接仍保持毒性,水源11菌株经2代转接后发生回复突变。尤Ⅱ-23菌株在鉴别寄主上的反应型与野生菌系相比发生了较大变化,在测试品种上的毒性范围仅次于条中32号。对野生菌系和突变菌株进行RAPD分析发现,两者间的DNA多态性存在明显差异,多态率为10.73%。为进一步研究小麦条锈病的流行规律和致病性变异机制奠定了基础。
卢丽丽[5]2008年在《基因枪法导入GUS基因诱导小麦条锈菌毒性突变的研究》文中认为小麦条锈病是世界各小麦产区最重要的病害之一,种植抗病品种是防治小麦条锈病最经济有效的措施,但是其病原小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici)毒性变异频繁,可以通过变异产生新的毒性小种,导致小麦品种抗病基因失效,引起小麦条锈病周期性流行危害。一般认为小麦条锈菌毒性变异的主要途径是基因突变和异核作用,其中基因突变是产生新的毒性基因的唯一途径。因此,深入开展小麦条锈菌的致病相关基因的研究,对解决小麦品种抗病性丧失问题有着十分重要的理论和实践意义。本研究采用基因枪转化法以带有β-葡糖醛酸酶(GUS)报告基因的质粒pGUS6L20转化小麦条锈菌,进一步优化条锈菌遗传转化体系,分离和筛选小麦条锈菌毒性突变体,研究突变体的生物学特性。获得如下研究结果:1.优化了小麦条锈菌基因枪法转化体系:为了提高基因枪的转化率,本研究对CYR29遗传转化体系中主要参数进行了优化,得到最优体系为采用PDS-1000/ He基因枪(Bio-Rad),轰击前小麦条锈菌夏孢子在4℃下萌动2～2.5h,每枪夏孢子用量为0.7mg,金粉(直径为0.6μm)用量为350μg,质粒DNA为1μg,最适轰击压力为1100 psi,较适轰击压力为900psi和1350psi,轰击时真空度为2.7×104Pa,爆裂膜与承载膜之间的距离为2.5cm,承载膜与阻挡网之间的距离为0.8cm,阻挡网与靶细胞之间的距离为6cm。2.探索小麦条锈菌夏孢子转GUS基因遗传转化体的分离方法:以从菌种筛选品种上分离转化体法为主,从繁殖品种辉县红上分离转化体法为辅可有效提高转化体的检出率。同时本研究建立了利用透明胶带粘取夏孢子并通过染色分离小麦条锈菌转GUS基因转化体的新方法。3.获得了GUS基因瞬时表达菌株和毒性突变菌株:采用基因枪转化法以带有β-葡糖醛酸酶(GUS)报告基因的质粒pGUS6L20转化小麦条锈菌CYR29,在转化当代条锈菌中得到了GUS瞬时表达的菌株;连续继代转接培养后,在转化后T1和T2代条锈菌中检测到了GUS基因稳定表达的菌株;利用GUS报告基因和毒性标记相结合的方法,经过叁代筛选鉴定在小麦条锈菌中国鉴别寄主尤皮Ⅱ号上获得了MJ-4和MJ-7两个稳定的毒性突变体,在抗引655上获得了MK-2和MK-3两个稳定的毒性突变体;4个突变菌株对筛选品种都发生了毒性突变,MK-2引起的反应型变化为0→3型,MJ-4、MJ-7和MK-3引起的反应型变化为0→4型。经PCR及PCR -southern blot证实外源片段已整合到毒性突变菌株的基因组中。突变菌株经鉴别寄主和近等基因系鉴定,毒性谱均发生了较大变化。研究表明基因枪转化法是获得条锈菌毒性突变体的有效方法。本研究采用基因枪轰击导入外源标记基因,获得了优化的条锈菌遗传转化体系和条锈菌毒性变异的突变体,为条锈菌毒性基因的克隆和阐明条锈菌毒性变异的机理奠定了基础。
