张亚宏[1]2009年在《冬凌草甲素及Fas激动型抗体CH11诱导人肿瘤细胞自噬和凋亡调节机制的研究》文中研究说明本文对冬凌草甲素诱导人肿瘤细胞自噬和凋亡的调节机制进行了较为系统的研究,主要阐述了冬凌草甲素在人宫颈癌HeLa细胞和人成纤维肉瘤HT1080细胞中通过不同的途径对自噬和凋亡进行调节。此外,本文还对Fas激动型抗体CH11诱导的HeLa细胞的自噬和凋亡的调节机制进行了初步探讨。结果表明,冬凌草甲素可以诱导HeLa细胞和HT1080细胞同时发生凋亡和自噬。加入冬凌草甲素后,两株细胞均呈现细胞皱缩,浮起变圆,核周边出芽,形成很多凋亡小体等典型的凋亡特征,Hoechst33258荧光染色亦发现细胞核缩小,且染色致密,染色质发生断裂,形成粒状颗粒;同时,两株细胞也发生了自噬,表现为自噬溶酶体的染料MDC募集到胞浆中,自噬相关蛋白Beclinl表达显着增加,而LC3由Ⅰ型向Ⅱ型的转化也增加。然而,冬凌草甲素诱导的自噬和凋亡在这两株细胞中的关系却不尽相同,其对自噬和凋亡的调节机制亦不相同。在HeLa细胞中,冬凌草甲素诱导的自噬是对抗凋亡而发挥保护作用的。加入自噬的特异性抑制剂3-MA后,可以显着的增加冬凌草甲素诱导的细胞生长抑制率及凋亡率。PKC途径在此过程中发挥着促进冬凌草甲素诱导的自噬对抗凋亡的作用。PKC的抑制剂staurosporine在抑制冬凌草甲素诱导的自噬的同时显着增加凋亡率;而用PMA激活PKC后可以促进自噬而抑制凋亡。Raf-1的抑制剂GW5074及JNK MAPK的抑制剂SP600125均可以抑制冬凌草甲素诱导的自噬,并提高凋亡率和细胞死亡率;而ERK和p38 MAPK的抑制剂仅提高冬凌草甲素诱导的细胞死亡,对自噬没有影响。蛋白免疫印迹表明,冬凌草甲素诱导的Raf-1、JNK及p-JNK表达的上调均可被staurosporine所抑制,而PMA却可进一步促进其上调;但是staurosporine却不影响冬凌草甲素诱导的ERK、p-ERK、p38及p-p38表达的下调。可见,在本系统中,PKC是通过调节其下游的Raf-1和JNK来发挥促自噬、抗凋亡作用的。此外,冬凌草甲素可以诱导ROS的产生,ROS发挥促进凋亡和自噬的作用。加入ROS清除剂NAC后,冬凌草甲素诱导的自噬和凋亡均被显着抑制,而且NAC可以逆转冬凌草甲素诱导的Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-8等与凋亡、自噬相关的蛋白表达的改变。经流式细胞术检测,加入冬凌草甲素后1h即有大量的ROS产生,并且其持续增加,这说明ROS为冬凌草甲素诱导HeLa细胞死亡的主导因素。随后,我们还发现在冬凌草甲素诱导的HeLa细胞的自噬和凋亡中,抑制Ras和PARP后可促进自噬和凋亡;抑制NF-κB后自噬和凋亡均被抑制;抑制p53后可抑制自噬,促进细胞死亡;caspase家族、caspase-8和caspase-9抑制剂均可以在抑制凋亡的同时显着提高自噬率;Fas途径在此不起主导作用。在HT1080细胞中,冬凌草甲素诱导的自噬是协同凋亡而促进细胞死亡的。加入3-MA后,可以显着的抑制冬凌草甲素诱导的细胞生长抑制及凋亡率。在此过程中,Ras、Raf-1、ERK、JNK和p38均发挥保护作用,分别抑制它们后,均可以显着提高冬凌草甲素诱导的细胞生长抑制和凋亡;Raf-1和JNK不参与自噬的调节;Ras、ERK和p38发挥抑制自噬的作用。蛋白免疫印迹表明,冬凌草甲素可以时间依赖性的诱导上述蛋白表达的下调;并且Ras抑制剂manumycin A可以进一步诱导Raf-1、ERK和p-ERK的下调,而不影响JNK和p38的表达。可见,Ras通过调节ERK发挥对抗冬凌草甲素诱导的自噬和凋亡的作用。此外,NF-κB的抑制剂PDTC和p53的抑制剂pifithrin-α可以显著抑制冬凌草甲素诱导的自噬和凋亡。蛋白免疫印迹表明,冬凌草甲素可以时间依赖性的激活NF-κB和p53;PDTC可以抑制冬凌草甲素诱导的p53的激活;pifithrin-α则对NF-κB的激活无影响。可见,NF-κB通过调节p53发挥着促进冬凌草甲素诱导的凋亡和自噬的作用。Fas激动型抗体CH11也可以剂量依赖性的诱导HeLa细胞同时发生自噬和凋亡,3-MA抑制自噬后可以显着增加CH11诱导的凋亡率,表明自噬是对抗凋亡的。加入Fas拮抗型抗体UB2可以抑制CH11诱导的自噬和凋亡,提示CH11诱导的自噬和凋亡是Fas介导的。此外,caspase-8抑制剂可以降低CH11诱导的凋亡率和细胞生长抑制,但对自噬没有影响;JNK抑制剂SP600125在抑制CH11诱导的自噬的同时促进凋亡。进一步研究发现,CH11可以剂量依赖的诱导JNK的激活,并且3-MA可以抑制JNK激活。提示,JNK参与了CH11诱导的自噬,其发挥促进自噬、对抗凋亡的作用。总之,本论文探讨了冬凌草甲素和Fas激动型抗体CH11诱导人肿瘤细胞自噬和凋亡的调节机制,首次发现了共同调节自噬和凋亡的信号转导途径,为阐明自噬和凋亡的调控奠定了基础。
阚月一, 王娅杰, 李琦, 李玉洁, 杨庆[2]2018年在《肿瘤发展过程中自噬与凋亡的相互作用》文中指出肿瘤细胞的增殖受细胞程序性死亡的调控,自噬和凋亡同属程序性死亡的两种形式,两者在形态、功能上有显着性差异,但也存在诸多联系,其均与一系列基因的激活、表达和调控相关。本文将结合近年来国内外的研究进展,对自噬的细胞学调控,及其与凋亡相关的分子机制作一综述。旨在通过对其相互关系的归纳总结,为研究细胞自噬在肿瘤发生发展中的作用以及肿瘤相关治疗靶点的发现提供思路与线索。此外,还将探讨自噬和凋亡在肿瘤治疗中的作用并展望自噬在肿瘤治疗中的应用前景。
勾红潮[3]2016年在《线粒体自噬与自噬在猪瘟病毒感染中的作用机制及猪瘟病毒感染的代谢组学研究》文中进行了进一步梳理猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染引起猪的一种烈性传染病,具有急性、热性、高度接触性等特点,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。CSFV强毒株感染可导致典型CSF的发生,临床上以出血综合征与免疫抑制为主要特征。近年来由于中等毒力或弱毒CSFV的出现,导致猪群中发生持续的隐性带毒与免疫抑制等状况,这给CSF的控制与净化带来了更大的困难与挑战。当CSFV感染猪时,单核巨噬细胞和血管内皮细胞虽然是主要的亲嗜性细胞,但CSF发生中出现的免疫抑制主要是由于淋巴B细胞与T细胞的大量减少造成的。淋巴细胞的减少除了与体内的细胞因子紊乱有关外,凋亡的触发也起着重要作用。研究表明,CSFV可通过抑制宿主细胞干扰素的产生与细胞凋亡,实现对亲嗜性细胞的持续感染与病毒的大量复制。近年来,有关CSFV与宿主细胞相互博弈的研究虽然在不断深入,但有关CSF的发病机制与免疫功能紊乱机制仍不清楚。因此,开展CSF的致病机制,特别是CSFV免疫逃逸机制的研究,对CSF的防控具有十分重要的意义。自噬是细胞进化中非常保守的一种防御机制,在病毒感染过程中具有十分重要的作用。最新研究表明,多种病毒都可通过诱导线粒体自噬对细胞内损伤的线粒体进行清除。另有研究表明,自噬对细胞凋亡、细胞内代谢也具有重要的调控作用。我们的前期研究也表明,CSFV感染不但可以诱导细胞自噬的发生,而且可以利用自噬促进CSFV的复制与病毒粒子的释放。在此基础上,本论文一方面通过对CSFV与细胞线粒体自噬相互关系的研究,揭示线粒体自噬对CSFV复制以及细胞凋亡的影响。