【关键词】多重PCR;致病菌；基因；扩增
【中图分类号】R155.3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）11-0381-03
致病菌污染已成为全球性的公共卫生问题，也是影响食品安全的最主要原因之一，能及时，准确地检出致病菌是社会发展的需求[1]。传统的微生物培养法是微生物的“金标准”，但培养法一般需要经过前增菌或增菌、分离培养、生化鉴定及血清学鉴定等几个步骤；整个检测过程繁琐、耗时长、工作量大,一般需要4～7d才能出检测结果[2-3]。近年来，PCR技术发展十分迅速,它具有高效、低成本、高灵敏度等优点，其中的多重PCR是通过对PCR技术的改进而建立起来的一种体外扩增技术，是在同一扩增体系中通过加人多对引物从而对多条目的DNA片段进行扩增，具有能一次性检出多种致病菌、灵敏度高、特异性强、快速的优点,并且随着研究的深入和发展，多重PCR技术在致病菌中的应用领域也越来越广泛[4-5]。
1.多重PCR在致病菌检测的概念和特点
多重PCR是在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,多重PCR技术已被广泛应用于核酸诊断的许多领域，包括基因敲除分析、突变和多态性分析、定量分析及RNA检测等。利用一次多重PCR反应，可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和极高的实用价值[6]。
多重PCR能一次性检测多种病原微生物或对同一致病原微生物多种分型和毒力，有较强的高效性、灵敏度；如增菌可在24小时内得出结果，不增菌可在3～5小时内得出结果，自动化程度高，检出时间短,操作简单，试剂成本相对低，适合检测成组病原微生物[7-8]。
2.多重PCR在致病菌检测中的应用
2.1 用于检测一种或多种不同的致病菌
针对每一种病原的单个特异基因进行多重检测，不同病原菌高度保守基因、特异性基因和毒素基因设计相应的引物，可同时检测一种或几种病原体的存在与否，进行PCR扩增时，在同一PCR反应管中同时加入多种病原微生物的特异性引物，能够同时检测多种病原体。李争等[9]利用大肠埃希菌0157：H7抗原基因保守序列fliCh7和rfbE设计2对引物建立微量快速检测大肠埃希菌0157：H7的多重PCR方法,经验证该方法特异性、灵敏性和重复性均良好。祝岩波等[10]根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌LasI基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因和细菌通用16SrRNA基因设计出特异性引物；经过多重PCR引物浓度和退火温度的优化，特异性和敏感性的检测，建立多重PCR体系。吴建英等[11]以金黄色葡萄球菌nuc基因、产单核李斯特菌hlyA基因和沙门菌invA基因设计的特异引物，通过多重PCR对上述3种食源性致病菌的目的基因进行扩增，同时对反应体系进行优化,认为浓度分别为160、80和40nmol/L时为实验的最佳浓度，结果显示本实验的检出限为5cfu/ml，具有简便、快速、经济，具有较好的应用前景。李洋洋等[12]为了建立同时检测婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的多重PCR方法，根据阪崎肠杆菌ompA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、蜡样芽孢杆菌hblA基因分别设计3对引物进行多重PCR扩增，结果多重PCR扩增出长度为514、156、235bp的特异性目的条带，不增菌的情况下，多重PCR同时检测3种病原菌的灵敏度是103cfu/mL，准确、快速、高效，为同时检测婴幼儿奶粉中的病原微生物检测提供了新方法。陈娟等[13]根据沙门菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的16SrDNA基因、大肠杆菌O157:H7的eaeA基因、单核增生李斯特菌的hlyA基
因和福氏志贺菌的ipaH基因设计5对特异性引物进行多重PCR检测，对反应条件包括镁离子浓度、引物浓度和退火温度进行优化试验，最佳反应条件为金黄色葡萄球菌、沙门菌和福氏志贺菌引物浓度为0.25μmol/L，单核增生李斯特菌引物浓度为0.4μmol/L，大肠杆菌0157：H7引物浓度为0.3μmol/L，Mg2+浓度为2.25mmol/L，退火温度为60℃；在此条件下5种病原微生物的多重PCR的DNA检出限分别为6.4、32、32、800和160pg,对实际应用有指导意义。
2.2 用于同一病原微生物的毒力、分型等的检测