张亮[6]2009年在《华山新麦草附加系抗条锈病基因的遗传作图和小麦条锈菌毒性突变体的研究》文中研究指明小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp tritici)引起的危害广泛的一种小麦病害之一。在世界主要小麦产区均有发生,在我国西北、西南、华北、黄淮海等地冬麦区和西北春麦区流行,流行年份减产可达小麦产量的20-30%,造成了巨大损失。研究和生产实践证明,种植优良抗锈品种是控制该病害最有效、经济、易行和对环境友好的措施,但是由于小麦条锈菌的毒性高度变异性,使新的抗病品种总逃脱不了抗病基因丧失的厄运,形成了抗病新基因不断被新小种克服的恶性循环。由于来自小麦的抗条锈病基因有限,将研究的焦点集中于小麦近缘属的抗病基因开发。华山新麦草(Psathnrostachys huashanica Keng,2n=14)是分布于我国秦岭山脉华山段的一个特有物种,具有耐旱、耐寒、耐瘠薄、抗病、优质等特点。本文第一篇首次对小麦-华山新麦草附加系的抗条锈性进行遗传分析和抗病基因的SSR分子作图,并对这个附加系材料及其后代进行了染色体数目的检测,以确定该附加系是否稳定遗传。阐明小麦条锈病菌毒性变异的规律,揭示其毒性基因性质及其结构,对评价与其相匹配的小麦抗条锈病基因的寿命,在理论和实践中具有重要的意义。本文第二篇通过插入基因表达检测、pcr电泳检测和southern杂交3种手段,对前人采用基因枪诱变得到的毒性突变菌株做了插入验证,并利用9个国内鉴别寄主和42个黄河灌区主栽品种对3个突变菌株做了毒性普的测定。同时从southern杂交结果中分析GUS(β-葡糖醛酸酶基因)片段插入的拷贝数,研究了突变菌株的遗传稳定性及其毒性变异特点。主要研究结果:1、用我国当前流行的小麦条锈菌生理小种条中29、30、31、32、su11-4、和su11-11的单孢菌系评价了H9014-121-5-5-9抗病性,分析了其与感病品种铭贤168杂交后代F2的抗病性遗传规律,结果表明附加系H9014-121-5-5-9对这6个生理小种都表现高度的抗病性,对条中29、30、SU11-4和SU11-11的抗病性由两对互补的显性基因控制,对条中32的抗病性由两对显性基因控制,对条中31号的抗病性由1对显性核基因控制,并将其的CYR31的抗病基因暂命名为YrHA。用SSR技术标记对202株F2分离群体进行连锁作图。从220对SSR引物中筛选到在1AL上的3个分子标记Xwmc312、Xwmc59和barc240,它们位于该基因的两侧,与目标基因之间的遗传距离分别为6.0 cM、8.2 cM和15.9 cM。根据对H9014-121-5-5-9及其杂交后代的染色体数目鉴定结果推测,此材料已经从附加系转化为可稳定遗传的易位系或代换系。因此这些标记可用于小麦抗条锈病基因的分子标记检测和分子辅助选择育种。2、本研究对通过基因枪插入突变获得的3个突变菌株,进行插入报告基因的表达检测、PCR电泳检测和southern杂交检测,证实了3个突变菌株均为插入质粒pGUS6L20的GUS序列的毒性突变菌系,证明早期用基因枪转化的毒性突变株可稳定遗传,且插入序列在突变菌内并非单拷贝。利用具有9个抗病的国内鉴别寄主和42个黄淮麦区主栽品种对3个突变菌系的毒性谱进行分析,结果发现其毒性变化复杂,毒性突变菌株对多个品种发生毒性突变,对少数品种的毒性明显提高,对个别品种丧失毒性,其毒性谱与野生菌系明显不同,说明插入突变对条锈菌的致病基因产生严重影响,导致其致病表型发生重大变化。