另一方面还通过对CSFV感染猪脾脏组织内自噬与凋亡相互关系的分析,揭示自噬在脾脏细胞死亡中发挥的作用。此外,本论文利用代谢组学技术对CSFV感染的PK-15与3D4/2细胞代谢物的多参数动态变化进行检测,分析了糖代谢、核苷酸代谢、氨基酸代谢与脂肪酸代谢在CSFV复制与天然免疫逃逸中的作用。CSFV诱导线粒体自噬抑制细胞凋亡的机制研究。病毒感染过程中可将其蛋白通过线粒体定位序列靶向锚定于细胞线粒体导致线粒体损伤,同时病毒可特异性的诱导细胞线粒体自噬清除损伤的线粒体并恢复线粒体稳态。为了揭示CSFV感染诱导细胞线粒体自噬以及线粒体自噬在CSFV感染中的作用机制,我们选取CSFV易感的PK-15细胞与猪固有免疫细胞-肺泡巨噬细胞3D4/2作为CSFV感染模型。首先利用westonblot对细胞感染csfv后不同时间线粒体的数量进行了分析。结果显示,细胞感染csfv后36h线粒体的数量开始减少。为了确认csfv感染诱导的细胞线粒体减少与自噬发生的相关性,我们分别应用自噬抑制剂3-methlyadenine(3-ma)与溶酶体递呈抑制剂bafilomycina1(bafa1)对csfv感染pk-15与3d4/2细胞的自噬发生与溶酶体递呈过程进行阻断,然后利用westonblot检测细胞内线粒体数量的变化。结果表明,3-ma与bafa1均可阻止csfv感染细胞的线粒体数量减少,这提示csfv感染促进细胞内线粒体自噬的发生。为了进一步证实csfv感染诱导细胞线粒体自噬的发生,我们利用透射电镜技术对csfv感染pk-15与3d4/2细胞的线粒体形态变化进行了观察。结果发现,csfv感染可导致细胞内出现大量膜状结构包裹的线粒体,表明csfv感染可诱导细胞线粒体自噬样结构的形成。为探讨csfv感染诱导细胞线粒体自噬发生的机制,我们又对csfv感染pk-15与3d4/2细胞的线粒体进行了分离纯化,再通过westonblot技术对纯化线粒体的pink1与parkin蛋白分子富集程度进行了检测。结果表明,csfv感染促进了细胞pink1与parkin分子的线粒体移位。为了确定csfv感染增强细胞parkin分子的泛素化连接酶活性作用,我们利用免疫沉淀与westonbot对csfv感染pk-15与3d4/2细胞内parkin下游分子-mfn2蛋白的泛素化水平进行了检测。结果证明,csfv感染诱导的细胞内mfn2蛋白减少与parkin分子对mfn2蛋白的泛素降解是密切相关的。在证明了csfv感染诱导细胞pink1-parkin通路激活的基础上,为了进一步验证parkin分子的线粒体移位与线粒体自噬的直接联系,我们利用激光共聚焦技术对csfv感染的pk-15与3d4/2细胞的parkin、gfp-lc3、线粒体叁者之间的共定位情况进行了分析。结果发现,csfv感染可导致细胞内parkin标记的线粒体与自噬体发生融合。为了进一步证明csfv感染诱导细胞线粒体完全自噬的发生,我们利用mito-mrfp-gfp线粒体自噬双荧光报告系统对csfv感染pk-15与3d4/2细胞线粒体的溶酶体递呈情况进行了分析。结果显示,csfv感染导致细胞内线粒体呈现更多rfp荧光,证明了csfv感染可引起溶酶体对线粒体的降解。另外,为了确认csfv感染pk-15与3d4/2细胞线粒体自噬体与溶酶体的融合,我们利用激光共聚焦技术对细胞内gfp-lc3、线粒体、溶酶体叁者的共定位情况进行了观察。结果发现,csfv感染细胞内与gfp-lc3荧光斑点融合的线粒体同时可以与溶酶体发生融合,说明csfv感染诱导细胞线粒体自噬溶酶体的产生。在证明了csfv感染诱导pk-15与3d4/2细胞线粒体完全自噬发生的基础上,本论文进一步研究了csfv感染细胞内线粒体活动的变化。我们利用共聚焦显微镜对csfv感染pk-15与3d4/2细胞的线粒体形态以及drp1分子的线粒体移位情况进行观察,证明了csfv感染可导致细胞内线粒体分裂的产生。为了进一步研究线粒体分裂与线粒体自噬对csfv复制的影响,我们通过rna干扰技术下调pk-15和3d4/2细胞drp1和parkin基因的功能,应用westonblot、qpcr与间接免疫荧光技术对csfv的npro蛋白表达水平、病毒拷贝数与病毒滴度进行了测定。结果证明,下调细胞drp1与parkin基因功能可显着降低csfv的npro蛋白表达、病毒拷贝数与病毒滴度,表明csfv可利用感染诱导的细胞线粒体分裂与线粒体自噬促进病毒复制。为了阐明csfv感染诱导细胞线粒体分裂与线粒体自噬促进病毒复制的机制,我们对drp1与parkin基因功能下调的csfv感染pk-15和3d4/2细胞内凋亡相关蛋白caspase-3和parp的表达水平进行检测,并应用流式细胞技术对细胞凋亡情况进行了分析。结果表明,抑制csfv感染细胞的线粒体分裂与线粒体自噬可促进细胞凋亡。csfv感染导致猪脾脏t区部分细胞自噬性死亡。脾脏作为机体重要的外周免疫器官,有多种类群的巨噬细胞与淋巴细胞,并且是csfv体内复制的重要场所。据此,本研究选取猪的脾脏作为靶器官对csfv体内感染过程中病毒、自噬与凋亡的相互关系进行研究。首先我们应用免疫组化技术对脾脏组织中csfv的e2蛋白染色检测csfv对脾脏细胞的感染情况。结果显示,csfv感染猪的脾脏内大部分细胞呈现阳性。为研究csf发生过程中脾脏组织自噬水平的变化,我们利用westonblot对脾脏组织细胞lc3-ii与sqstm1/p62的表达情况进行了检测。结果发现,csfv感染猪脾脏组织的lc3-i向lc3-ii的转化与sqstm1/p62的降解增强,提示csfv感染导致猪脾脏组织自噬水平增加。同时,我们还通过westonblot对脾脏组织自噬相关蛋白atg5与becn1的表达水平进行了检测。结果表明,csfv感染可促进脾脏组织atg5与becn1的表达,进一步验证了csfv感染引起脾脏组织自噬途径的活化。为了检测csfv感染诱导脾脏组织中自噬阳性细胞的分布情况,我们应用免疫组化方法对脾脏组织的lc3-ii分子阳性反应进行了检测。结果显示,csfv感染猪脾脏组织中的自噬阳性细胞主要集中于脾小体周围。在此基础上,我们又通过流氏细胞术对csfv感染猪脾脏组织中的细胞凋亡情况进行检测,发现csfv感染可显着促进脾脏组织的细胞凋亡。为了再次确认csfv感染与脾脏细胞凋亡的关系,我们对csfv感染猪脾脏组织的凋亡标志性蛋白进行了检测。结果显示,csfv感染引起猪脾脏组织活化形式的caspase-8、caspase-9、caspase-3和parp的表达增加,提示csfv感染导致猪脾脏组织凋亡信号活化。为了解csfv感染诱导的凋亡阳性细胞在脾脏组织的分布情况,我们应用tunel标记法对csfv感染猪脾脏内的凋亡阳性细胞进行了检测。结果显示,csfv感染可导致脾脏内凋亡阳性细胞同样分布在脾小体周围,提示csfv感染猪脾脏组织内凋亡与自噬之间的密切关系。为了进一步研究csfv感染猪脾脏组织内自噬与凋亡的相互关系,我们应用激光共聚焦技术对csfv感染猪脾脏组织细胞lc3-ii与tunel的共定位情况进行了分析。结果显示,csfv感染导致猪脾脏组织内部分lc3-ii阳性细胞(约40%)同时呈现tunel阳性,并且这些双阳性细胞主要分布在脾小体周围。以上结果提示,自噬在csf发生中可能导致脾脏组织细胞的死亡,并介导t区淋巴细胞的减少。为了阐明csfv感染脾脏组织内自噬、凋亡与病毒感染的关系,我们利用激光共聚焦技术对csfve2蛋白与lc3-ii分子、csfve2蛋白与tunel分子的共定位情况分别进行了分析。