传统方法进行致病菌的毒和力分型检测等，一般采用增菌、分离培养、生化鉴定、和血清学试验等步聚，整个检测过程存在工作量大、检测周期长、工作繁琐、操作和判定不容易、成本高等缺陷。而多重PCR在同一反应管内同时对多个目的基因进行扩增分析，检测更简便，灵敏度、特异性更高，耗时更短等特点。林佳琪等[14]分别以副溶血性弧菌的toxR、tdh、trh、tlh4个基因为靶基因，设计4对特异性引物，对4对引物浓度和退火温度进行优化，获得最佳引物比例和扩增条件，建立快速检测致病性副溶血性弧菌的四重PCR体系,该方法可实现同时检测携带toxR、tdh、trh、tlh4种基因的副溶血性弧菌，对开展致病性副溶血性弧菌的检测研究具有一定现实意义。孟庆美等[15]建立禽致病性大肠杆菌黏附相关基因、侵袭及毒素相关基因、抗血清存活相关基因及铁转运相关基因的多重PCR方法，实现禽致病性大肠杆菌毒力基因的简便、快速检测。倪奕弘等[16]对引起人类和动物肠道内或肠道外疾病的6种病原型大肠杆菌的47个毒力基因，采用多重PCR方法对38株大肠杆菌和4株志贺氏菌进行毒力基因的分布调查及系统进化分类。刘琪等[17]建立的多重PCR检测方法分别对猪链球菌血清2型、7型和9型扩增出特异性片段，片段大小分别是360、600、800bp。该方法特异性良好，与猪链球菌其他29个血清型均无交叉反应，可应用于实验室的快速诊断以及猪链球菌的流行病学调查。任斌[18]根据 Genbank 已报道的porinⅠ基因序列，设计合适的扩增引物和porinⅠ基因类型检测引物，运用多重PCR技术对确诊的浙江地区的奈瑟淋球菌临床菌株进行检测和类型分析，结果在分析的43株确诊的奈瑟淋球菌临床菌株中，建立的多重PCR法对porinⅠ基因检出率为100%，对porinⅠ基因分型正确率为95.35%，能用于奈瑟淋球菌临床株porinⅠ基因的的快速检测和分型。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆彭拓华等[19]分别采用多重PCR和荚膜肿胀试验对568株肺炎链球菌进行血清分型，568株肺炎链球菌中，213株通过荚膜肿胀试验分出13个血清群分型率为37.5％（213／568），356株通过多重PCR分出21个血清群,分型率为62.7%（356／568）,多重PCR的分型率高于荚膜肿胀试验。
2.3 用于致病菌耐药基因的检测
致病菌易出现变异菌株，其中最常见的是耐药性转移，但传统的药物敏感试验操作繁琐，时间比较长，很难及时得到致病菌的敏感抗生素，导致了临床上抗生素的滥用，一定程度上加速了耐药菌及多重耐药菌的出现。应用多重PCR方法可以同时对病原菌进行多种耐药基因的筛选,方便快捷地得到相关致病菌的耐药资料。王江元等[20]用多重PCR检测鲍曼不动杆菌6种耐药基因，并统计分析82例鲍曼不动杆菌耐药基因与相应抗生素的关联，比对耐药基因检出率及抗生素耐药率对应情况,结果多重PCR检测鲍曼不动杆菌灵敏性高、稳定性强；可尽早、快速、高效地指导临床用药。赵彩芸等[21]对250株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌经多重PCR方法检测SCCmec基因型分型，主要对无功能区不同位点处的基因进行复合扩增，该方法是根同时扩增出现的多条带形成的谱型来判定不同的型别。战晓微等[22]为了解食源性金黄色葡萄球菌中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及对氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素抗生素的耐药性情况，并建立快速检测鉴定金黄色葡萄球菌耐药性多重PCR方法,利用所建立的方法检测72株食品及食物中毒患者来源的金黄色葡萄球菌,72株金黄色葡萄球菌均有nuc基因检出，mecA基因与MRSA检测符合率达100%，aacA－aphD、aph(3')－Ⅲa基因与庆大霉素、卡那霉素耐药菌株的符合率达95.12%。
3.多重PCR检测致病菌的影响因素和应用前景
多重PCR虽为一种特异灵敏、简便快速、高通量的检测技术，但其在实际应用中也存在问题，污染问题就是其中之一,有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果[23]；在多重PCR试验中,发现在条件优化不好的情况下会产生大量非特异性产物和引物二聚体,这跟引物扩增基因和扩增条件有关系。同时，多对引物同时扩增，各种实验条件控制不当，很容易导致扩增失败或非特异性产物；引物的设计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏度和特异性[24]。
多重PCR虽然存在一些问题，但传统检测方法灵敏度低、特异性不高、操作繁琐、耗时长等问题的相对于多重PCR操作简单、快速,具很高的特异度和敏感高的优势是不可比拟的, 多重PCR极大减轻了工作量和提高了工作质量,为快速检测和鉴定常见致病菌提供了有效的手段,可以推广应用于水源检测、环境监测、商品检验检疫、食品卫生监督等领域,具有较广阔的应用前景和较大的经济与社会效益[25]。
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论文作者:吴科明
论文发表刊物:《医药前沿》2018年4月第11期
论文发表时间:2018/4/12
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