张勃[7]2008年在《小麦条锈菌生理小种RAPD体系优化及CY32的SCAR标记的建立》文中研究表明小麦条锈病是危害最严重的小麦流行性病害之一。由于条锈菌生理小种的变异,常常造成大面积推广品种“丧失”抗锈性,导致条锈病的大流行。研究表明条锈菌新小种的产生和发展是引致小麦抗病性丧失的主要原因。因而,监测小麦条锈菌生理小种的类型及小种组成的变化对于小麦条锈病的综合防治及抗病品种的选育具有重要的实际意义。小麦条锈菌属专性寄生菌,其遗传特征十分复杂,至今未发现其有性世代,不能人工培养。常规的生理小种鉴定的方法繁杂、费工费时,准确性易受到鉴定条件的影响;同时,由于鉴别寄主的数目相对有限,很难区分、鉴定出发生频率低的小种(致病类型)以及混杂在其它小种内的致病类型。这些都严重制约了条锈菌群体生物学的研究。分子生物学的发展为监测各地生理小种的组成及变异动态提供了新的方法。鉴于小麦条锈菌是专化性寄生菌,尚未发现其有性阶段,本文拟采用RAPD技术,通过揭示小麦条锈菌生理小种间及生理小种内的遗传多样性,寻找主要流行小种的特异性分子标记,从而为建立具有实用价值的中国小麦条锈菌生理小种的快速分子检测体系奠定基础。本文取得了以下主要结果:对小麦条锈菌的RAPD反应条件进行了优化,建立了适用于小麦条锈菌的标准化RAPD反应体系。多批次的扩增实验证明该反应体系的稳定性好,重复性强。选用了99条10碱基随机引物,发现其中51条引物可以得到稳定清晰的扩增图谱。对中国小麦条锈菌12个主要生理小种的单孢菌系进行的RAPD分析表明:中国小麦条锈菌各生理小种间的遗传变异丰富,但一些基因组区段仍具有一定的保守性。而生理小种内不同单孢分离系间没有RAPD谱型的差异,生理小种内的遗传基础相对一致。寻找到了条中32号的特异性RAPD标记,并进行了单孢菌系的验证。通过对条中32号特异RAPD片段的回收、克隆和测序,设计了两对特异PCR引物,成功获得条中32号小种专化的SCAR标记。上述结果表明通过大规模寻找小麦条锈菌生理小种的特异性RAPD片段,可以建立起中国小麦条锈菌流行生理小种的分子鉴定、检测体系,简化常规鉴定的繁琐程序,缩短鉴定周期,这对及时准确了解条锈菌群体的组成与时空变化,客观认识小麦条锈菌的群体生物学特性,控制锈病流行以及抗病品种的选育、布局具有重要意义。
王保通[8]2007年在《中国小麦条锈菌优势种群预测及主要流行菌系的AFLP指纹分析》文中认为小麦条锈病是我国小麦上最重要的病害之一。由于条锈菌生理小种的变异,常常造成大面积推广品种“丧失”抗锈性,导致条锈病的大流行。自上世纪50年代以来,我国已发生至少7次大面积推广品种丧失抗锈性而被更替。监测小麦条锈菌种群动态及准确预测未来优势种群,可为小麦条锈病的预测预报和抗病育种提供重要的科学依据。然而,并非所有新出现的病菌类型都能成为生产上的优势小种。它与病菌自身的毒力、致病范围、寄生适合度、大田推广品种的抗锈性和播种面积等条件有密切关系。本研究针对我国上世纪90年代以后新出现的小麦条锈菌主要小种类型,系统研究了条锈菌生理小种监测及变异动态、新出现小种(类型)的致病率、主要后备小麦品种对条锈菌流行种群的抗锈性评价以及主要流行种群寄生适合度等,通过不同方法相互印证,综合评价我国未来小麦条锈菌优势种群种类,并对小麦条锈菌主要流行菌系进行AFLP指纹分析。试验得出以下结果:1.对2001-2005年小麦条锈菌生理小种进行监测,结果认为,我国目前小麦条锈菌生理小种(类型)主要集中在Hybrid46类群和水源11类群,主要小种(类型)为CY32、SU14、SU4和CY31。