结果表明,csfv感染猪脾脏组织内大部分的自噬阳性细胞被csfv感染,与之不同的是凋亡细胞很少被csfv感染。值得注意的是,少部分未被csfv感染的细胞也呈现自噬阳性。csfv感染的代谢组学研究。病毒感染可引起细胞内某些代谢物质的变化并与疾病的发生有关,但有关csfv感染与细胞内的代谢物质变化关系的研究未见报道。本论文利用代谢组学技术对csfv感染的pk-15与3d4/2细胞代谢物质变化情况进行了检测分析。结果显示,在糖代谢方面,csfv感染导致pk-15细胞糖酵解途径中的葡萄糖、果糖-6-磷酸、甘油醛-3-磷酸含量减少,也导致3d4/2细胞糖酵解途径中甘油醛-3-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸含量减少,表明csfv感染导致细胞糖酵解途径中代谢物的利用率增加,提示csfv感染促进细胞糖酵解的发生。同时,csfv感染促进pk-15细胞叁羧酸循环中柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸的产生,却抑制3d4/2细胞这3种物质的产生,提示csfv感染激活pk-15细胞叁羧酸循环为病毒复制提供充足的能量,相反csfv感染可能通过抑制3d4/2细胞叁羧酸循环限制细胞免疫功能发挥需要的能量。在核苷酸代谢方面,csfv感染pk-15细胞5-磷酸核酮糖含量减少,表明csfv感染导致PK-15细胞磷酸戊糖途径中代谢物的利用率增加,提示CSFV感染激活PK-15细胞磷酸戊糖途径并促进病毒RNA合成需要的戊糖产生。CSFV感染PK-15细胞葡萄糖醛酸、木糖醇、木酮糖、阿糖醇的含量均减少,表明CSFV感染导致PK-15细胞葡萄糖醛酸转化途径中代谢物的利用率增加,提示CSFV感染同样可激活PK-15细胞葡萄糖醛酸转化途径并促进戊糖产生。同时,CSFV感染PK-15细胞肌苷、肌苷酸、鸟嘌呤含量均减少,提示CSFV感染PK-15细胞病毒RNA合成活动对碱基的消耗增加。另外,CSFV感染3D4/2细胞5-单磷酸尿嘧啶的含量减少,也提示CSFV感染3D4/2细胞内病毒RNA合成活动对碱基的消耗增加。在氨基酸代谢方面,CSFV感染抑制PK-15细胞丙氨酸、天冬氨酸与谷氨酸降解途径、丙氨酸与天冬氨酸代谢途径、甘氨酸、丝氨酸与苏氨酸代谢途径、缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸降解途径,提示CSFV感染抑制PK-15细胞的蛋白合成。与其相反的是CSFV感染激活3D4/2细胞缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸降解途径、丙氨酸、天冬氨酸与谷氨酸降解途径、β-丙氨酸代谢途径、牛磺酸与亚牛磺酸代谢途径,提示CSFV感染促进3D4/2细胞的蛋白合成。在脂肪酸代谢方面,CSFV感染PK-15细胞的棕榈烯酸、棕榈油酸含量减少,CSFV感染3D4/2细胞的棕榈油酸含量增加,提示CSFV感染可导致细胞脂代谢的紊乱,但这种影响因细胞种类而异。
张黎[4]2016年在《大黄素衍生物E35诱导急性髓系白血病细胞HL-60及Kasumi自噬与凋亡的作用研究》文中研究说明目的:白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病,严重威胁人类健康。尽管白血病的化学治疗取得了可喜的成就,但目前化疗药物仍存在毒副作用大、多药耐药等缺陷,从天然植物中提取有效活性成分,研发抗癌活性强、毒副作用小的新型抗肿瘤药物成为一种趋势。大黄素(emodin)主要来源于蓼科(Polygonaceae)植物大黄,E35是经过修饰的大黄素衍生物,具有更好的生物学活性。本研究旨在探讨大黄素衍生物E35对髓系白血病细胞株HL-60及Kasumi细胞增殖、凋亡及自噬的影响及其可能的作用机制,为E35将来应用于临床提供实验依据。方法:1、MTT法检测E35对HL-60及Kasumi细胞增殖活性的影响;2、Annexin V-PE/7-AAD双染法结合流式细胞术(FCM)检测E35诱导HL-60及Kasumi细胞的凋亡;3、通过AO/EB、MDC染色,用荧光显微镜鉴定HL-60及Kasumi细胞凋亡、自噬的发生;4、应用实时PCR技术检测自噬相关基因Beclin-1的m RNA表达水平;5、用Western-blot检测药物作用后凋亡及自噬相关蛋白PARP、Caspase-8、Caspase-9、LC3-I/II、Beclin-1等的表达变化;6、Western-blot检测E35干预HL-60细胞不同时间点自噬相关蛋白LC3及凋亡相关蛋白PARP表达的时效变化。7、通过E35联合自噬抑制剂(3-MA)、自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)、凋亡抑制剂(z VAD-fmk),在凋亡发生的早期调控E35诱导的细胞凋亡与自噬,流式细胞仪检测联合3-MA、Rapamycin、z VAD-fmk后各组细胞的凋亡率。Western blot检测各处理组细胞自噬及凋亡相关蛋白表达量的变化。结果:1、E35对HL-60及Kasumi细胞增殖呈时间和剂量依赖性抑制作用,HL-60及Kasumi细胞48 h的半数抑制浓度(IC50)分别约为4.76±0.35μmol/L、6.06±0.29μmol/L。2、E35能够有效诱导HL-60及Kasumi细胞凋亡,并呈量效关系。3、AO/EB、MDC染色后,荧光显微镜下观测证实与对照组相比,实验组细胞胞质出现大量大小不等的凋亡小体及自噬泡,且数量随药物浓度的增加而增多。4、不同浓度E35干预HL-60及Kasumi细胞12 h后Beclin-1基因m RNA的表达水平随药物浓度的增加而逐渐增高。5、不同浓度E35干预HL-60及Kasumi细胞后,细胞内凋亡相关蛋白PARP、Caspase-9剪切体表达上调,Caspase-8前体下调,自噬相关蛋白LC3-I/II及Beclin-1的表达水平上调。6、E35作用6 h后自噬相关蛋白LC3-II开始表达增强,24 h后表达减弱,而凋亡相关蛋白PARP在E35作用24 h后开始表达,自噬作用的发生早于凋亡。7、在凋亡激活的早期联合自噬抑制剂抑制细胞自噬,可以促进HL-60细胞凋亡,而联合自噬诱导剂或凋亡抑制剂诱导自噬作用或抑制凋亡并未增加E35诱导的细胞凋亡。结论:1、大黄素衍生物E35能够显着抑制髓系白血病细胞株HL-60及Kasumi细胞增殖,同时诱导细胞产生自噬和凋亡。2、在凋亡发生早期E35诱导HL-60细胞产生的自噬可能发挥适应性作用,保护白血病细胞免受生存压力,促进白血病细胞的存活。3、在E35发挥药物毒性作用的早期通过联合自噬抑制剂抑制细胞保护性自噬作用,可以促进E35诱导的HL-60细胞凋亡。
石琼[5]2017年在《多氯联苯醌诱导细胞发生自噬以及自噬—凋亡转换的机制分析》文中研究指明多氯联苯(PCBs)是一类无所不在的持久性有机污染物,由于其多种毒性效应如内分泌毒性、免疫毒性、神经毒性等,在二十世纪七十年代已被禁止使用,但是由于其特殊的理化及生物学特性,PCBs仍然广泛存在于我们的环境包括陆地和水生系统。细胞自噬是细胞内受损衰老的蛋白质或者细胞器包裹起来形成自噬体,自噬体再与溶酶体融合进而进行消化降解的过程,也常被作为细胞的自我保护机制。该研究的目的是为了分析PCB29-pQ激活自噬的具体机制,以及探讨细胞自噬与细胞凋亡间的转换机制。第一部分:该部分研究考察了多氯联苯醌通过mTOR/p70S6k诱导细胞自噬发生的分子机制。选用HepG2和MDA-MB-231细胞作为研究对象,并通过实验发现PCB29-pQ诱导的自噬没有细胞特异性。首先,两种细胞在5μM PCB29-pQ处理24 h后透射电镜检测细胞超微结构显示出自噬泡显着特征,并通过AO染色、MDC染色观察到明显的自噬泡形成,由此先从形态学和生化特征表明PCB29-pQ作用后可以引起细胞发生自噬。然后从自噬体形成的3个阶段证明诱导自噬发生的分子机制。第一阶段从浓度和时间梯度上分别检测了对自噬开关负调控的蛋白mTOR和p70S6k的表达,在PCB29-pQ作用后其蛋白表达水平降低,表明激活了自噬的诱导阶段。第二阶段检测了自噬体形成过程中自噬相关蛋白ATG5、ATG12、LC3的表达,并用RT-PCR分析LC3 mRNA水平。与对照组相比,PCB29-pQ处理的细胞蛋白和基因的表达水平都显着增加,且在5μM PCB29-pQ处理24 h有最大值。而自噬降解底物p62蛋白水平随时间梯度降低,在5μM PCB29-pQ处理24 h表达水平最低。这些结果说明PCB29-pQ能够激活自噬体的形成阶段,促进自噬体降解底物的能力。第叁阶段通过加入CQ抑制LC3的降解后检测LC3表达的净通量,结果表明PCB29-pQ作用后提高了LC3净通量并在5μM PCB29-pQ作用24 h时最明显。并且通过转染GFP-LC3质粒,免疫荧光观察了自噬体标记LC3与溶酶体标记LAMP2的共定位,结果表明促进了自噬体与溶酶体融合的阶段。接着阐明了自噬的发生在PCB29-pQ诱导细胞毒性中的作用,在加入不同阶段自噬抑制剂3-MA和CQ后,通过CCK8、流式细胞仪、细胞凋亡标志蛋白caspase3的检测,表明抑制自噬促进了PCB29-pQ诱导的细胞毒性的增加。最后用加入ROS清除剂NAC的方法考察PCB29-pQ引起自噬水平升高的原因,结果表明,PCB29-pQ诱导的细胞自噬的激活受ROS水平的调节。根据以上研究可知,PCB29-pQ可以诱导HepG2和MDA-MB-231细胞发生自噬,并受细胞内ROS水平的调节。PCB29-pQ引起的自噬受mTOR/p70S6k和ATG5/ATG12/LC3信号通路的调控,且作为一种存活机制保护细胞。第二部分:该部分初步探讨了多氯联苯醌在低浓度诱导自噬,高浓度诱导凋亡时,钙蛋白酶活性的作用对自噬向凋亡信号传递的影响。首先通过JC-1荧光探针检测HepG2细胞线粒体膜电位,免疫印迹法检测凋亡相关蛋白caspase9/caspase3等表达,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光检测自噬标志蛋白LC3焦点,结果发现,与对照组相比,随着PCB29-pQ处理浓度的升高细胞凋亡水平逐渐增加,而在低浓度5μM PCB29-pQ处理后自噬LC3焦点最多,随着浓度升高,自噬LC3焦点数目降低。随后用流式细胞仪检测PCB29-pQ诱导的细胞钙离子水平的变化,荧光分光光度计检测钙蛋白酶活性,结果表明,PCB29-pQ可以诱导HepG2细胞钙离子水平以及钙蛋白酶活性的升高,以及在加入钙离子螯合剂BAPTA-AM后抑制了calpain蛋白表达,表明,calpain的表达依赖于Ca2+水平的调节。文献报道Beclin1、ATG5可经钙蛋白酶切割形成Beclin1-c、tATG5易位至线粒体将自噬向凋亡信号传递,而在本研究中PCB29-pQ没有引起Beclin1、ATG5切割易位至线粒体。以上研究可知,PCB29-pQ可以在低浓度时诱导HepG2细胞自噬,高浓度时诱导细胞凋亡,并且伴随着细胞内钙离子水平和钙蛋白酶活性的升高,但钙蛋白酶活性并不引起Beclin1、ATG5产生切割将信号从自噬传递至凋亡。第叁部分:该部分进一步探讨了多氯联苯醌诱导细胞自噬与细胞凋亡转换的机制,分析选取了对自噬和凋亡有双重调节作用的p53/HMGB1蛋白。Western Blot和免疫荧光实验表明了PCB29-pQ作用后诱导HepG2细胞p53/HMGB1易位到细胞质。免疫共沉淀实验表明了5μM PCB29-pQ作用后促进了HepG2细胞p53/HMGB1在细胞核中的结合,15μM PCB29-pQ作用后促进了HepG2细胞p53/HMGB1在细胞质中的结合。由于HMGB1/p53可以作为核转录因子调控下游靶基因的表达,影响细胞自噬与凋亡。我们干扰了p53蛋白表达后检测了p53下游靶基因DRAM、ULK1、Bax表达,同时干扰了HMGB1蛋白表达后Western Blot检测了HMGB1的下游蛋白HSPB1表达,结果表明,在抑制了p53/HMGB1的作用后,抑制了该蛋白调控的靶基因的表达。针对上述检测结果,我们进一步研究p53/HMGB1诱导细胞自噬和细胞凋亡的作用机制。干扰p53基因后提取了核质蛋白,Western Blot表明p53 siRNA后促进了PCB29-pQ诱导的HMGB1进一步易位至细胞质,细胞存活率实验表明了p53 siRNA抑制了PCB29-pQ诱导的细胞凋亡,免疫荧光LC3焦点实验表明p53 siRNA促进了PCB29-pQ诱导的细胞自噬,而在加入HMGB1抑制剂EP后,细胞凋亡增加,细胞自噬水平降低。这些结论表明,易位到细胞质中的HMGB1发挥着抑制凋亡、促进自噬的作用。在干扰了HMGB1蛋白后相同的实验方法证明HMGB1 siRNA后促进了PCB29-pQ诱导的p53进一步易位至细胞质,促进了PCB29-pQ诱导的细胞凋亡,以及抑制了PCB29-pQ诱导的细胞自噬,而在加入p53抑制剂PFT-α后,细胞凋亡减少,细胞自噬水平升高。这些结论表明,易位到细胞质中的p53发挥着促进凋亡、抑制自噬的作用。以上研究表明,PCB29-pQ诱导HepG2细胞自噬与细胞凋亡的过程中,是通过p53/HMGB1在细胞核与细胞质定位以及对靶基因表达的不同发挥其在PCB29-pQ引起细胞自噬与细胞凋亡间的调控作用。
周立江[6]2016年在《肺积宁方对Lewis肺癌抗肿瘤作用及自噬效应的实验研究》文中提出目的:通过体外实验,研究肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞增殖和凋亡的影响,并检测与凋亡密切相关的自噬基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Atg5蛋白水平表达及RNA水平的影响,探讨肺积宁方的抗癌作用及其对自噬的关系;并通过体内实验,运用裸鼠lewis移植瘤模型,分析肺积宁方在体内代谢后抗癌效果,观察其对Lewis肺癌细胞形态学影响、对自噬相关基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Atg5蛋白表达的影响。最终通过体内体外实验,了解肺积宁方对Lewis肺癌细胞抗癌效果及其作用机制。材料与方法:体外实验:制备含药血清,作用于Lewis肺癌细胞。40只大鼠按随机数字表法分为肺积宁方高剂量组、肺积宁方大剂量组、肺积宁方中剂量组、肺积宁方低剂量组和对照组。各组动物分别给予高、大、中、低剂量组肺积宁方及等量生理盐水灌胃,每天1次,连续3天,第3天晚上禁食不禁水12h,次日断头取血;用铡刀断头取血,制备肺积宁方含药血清。MTT法检测肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞的增殖抑制效应,分为肺积宁方含药血清高剂量组、含药血清大剂量组、含药血清中剂量组、含药血清低剂量组和对照血清组。同时设置不加细胞的空白孔。