CY30号以前的小种已经成为次要或稀有小种。从变化趋势看,Hybrid46类群频率逐渐下降,水源11类群逐渐上升;其中SU14、SU4出现频率上升较快。2.对不同省份标样结果分析认为,我国小麦条锈菌菌源基地的甘肃省,Hybrid46类群和水源11类群均表现相对平稳的变化态势, Hybrid46类群频率低于全国平均水平,而水源11类群高于全国平均水平且有上升趋势;而云南省与甘肃省结果正好相反。从病菌传播途径和地理位置分析可以推测,病菌变异首先开始于甘肃省,然后逐渐向陕西、四川,云南等周边省份传播。3.首次发现了3份能够稳定感染“中四”的条锈菌新菌系。经对我国主要后备品种、陕西省主栽品种和含有“中四”血缘的衍生系进行毒性范围测定认为,该菌系虽然能感染中四及其中四衍生系小麦,但它对目前生产品种和后备品种的致病力较弱、致病范围较窄,经成株期鉴定,我国目前后备小麦品种仅有6.5%的品种能够被感染。毒性范围远远低于目前条锈菌流行菌系。可以推测,该菌系不会很快成为我国小麦条锈菌的优势种群,中四及其易位系小麦作为条锈病的抗源仍有一定的利用价值。4.对陕甘川豫四省的后备小麦品种的抗锈性进行聚类分析认为:四川省后备品种对我国目前流行小种(类型)的抗性表现良好,其中免疫-近免疫的品种占到80.82%,抗病基因类型较丰富;其次为陕西省和甘肃省的品种,抗性也比较好,全免疫品种分别占到52.73和50.0%,但是抗性类型相对单一;河南省后备小麦品种抗锈性较差,全免疫品种仅占22.22%,全部感染的占到了61.11%。总体来看,我国后备小麦品种抗锈性较生产品种明显提高。5.测定了我国条锈菌流行小种(类型)的寄生适合度属性,并进行主成分分析,结果表明:决定条锈菌生理小种最重要的寄生适合度属性为产孢能力(繁殖力),主要由产孢期和产孢强度决定;其次为侵染能力,由花斑数代表;再次为条锈菌与寄主互作后在体内扩展能力,由潜育期代表。而孢子的萌发率,小种间差异不大;首次建立了我国小麦条锈菌生理小种寄生适合度属性叁个主成份的数学模型,通过该模型可直接计算出某一小种的产孢能力、侵染能力和扩展能力。经综合评价以SU4、SU14和CY32相对适合度较高;新出现的T4类型,由于其相对寄生适合度低,不会成为我国今后一个时期的流行小种。6.利用AFLP技术,对我国条锈菌主要流行菌系特别是水源11类群进行指纹分析,并与毒性分析结果比较,结果表明:小麦条锈菌流行菌系之间无论是毒性特征还是DNA分子特征都存在丰富的遗传变异,但两种特征是不相关的;DNA指纹分析结果表明:SU14与CY22、SU1、SU4和SU6与CY31具有较近的起源关系,这或许暗示这些所谓新类型很可能和已知的菌系是平行进化的。
张如佳[9]2007年在《基因枪介导小麦条锈菌毒性突变的研究》文中研究指明小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis West. f.sp tritici)引起的气流传播性病害,是世界各主要麦区,也是我国小麦上最重要的病害和主要监控研究对象。国内外研究和生产实践证明,种植抗锈良种是综合控制小麦条锈病最经济、有效、易行和对环境安全的核心措施。但是小麦条锈菌毒性变异频繁,可以通过变异产生新的毒性小种,导致小麦品种抗病基因失效,引起小麦条锈病周期性流行危害。因此,阐明小麦条锈病菌毒性变异的原因和规律,是小麦抗病育种,延长小麦品种使用寿命,防治小麦条锈病亟需解决的关键问题。