分别加不同浓度肺积宁方含药血清及正常对照组含药血清,分别于培养24 h、48 h、72h收集细胞进行MTT检测,观察肺积宁方含药血清抑制Lewis肺癌细胞增殖的最佳药量和作用时间,筛选出最佳含药血清剂量组,进行后续实验;流式细胞术检测对照组,肺积宁方组,顺铂组,联合组作用48h,细胞凋亡率。GFP-LC3转染定位法检测各组细胞自噬情况:将Lewis细胞以6×105细胞/孔的密度接种于6孔板,分为4组,对照组每孔加入含20%对照组血清DMEM培养液、肺积宁方组为20%肺积宁方含药血清DMEM培养液、顺铂(1μg/ml)组、联合组(20%肺积宁方含药血清+顺铂1μg/ml)。将GFP-LC3转染后的Lewis肺癌细胞正常培养条件下培养24 h,对照组加对照血清、肺积宁方组加肺积宁方含药血清、顺铂组加顺铂、联合组加顺铂和肺积宁方含药血清。正常培养24h,荧光显微镜下观察,调整显微镜发射波长395nm,激发滤色镜的波长509nm,拍照,计数。免疫印迹法检测Beclin1蛋白、Atg5和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比例来判断自噬是否被诱导,对照组每孔加入含20%对照组血清DMEM培养液、肺积宁方组为20%肺积宁方含药血清DMEM培养液、顺铂组为顺铂(1μg/ml)组、联合组(20%肺积宁方含药血清+顺铂1μg/ml),培养48h,收集细胞。免疫印迹的定量,用Bio-Rad提供的分析软件进行灰度分析。计算Beclin1、LC3B-I、LC3BII、Ag5和内参照β-actin比值,评价自噬情况。real time PCR检测Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的m RNA表达。体内实验:建立裸鼠荷瘤模型,Lewis瘤株,液氮保存,于37℃,水浴中复苏,放入37℃、5%C02细胞培养箱中,台盼蓝染色观察记录活细胞数(>95%),调整细胞浓度至1x107/m1的瘤细胞悬液,碘伏消毒,使用1ml注射器,在每只小鼠右腋窝皮下接种瘤细胞0.2ml,共接种50只。一般状态及自主活动次数观察:每日观察精神、饮食、活动、大小便等一般情况,每隔两日称小鼠体重,分别于用药前、d8、d17检测小鼠活动,于每天的同一时刻,小鼠自主活动测试仪测小鼠平行移动和站立次数,计算出每组裸鼠每分钟自主活动次数。实验结束,剥离瘤体,称瘤重及抑瘤率:抑瘤率=(对照组平均瘤重一实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重x100%,肿瘤组织病理形态学观察,各组瘤组织,包埋,完成石蜡组织块制作,用显微镜观察染色结果:细胞核呈现鲜艳的蓝色,细胞质及细胞间质呈粉红至红色。透射电镜观察瘤组织细胞的自噬小体,将取下的瘤组织快速切成1mm3大小,固定,超薄(70nm)切片,铀、铅双重染色,电镜下观察瘤组织细胞中的自噬小体,照相、记录。Western blotting检测瘤组织中Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Atg5的蛋白表达。结果:1.肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞增殖的影响肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞的增殖有显着抑制作用,同一时间随着浓度的增加或者同一种浓度随着时间的延长其抑瘤作用增强(P<0.01)。分别在24h,48h,72h检测对lewis细胞的抑制作用,结果发现和对照组相比,肺积宁方含药血清抑制Lewis细胞的增殖,且抑制效果随着浓度、时间的增加而增强。中剂量组抑制率在24h、48h时相抑制率分别为19±1.84%,24±1.93%,与对照组的15±1.08%,20±2.06%比较,均有统计学显着差异(P<0.05),并且其抑制效果有随着浓度增加和时间延长而增强的趋势。大剂量组的抑制率分别为28±2.03%、32±2.04%,与中计量组比较有明显增加(P<0.05)。高剂量组在各个时相的抑制率与大剂量组比较,均无统计学意义。其最佳含药血清剂量组为大剂量组,进行后续实验。2.肺积宁方含药血清与顺铂联合对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用,肺积宁方组在不同作用时间,第24h、48h、72h抑制率分别为28%、32%、33%;顺铂组42%、66%、75%;联合组为58%、86%、91%。3.流式细胞仪检测流式细胞术检测对照组,肺积宁方组,顺铂组,联合组作用48h,细胞凋亡率,对照组、肺积宁方组、顺铂组及联合组对Lewsi肺癌细胞作用48h后的凋亡率分别为3.20%、10.36%、18.31%、30.18%,凋亡率以联合组作用为最高。与对照组比较,肺积宁方组促进凋亡作用明显,P<0.01;与顺铂组比,联合组明显提高了凋亡比例,统计学差异显着,P<0.01。处于G0/G1期,肺积宁方组处于此周期细胞较多比例为38.69%,顺铂组为56.12%,联合组最高,68.35%。4.自噬GFP-LC3转染及计数结果显示,对照组细胞中GFP-LC3融合蛋白弥散在包浆中,但代表自噬体的荧光斑点很少观察到;肺积宁方组有较为明显的绿色荧光聚集,可以观察到自噬体形成,荧光的强度比对照组明显高亮。经肺积宁方含药血清处理的,大多数细胞发生自噬(37.5%),而对照组自噬率较低(17.6%),具有显着差异,P<0.05。与顺铂组的自噬率(56.4%)相比,联合组的荧光斑点也明显增多,自噬发生率77.9%,并进行统计分析,两组差异明显,P<0.05。5.Western blotting检测Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-I、Atg5的变化免疫印迹法检测结果显示:肺积宁组较对照组Beclin1、Atg5蛋白表达显着增强,灰度值分别为Beclin1(0.38 VS 0.24),Atg5(0.31 VS 0.18)。LC3B-Ⅱ/LC3B-I灰度值比值(0.52 VS 0.2),差异显着,P<0.05。联合组与顺铂组比较,Beclin1(0.62 VS0.44)、Atg5(0.63 VS 0.41)也表达增强,LC3B-Ⅱ/LC3B-I灰度值比值上升(0.98 VS0.81),均有显着差异(P<0.05)。6.real time PCR检测Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的m RNA表达引物验证,各引物扩增曲线均正常,溶解曲线无杂峰,均单峰,平均溶解温度一致,具有特异性。real time PCR结果提示,肺积宁方组细胞中的Beclin1、LC3B-Ⅱ、Ag5的m RNA表达增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);联合组细胞的Beclin1、LC3B-Ⅱ、Ag5的m RNA表达也明显高于顺铂组,差异显着(<0.05)。7.裸鼠成瘤情况、一般状态;各组药物对肿瘤生长的影响各组裸鼠瘤体大小较为相似、均衡。在平均肿瘤体积长到100mm3时,给药。B组(肺积宁方低剂量组)和C组(高剂量组)体重增长较为稳定,高低剂量组相差不大,精神及活动保持较好;A组(对照组)早期体重变化不明显,d10开始略有下降;D组(顺铂组)在给药3天后体重下降明显,精神萎靡,活动差;E组体重下降,与D组相比较下降较缓,但比B组和C组明显,后期下降不明现,精神和活动状态较D组表现好。