小麦条锈菌主要是通过突变和异核作用产生致病性变异,构建病原菌突变体库是对其进行分子遗传分析的基础,也是克隆致病相关基因的捷径。本研究探索了插入突变产生小麦条锈菌突变体的途径,建立了一套有效的条锈菌遗传转化体系,主要研究结果如下:1.建立了小麦条锈菌基因枪法转化体系:本研究对影响基因枪轰击转化率的爆裂膜承载压力、射程、金粉用量、金粉颗粒的大小、小麦条锈菌夏孢子的密度和水化时间以及轰击时的氦气压等多种因子进行了优化。建立了优化的小麦条锈菌基因枪法转化体系:轰击前将0.2mg夏孢子均匀的涂布于12cm面积的琼脂糖培养基表面,置于4℃下水化2h。1μg质粒DNA包裹500μg直径为0.6μm的金粉颗粒为轰击体。最适爆裂膜承载压力为1100和1350psi,爆裂膜与承载膜之间的距离为2.5cm,承载膜与阻挡网之间的距离为0.8cm,阻挡网与靶细胞之间的距离为6cm,氦气压为2.7×104Pa。2.明确基因枪法转化条锈菌后报告基因的瞬时表达特点,确认GUS基因和潮霉素抗性基因hpt均可作为条锈菌转化体的筛选标记:以携带GUS基因的质粒(pGUS6L20)转化小麦条锈菌,GUS基因在经爆裂膜承载压力为900、1100、1350、1550psi时所转化的小麦条锈菌夏孢子中均有表达,随爆裂膜承载压力增大GUS基因瞬时表达率逐渐升高。经爆裂膜承载压力为1350和1550psi处理后,GUS基因在夏孢子中的表达率相对较高可达到0.2%和0.34%,但是转化后的夏孢子萌发率却只有25%左右。同时还发现经X-Gluc染色后,有些孢子颜色呈深蓝色,有些孢子则呈浅蓝色,表明在锈菌孢子中GUS基因的拷贝数和表达量有差别。以携带潮霉素抗性基因hpt的质粒(pKLHyg14)转化条锈菌夏孢子,在爆裂膜承载压力为650、900、1100psi时,转化后的条锈菌夏孢子在含有50μg/mL潮霉素B的培养基上的萌发率都比对照有显着的提高,说明hpt基因已在夏孢子中表达。因此GUS基因和潮霉素抗性基因hpt均可作为条锈菌转化体的筛选标记。3.获得了基因枪法转化的条锈菌毒性突变体:以小麦条锈菌白化单孢菌系-5为转化受体,以分别含有GUS基因和潮霉素抗性基因(hpt)的质粒为载体,采用基因枪法转化小麦条锈菌。以携带GUS基因的质粒pGUS6L20转化小麦条锈菌,经爆裂膜承载压力为1350和1550psi处理后,在其后代中检测到GUS基因表达,随着代数的增加表达量减少,叁代后检测不出来。以携带潮霉素抗性基因hpt的质粒pKLHyg14转化小麦条锈菌后,经爆裂膜承载压力为1100psi处理后,得到两个稳定的毒性突变菌株M1100-4-2、M1100-4-3。M1100-4-2菌株对南大2419的毒性减弱,反应型由野生菌系的4型变为2型;M1100-4-3菌株在南大2419的反应型由野生菌系的4型变为2、3型,毒性发生分化。采用中国鉴别寄主对突变体的毒性研究表明,各突变菌株的毒性均较原始菌系发生了明显改变。进一步用hpt基因特异PCR在两个突变菌株中均扩增到目的片段,初步证明M1100-4-2、M1100-4-3的突变是由hpt基因插入引起的。本项目采用基因枪轰击导入外源标记基因,获得条锈菌致病性变异的突变体,建立了条锈菌致病性遗传研究新的技术体系,为条锈菌毒性基因的克隆和阐明条锈菌毒性变异的机理奠定了基础。