B组和C组(单用肺积宁方组)自主活动次数较A组活跃,B组和C组比较,差异不显着;E组与D组比较,自主活动次数明显有优势。8.肺积宁方对裸鼠Lewis移植肿瘤生长的影响:B组、C组、D组和E组的肿瘤重量均低于对照组,与对照组比较有显着差异(p=0.000﹤0.01),B组瘤重较C组要轻,但差异不显着;其中E组的瘤重最轻,明显低于单独用药组(p﹤0.01),D组的瘤重组低于B组和C组,有统计学差异(p=0.031﹤0.05)。B组、C组、D和E组的抑瘤率分别为33.7%、40.6%、56.6%、66.9%,说明肺积宁方对Lewis移植肿瘤的生长有抑制作用,并与顺铂有协同作用。9.各组裸鼠移植瘤HE染色结果:肉眼瘤组织,较为规整,剥离较容易。部分瘤体的外区域可见坏死。HE染色光镜下可见,A组肿瘤细胞大,排列较为杂乱,紧密,核大深染,核浆比例失衡,处于分裂象细胞较多;B组及C组,肿瘤细胞大小较稍规整,可见坏死细胞明显较多,异型性较少见;D组可见大量坏死,可见少量纤维组织;E组坏死细胞大量出现,肿瘤细胞较小,分裂象比较少见,且周围有大量的淋巴细胞,白细胞浸润。10.各组裸鼠移植瘤电镜透视观察自噬小体各组均可见双层膜包裹的自噬体,可见典型的凋亡小体,其由膜包绕,小体内可见核的残片及细胞器。其中B组和C组可见较多散在的自噬体,D组也可见胞质内大量空泡,E组最为多见。依次增多:A组、B组、C组、D组、E组。11.Westen blot检测瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5表达水平。采用Western blot蛋白免疫印迹法,检测各组裸鼠抑制瘤组织中自噬相关基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的蛋白表达水平。Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白相对灰度值,B组分别为0.63、0.46、0.82,和C组的0.65、0.48、1.0比较无差异,P>0.05;B、C两组与A组0.42、0.38、0.43比较,显着增高,P<0.05;Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白相对灰度值在E组的统计值0.80、0.78、1.3,显着高于D组0.78、0.62、1.0,P<0.05。结论:1.肺积宁方含药血清能抑制Lewis肺癌细胞增殖,并能促进其凋亡。2.肺积宁方含药血清诱导Lewis肺癌细胞自噬,增强Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白和m RNA水平的表达,提高LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例。3.肺积宁方能改善荷瘤裸鼠的一般状态、增加自主活动次数,抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长。4.肺积宁方上调荷瘤裸鼠瘤组织中Beclin1、LC3BB-Ⅱ、Atg5蛋白的表达,提高LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例。5.肺积宁方具有抑制肿瘤作用,可能与诱导自噬有关。
王丛丛[7]2014年在《ATF6在内质网应激引起的HepG2细胞自噬与凋亡中作用机制的研究》文中指出活化转录因子6(Activating Transcription Factor6, ATF6)为内质网上的一种感受蛋白,是内质网应激引起的细胞凋亡和自噬途径中的一个重要的调节因子。尽管随着研究的深入对其调控机制已经取得了一些进展,但其在内质网应激引起的凋亡和自噬中的具体调控机制尤其是肿瘤细胞中的作用机制还不是很清楚。因此,本研究以人肝癌HepG2细胞为研究对象,在内质网应激条件下,探讨ATF6在细胞凋亡和自噬中的作用以及由其介导的信号传导途径,为进一步阐明ATF6在凋亡与自噬中的作用机制提供实验依据。同时,为肿瘤治疗研究提供新的作用靶点。本研究以不同浓度毒胡萝卜素(TG)干预HepG2细胞24h或48h,分别用MTT法、Hochest33342染色和罗丹明123检测细胞存活率、凋亡形态和线粒体膜电位的变化,用流式细胞术检测细胞凋亡的变化。用不同浓度的TG作用细胞24h,多功能酶标仪检测叁种Caspases酶活性的变化。采用Caspase3抑制剂AC-DEVD-CHO和Caspase9抑制剂Z-LEDH-FMK分别处理细胞后,用1μM的TG染毒HepG2细胞48h,流式细胞术检测细胞凋亡率的改变。同时应用Western blot检测凋亡相关蛋白的表达情况。结果表明,TG显着抑制了细胞的增殖且呈现明显的剂量和时间相关性。TG作用后,HepG2细胞呈典型的凋亡细胞形态；线粒体膜电位显着下降,且呈浓度依赖性；细胞凋亡率均明显升高,且在一定范围内具有浓度和时间依赖性；Caspase3和Caspase9的酶活性显着增加,且呈浓度依赖性,而Caspase8的酶活性无明显变化。Caspase3和Caspase9活性被抑制后,细胞凋亡率显着下降。凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase9均发生了剪切表达量下降,抑凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax和Cyt C表达增加,同时内质网应激相关蛋白Caspase12表达量也显着上升,且在一定范围内呈浓度和时间依赖性；而死亡受体相关蛋白Caspase8、Fas和FADD的表达量无显着变化。以上结果表明,由毒胡萝卜素诱导的内质网应激反应能够抑制人肝癌HepG2细胞的存活和增殖,并进一步诱导其发生凋亡,其凋亡途径可能与线粒体途径有关。为了探讨毒胡萝卜素引起的内质网应激对人肝癌HepG2细胞自噬的影响及其调控机制。本研究经不同浓度TG作用24h和1μM的TG分别作用不同时间,采用MDC染色,荧光显微镜观察自噬囊泡,流式细胞术检测其自噬发生率。pEGFP-LC3质粒瞬时转染HepG2细胞,TG处理24h后,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的点状聚集程度。Western blot检测内质网应激和自噬相关蛋白的表达情况。结果显示,TG作用后,在细胞质可见明显的点状MDC阳性荧光颗粒聚积；自噬发生率在一定的范围内呈时间和浓度依赖性。GFP-LC3在TG作用组细胞中出现明显点状聚集,其数量呈时间依赖性增加。内质网应激相关蛋白Bip、p50ATF6、IRE-1和CHOP表达升高,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达量比值呈浓度和时间依赖性增加,Beclinl和DAPK1的蛋白表达水平随处理时间的延长和浓度的增加,表达量也逐渐升高,自噬活性标志蛋白p62的表达则明显下降。由此说明毒胡萝卜素诱导的内质网应激反应能够诱导人肝癌HepG2细胞发生自噬,且可能与]DAPK1有关。为了进一步探讨内质网应激诱导的自噬和凋亡之间的关系,我们采用自噬抑制剂3-MA抑制细胞的自噬水平,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化,同时通过Western blot检测凋亡相关蛋白的变化。结果显示,3-MA和TG联合应用后细胞凋亡率显着升高,凋亡相关蛋白Bcl-2的表达量也下降,促凋亡蛋白Bax的表达则显着增加。以上结果表明,抑制自噬可以促进内质网应激诱导的细胞凋亡。为了明确ATF6在内质网应激引起的HepG2细胞凋亡和自噬中的作用。我们将高表达的ATF6瞬时转染HepG2细胞,并用TG引起内质网应激。用荧光显微镜观察凋亡和白噬形态的变化、流式细胞仪检测细胞的凋亡率、自噬发生率和线粒体膜电势的变化、透射电子显微镜观察细胞自噬泡的形成情况、多功能酶标仪检测酶活性的变化、QRT-PCR法和Western blot检测凋亡和自噬相关蛋白的变化。结果表明,ATF6高表达后由内质网应激引起的细胞凋亡形态的变化更加明显；细胞质内点状MDC阳性荧光颗粒聚积显着增加且绿色荧光明显增强；细胞内出现大量的自噬空泡并在泡内可见明显的细胞内容物；细胞凋亡率和自噬发生率也显着增加。另外,Caspase3和Caspase9的酶活性也显着升高。线粒体途径相关蛋白Caspase9、CytC及Bax的表达量均升高,Bcl-2的表达则显着降低,而死亡受体途径相关蛋白则无显着变化；自噬相关蛋白LC3II/LC3I的比率则明显升高,Beclinl和DAPK1的表达水平都显着增加,p62表达量则显着下降。这说明,ATF6的高表达可以促进内质网应激引起的凋亡和自噬,其可能是通过下调Bcl-2/Bax的比例来介导线粒体通路来调控的细胞凋亡,而且对自噬的调控可能是通过激活DAPKl-Beclinl这一途径来完成的。为了进一步探讨ATF6在内质网应激引起的凋亡和自噬中具体的分子作用机制。将高表达的ATF6瞬时转染HepG2细胞后,在内质网应激条件下,通过iTRAQ技术对其差异表达的蛋白进行筛选,并运用Gene Ontology和KEGG数据库等进行信息学分析；应用QRT-PCR和Western blot方法对与凋亡和自噬有关的mRNA和蛋白水平进行检测,验证iTRAQ筛选差异蛋白结果；并分别用Blebbistatin、SB203580和Dynasore作为MYH9、HSPB1和Dynamin Ⅱ的抑制剂,Western blot检测自噬和凋亡相关蛋白的变化。iTRAQ数据显示,共筛选到差异蛋白106个,其中有52种蛋白表达上调,54种蛋白表达下调。生物信息学分析表明,在这些差异蛋白中有许多与肿瘤的发生、发展有关；其中有24种蛋白与凋亡和自噬有关。验证实验表明,我们所挑选的基因和蛋白的变化趋势与iTRAQ结果中差异蛋白的变化趋势基本相一致。应用Blebbistatin和Dynasore并联合ATF6高表达后,凋亡相关蛋白Bcl-2的表达均升高,Bax表达量则显着下降；自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表达量显着降低,p62的表达量则上升。应用SB203580并联合ATF6高表达后,Bcl-2、LC3Ⅱ和Beclinl的表达量明显下降,Bax和p62的表达量则显着上升。以上结果表明,在内质网应激条件下,MYH9、HSPB1和Dynamin Ⅱ叁个蛋白可能参与了ATF6介导的细胞凋亡和自噬过程。综上所述,内质网应激可以诱导人肝癌HepG2细胞发生细胞凋亡和自噬。ATF6能够促进内质网应激引起的凋亡和自噬,其调控凋亡的作用机制与线粒体途径有关,而DAPK1-Beclinl这一通路的激活参与了其调控自噬的过程。MYH9、HSPB1和Dynamin Ⅱ叁个蛋白均在ATF6介导的细胞凋亡和自噬过程中发挥了重要的作用,可作为研究ATF6调节凋亡和自噬作用机制的分子靶点。
陈英[8]2001年在《自噬与凋亡分子水平相关关系的探讨》文中进行了进一步梳理为了从分子水平研究自噬与凋亡之间的关系，本实验进行了hAPG5基因的克隆和表达，应用PCR技术，从人胚脑cDNA文库和B细胞cDNA文库中钓取APG5基因，测序确定核苷酸序列并进行生物信息学分析。以APG5为模板进行数据库搜索，将相关克隆的基因组序列做相似性比对，用DOTPLOT方法确定其相互位置关系，并进行序列拼接，得到全长为144159bp人类APG5基因基因组全序列，确定其有八个外显子。根据剪切位点的特性找出其在序列中的位置，分别计算出内含子、外显子的长度，首次证实并报道APG5β是第三外显子缺失的可变性剪切变异体。登录号（hAPG5β；LOCUS AF293841，Genbank）。利用脂质体LIPOFACTIN将pEGFP-ClAPG5/APG5β载体转入人肝细胞株和Hela细胞株。在共聚焦激光显微镜下观察两者的表达发生在凋亡的细胞。在凋亡诱导刺激下表达随凋亡出现而时间前移。APG5系统发育分析证明该基因从单细胞生物到多细胞生物一直保留，这种基因的水平传播说明其具有高度的保守性，是生命体功能所必需的重要基因。APG5与APG5β蛋白功能预测的比较分析发现，APG5β细胞定位预测在细胞外包括细胞膜（4.3％）和高尔基体（4.3％）有分布，缺少两个蛋白激酶C磷酸化位点和一个酪蛋白激酶磷酸化位点，少一个酪氨酸激酶磷酸化位点。采用4096条人类基因的cDNA芯片检测3－MA自噬抑制剂在凋亡诱导的人肝细胞株L02基因表达谱的改变。实验结果数据分析，151条表达差异基因中，74条表达上调；77条表达下调。APG5无表达差异。在诱导自噬和抑制自噬后凋亡诱导的细胞超微结构的变化中发现，不管诱导或抑制自噬，对凋亡的发生未产生明显的影响。其表现形式兼有两种细胞死亡的特点，即自噬性凋亡。同时发现凋亡小体的一种不同于出泡的形式的形态学改变--散离的形式解体，这是一种较出泡更为节省能量的解体形式。 实验结果证实，自噬程序性细胞死亡与凋亡是两条不同的程序性细胞死亡路径。在生理状态下，自噬是细胞为维持生存的主动过程。在病理状态下，自噬无能力清除损伤的细胞器才发展为细胞死亡。而凋亡是生命体主动以部分细胞的死亡来维持生存的主动过程。这是维持机体内环境稳定的两个动态定量平衡关系，它们在宏观与微观的不同层次，以有机地辅助体系完成生命活动的调控。自噬程序性细胞死亡与凋亡不是相互孤立的，在特定的条件下可以转化。APGS／APG56蛋白可能是一种细胞骨架蛋白，参与自噬体的包裹，在自噬发展为自噬性凋亡时，自噬体就可以成为凋亡小体，APGS／APG邓蛋白以一种特异凋亡蛋白表达。从两种细胞死亡的共同膜包裹行为可以看出，主动的细胞死亡是一种保护性机制，防止了内容物溢出而产生有害作用，有利于凋亡小体以散离的形式解体，因较出泡的形式更为节省能量。