裴静宇[10]2006年在《小麦条锈菌异核现象研究及SSR分子标记建立》文中进行了进一步梳理小麦条锈病是由小麦条锈菌引起的小麦叶部病害，该病害发生面积广，流行频率高，危害严重。我国小麦条锈病流行体系是一个相对独立的体系。目前，防治小麦条锈病主要是使用抗病品种和化学防治，但不论是利用抗病品种还是化学防治，都必须快速及时了解小麦条锈菌生理小种的动态或毒性变异趋势。关于体细胞重组(异核作用)前人有了一些初步研究，但到底是否可通过体细胞重组导致毒性变异没有确切的理论依据。本研究利用10个菌系以及白化菌进行了体细胞重组产生新菌系的筛选。并利用24对SSR引物对异核菌系和我国小麦条锈菌主要流行小种进行了DNA多态性分析。 1．在进行异核菌系筛选过程中，有四个组合筛选出了异核菌系。即1号菌系、2号菌系、3号菌系、4号菌系。新菌系的毒性特征明显不同于对应原始菌系。在利用SSR引物RJ24对稳定的4号异核菌系进行分析后，获悉新菌系是通过核的重新组合分配后体细胞杂交(即菌系融合、异核作用)的结果。从分子水平上进一步证实了该新菌系是由两个原始菌系经过异核作用产生的。 2．利用RJ3引物对所选取的15个小麦条锈菌生理小种和叁个国外菌系进行了DNA多态性的分析，可以得到白化菌系不同于其它供试小种的170bp左右的特异性扩增片段，经过参试菌系的重复验证，该特异性片段能稳定清晰再现。为后期研究颜色变异或无毒基因提供了参考。 3．利用SSR引物RJ18对17个小麦条锈菌生理小种21个菌系进行DNA多态性分析，在CY26小种上获得了300bp左右特异性扩增片段。进一步对该片段进行了验证，发现该片段仍仅存在于CY26小种上，初步结果表明RJ18引物可以用于CY26的检测。 4．利用SSR引物RJ4引物对17个小种23个菌系进行DNA多态性分析，获得了CY29小种的210bp左右的特异性谱带，经过参试菌系的重复验证发现，该片段能够在CY29上稳定存在，初步表明RJ4引物可以用于CY29的检测。 5．利用引物RJ20对11个小麦条锈菌生理小种进行筛选时获得长度约为310bp的可能与Yr9毒性谱相关的特异带。经过参试菌系的重复验证发现，该片段能够稳定存在，对研究毒性变异提供了一些参考。 本研究获得的有关小麦条锈菌群体毒性变异和小种的信息，可以为未来研究小麦条锈菌的毒性变异和群体进化及监测提供一些参考和帮助。
参考文献：
[1]. 紫外线诱导小麦条锈菌致病性突变及其突变菌系的RAPD分析[D]. 王欣丽. 西北农林科技大学. 2004
[2]. 化学诱导小麦条锈菌毒性突变研究[D]. 王国芬. 西北农林科技大学. 2004
[3]. 小麦条锈菌遗传转化体系的构建[D]. 王阳. 西北农林科技大学. 2007
[4]. 紫外线诱变对小麦条锈菌致病性突变的影响[J]. 王欣丽, 朱飞, 黄丽丽, 魏国荣, 康振生. 核农学报. 2009
[5]. 基因枪法导入GUS基因诱导小麦条锈菌毒性突变的研究[D]. 卢丽丽. 西北农林科技大学. 2008
[6]. 华山新麦草附加系抗条锈病基因的遗传作图和小麦条锈菌毒性突变体的研究[D]. 张亮. 西北农林科技大学. 2009
[7]. 小麦条锈菌生理小种RAPD体系优化及CY32的SCAR标记的建立[D]. 张勃. 西北农林科技大学. 2008
[8]. 中国小麦条锈菌优势种群预测及主要流行菌系的AFLP指纹分析[D]. 王保通. 西北农林科技大学. 2007
[9]. 基因枪介导小麦条锈菌毒性突变的研究[D]. 张如佳. 西北农林科技大学. 2007
[10]. 小麦条锈菌异核现象研究及SSR分子标记建立[D]. 裴静宇. 吉林农业大学. 2006