王同帅[9]2017年在《紫外线诱导人黑色素瘤A375细胞自噬与凋亡效应的初步探讨》文中进行了进一步梳理黑色素瘤(Cutaneous Malignant Melanoma,CMM),又称恶性黑色素瘤,来源于黑素细胞,呈高侵袭性,易出现远端转移。紫外线是造成皮肤表层细胞DNA损伤的主要的物理因素之一,也是诱发黑色素瘤的明确病因之一。自噬(Autophagy)与凋亡(Apoptosis)是细胞内两种程序性死亡方式。细胞自噬性降解可维持生理状态下机体的稳态,过度自噬引起的自噬失调与肿瘤、感染、神经退行性变等疾病相关。凋亡是通过激活内源性DNA内切酶而诱导的细胞死亡过程。恶性黑色素瘤的发生、发展通常与细胞凋亡基因调控失常而导致凋亡障碍有关。自噬与凋亡作为两种调控方式共同存在于细胞内,二者共同的调控因子使二者可以发生相互转化,从而决定细胞的命运。MicroRNA通过降解靶基因参与自噬与凋亡的调控。因此深入研究UVB的辐射损伤机制及microRNA在其中的作用,能为预防和靶向治疗黑色素瘤提供重要依据。研究目的探讨中波紫外线(UVB)和模拟日光紫外线对A375细胞自噬、凋亡的影响,以及自噬与凋亡相互调控来分析紫外线对黑色素瘤A375细胞的生存能力等生物学功能改变,并初步探讨microRNA-664在相互调控中的作用机制。研究方法用不同剂量的UVB(功率密度:165 μW/cm2)照射A375细胞,在照后不同时间点双荧光自噬慢病毒监测10、30、50mJ/cm2UVB照后A375细胞自噬情况的变化;CCK-8法检测增殖变化;流氏细胞术分析细胞凋亡及周期变化;qPCR检测miR-664的表达;Western Blot分析自噬、凋亡、周期、DNA损伤等生物学功能标志蛋白变化。模拟不同剂量日光照射(UVA:UVB=95:5,UVA功率密度为118μW/cm2),观察照后不同时间点A375细胞自噬、凋亡变化,并分析相应的生物学功能标志蛋白变化。研究结果(1)UVB 照射:1)0～50mJ/cm2的UVB照射,对A375细胞自噬诱导的能力呈先增高后降低的抛物线趋势,30mJ/ccm2最强。10、30mJ/cm2照射后,自噬体数量在0～6h内逐渐增多,9h开始减少。相应地,LC3、Beclin1在0～50mJ/cm2UVB照后表达先增加后减少,10、30mJ/cm2组蛋白表达在0～6h逐渐增加,9h表达减少;2)UVB照射时,10、30mJ/cm2照后均有凋亡高峰(9h)延迟于自噬高峰出现(6h),且在自噬最强时有凋亡标志蛋白表达被抑制;3)10、30mJ/cm2的UVB照射A375细胞后,细胞增殖能力均有照后0～6h逐渐增强,9h开始减弱的趋势,但两个剂量增减幅度不同。1OmJ/cm2照射后,在0～9h内,S期细胞比例增多,对应的CDK4的表达也呈逐渐增加,且9h达最大值。30mJ/cm2照射组,未见细胞周期的明显改变。在照后24h后细胞均表现为存活。(2)模拟日光紫外照射:1)不同剂量(10、30、50mJ/cm2)照后均可诱导A375细胞产生自噬,10、30mJ/cm2照射,自噬体在0～6h内逐渐增多,9h开始下降,50mJ/cm2模拟日光照射后自噬体在3h即可形成,在观察时间内均维持较高自噬水平。与之对应的,10、30mJ/cm2组LC3、Beclin1表达在6h才出现显着增加,而50 mJ/cm2组在3h已显着增加,6～12h持续高表达;2)单纯UVA、单纯UVB及模拟日光紫外照射方式分别照射A375细胞后,叁者对自噬诱导能力的由强到弱依次为:模拟照射>单独UVB照射>单独UVA照射;3)30mJ/cm2模拟日光紫外照射A375细胞后,凋亡高峰(照后9h)延迟于自噬高峰(照后6h)出现,且自噬高峰有凋亡蛋白Caspase3/9的表达降低。抑制自噬后,6h、9h凋亡蛋白Caspase3/9表达增加。(3)较于黑素原代细胞,miR-664在A375细胞中呈低表达,上调miR-664后,UVRAG、Beclin-1表达降低,Atg5、Atg12表达量上升,BAX及Bcl-2无明显变化。研究结论1.10、30mJ/cm2的UVB照射,诱导A375细胞产生的自噬促进细胞增殖,对细胞呈保护作用,10mJ/cm2的UVB照射,可诱导细胞发生S期阻滞;2.UVB或模拟日光紫外照射可诱导A375细胞产生自噬,UVB是主要贡献者;3.紫外照射诱导产生的自噬可以延迟凋亡的发生,促进细胞存活;4.A375细胞中miR-664的表达低于黑色素原代细胞,miR-664可能参与紫外诱导A375细胞自噬与凋亡相互调控。
齐亚莉[10]2011年在《电离辐射诱导人乳腺癌MCF-7细胞自噬及其与凋亡关系的研究》文中研究说明乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。近年来,我国妇女乳腺癌的发病率呈明显上升趋势。乳腺癌的治疗主要包括手术、放疗和化疗,但这些疗法都存在一定的局限性,不能达到彻底根治的目的。特别是,在放疗诱导乳腺癌细胞凋亡过程中,常会出现肿瘤细胞的辐射耐受现象,从而逃逸凋亡,达不到理想的治疗效果。然而,自噬性死亡是区别于细胞凋亡的另一种细胞程序性死亡路径,可能逃逸凋亡的肿瘤细胞发生自噬性死亡。因此,电离辐射诱导乳腺癌细胞自噬性死亡正在成为乳腺癌治疗的一个新热点。本研究应用生物化学、细胞生物学和分子生物学方法,以及电离辐射联合自噬和凋亡抑制剂、诱导剂,建立基因过表达和干扰模型,观察电离辐射诱导人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡、自噬、细胞周期进程、基因和蛋白水平表达的变化。探讨电离辐射诱导肿瘤细胞自噬及其与凋亡的相关性,为提高乳腺癌放疗临床应用提供理论和实验依据。实验结果表明,电离辐射能够诱导MCF-7细胞自噬和凋亡；电离辐射联合自噬抑制剂和泛凋亡抑制剂有促进MCF-7细胞增殖和抑制凋亡的作用。电离辐射联合自噬诱导剂使beclin-1、LC3B、p53和Bax mRNA表达升高,Akt1和Bcl-2mRNA表达降低；电离辐射联合自噬抑制剂使beclin-1、LC3B、p53和Bax mRNA表达降低；Akt1和Bcl-2 mRNA表达升高；电离辐射联合凋亡抑制剂使LC3B、Bax和p53 mRNA表达降低,Bcl-2和Aktl mRNA相对表达量显着升高,beclin-1 mRNA相对表达无明显改变。在基因过表达和干扰模型中,beclin-1基因过表达能够促进MCF-7细胞自噬性死亡,细胞增殖减缓,G2/M期阻滞,细胞凋亡增加。beclin-1和p53蛋白表达增加。Akt1基因干扰促进了MCF-7细胞凋亡和自噬性死亡。Akt1基因干扰使MAP1LC3B和p53 mRNA相对表达升高,Bcl-2 mRNA相对表达降低。Akt1基因过表达则抑制MCF-7细胞凋亡和自噬性死亡电离辐射在诱导MCF-7细胞自噬的同时,也诱导了凋亡。Beclin-1基因能够正调控MCF-7细胞自噬和凋亡。Akt1基因负调控MCF-7细胞自噬和凋亡自噬与凋亡虽然是两条不同的程序性细胞死亡途径,但二者有重迭部分。
参考文献：
[1]. 冬凌草甲素及Fas激动型抗体CH11诱导人肿瘤细胞自噬和凋亡调节机制的研究[D]. 张亚宏. 沈阳药科大学. 2009
[2]. 肿瘤发展过程中自噬与凋亡的相互作用[J]. 阚月一, 王娅杰, 李琦, 李玉洁, 杨庆. 中国比较医学杂志. 2018
[3]. 线粒体自噬与自噬在猪瘟病毒感染中的作用机制及猪瘟病毒感染的代谢组学研究[D]. 勾红潮. 华南农业大学. 2016
[4]. 大黄素衍生物E35诱导急性髓系白血病细胞HL-60及Kasumi自噬与凋亡的作用研究[D]. 张黎. 福建医科大学. 2016
[5]. 多氯联苯醌诱导细胞发生自噬以及自噬—凋亡转换的机制分析[D]. 石琼. 西南大学. 2017
[6]. 肺积宁方对Lewis肺癌抗肿瘤作用及自噬效应的实验研究[D]. 周立江. 辽宁中医药大学. 2016
[7]. ATF6在内质网应激引起的HepG2细胞自噬与凋亡中作用机制的研究[D]. 王丛丛. 中国农业大学. 2014
[8]. 自噬与凋亡分子水平相关关系的探讨[D]. 陈英. 第一军医大学. 2001
[9]. 紫外线诱导人黑色素瘤A375细胞自噬与凋亡效应的初步探讨[D]. 王同帅. 南方医科大学. 2017
[10]. 电离辐射诱导人乳腺癌MCF-7细胞自噬及其与凋亡关系的研究[D]. 齐亚莉. 吉林大学. 2011
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