张婧
（兰州军区乌鲁木齐军区总医院肿瘤科 甘肃 兰州 830000）
【摘 要】目的：探讨电子线照射、培美曲塞、培美曲塞+电子线照射对人肺腺癌SPC-A4细胞凋亡产生的影响。方法：用细胞培养技术培养人肺腺癌SPC-A4细胞，通过MTT比色法分析电子线照射组、培美曲塞组、培美曲塞+电子线照射组对SPC-A4细胞的毒性作用。采用流式细胞术AnnexinV-FITC／PI双染法分析细胞凋亡率。结果：体外细胞毒性实验证明电子线照射组、培美曲塞组、培美曲塞+电子线照射组均对SPC-A4细胞有体外杀伤作用。电子线照射组、培美曲塞组、培美曲塞+电子线照射组均有凋亡发生。与空白对照组相比，电子线照射组、培美曲塞组、培美曲塞+电子线照射组的细胞凋亡率，差异有统计学意义(F=235．76，P<0．01)，其中培美曲塞+电子线照射组凋亡作用最明显，凋亡率达(48．7±0.76)％ ，显著高于电子线照射组、培美曲塞组(P<0．01)。结论：电子线照射、培美曲塞、培美曲塞+电子线照射三种处理方法均可诱导人肺腺癌SPC-A4细胞发生凋亡，培美曲塞+电子线照射诱导人肺腺癌SPC-A4细胞的凋亡率明显高于培美曲塞及电子线照射。
【关键词】培美曲塞；电子线；人肺腺癌SPC-A4细胞 凋亡
【中图分类号】R734.2 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0521-02
The effect of pemetrexed on radiotherapeutic sensitivity of lung adenocarcinoma cell
Zhang Jing
【Abstract】Objective In order to find out how to enhance the apoptosis rate of SPC-A4 cell.The effect of SPC-A4 cell apoptosis induced by electron rays or pemetrexed disodium or combination of pemetrexed disodium with electron rays was studied. Methods Observe cell growth inhibition by MTT.Detect cell apoptosis by flow cytometry Result electron rays or pemetrexed disodium or combination of pemetrexed disodium with electron rays could significantly reduce the growth of SPC-A4 cell. Electronic line irradiation group,the pemetrexed group, pemetrexed and electronic line irradiation group, the apoptosis rate, the difference was statistical significance (F=235.76, P < 0.01). The apoptotic effect of the The pemetrexed and electron irradiationmost was obvious, and the rate of apoptosis (48.7 + 0.76%) was significantly higher than that of the other group (P < 0.01).Conclusion apoptosis of lung cancer cell could be induced by combination of pemetrexed disodium and electron rays or only pemetrexed disodium or electron rays.A combination of pemetrexed disodium and radiation achieved better effect of apoptosis than pemetrexed disodium or electron rays.Pemetrexed disodium enhanced sensibility of electron rays.
【Key Words】Pemetrexed Disodium;electron rays;SPC-A4 cell;Apoptosiss
肺癌是常见的恶性肿瘤之一，自2002年以来，全世界肺癌的新增病例及死亡病例均为恶性肿瘤第一位。因此肺癌的治疗是目前研究的热点[1]。因为缺乏有效的早期确诊的手段，大多数肺癌在确诊时已属晚期，无法手术切除，因此全身化疗及局部放疗是目前晚期肺癌的有效治疗手段。但大多数实体肿瘤因供血不足而处于缺氧状态。在缺氧条件下，癌细胞对射线的耐受能力提高，治疗效果差。为了克服这一困难，可以往细胞中引入辐射敏化剂。因此目前如何增强乏氧细胞对放射线的敏感性成为提高放疗疗效的重要研究方向[2]。
培美曲塞是一种新型抗叶酸抗代谢药物，作用靶点包括嘧啶和嘌呤合成中的多种酶。在体外和临床试验中显示出广泛的抗瘤活性，是目前临床常用的治疗非小细胞肺癌的药物之一，培美曲塞单药治疗晚期肺腺癌副反应少安全性高[3]，可作为增敏剂使用，目前多个培美曲塞联合其他方法治疗肺癌的临床试验均显示其可在不增加毒副反应的情况下提高疗效[1,2,4 ,5]。，本实验通过对比电子线照射、培美曲塞、培美曲塞+电子线照射对人肺腺癌SPC-A4细胞凋亡产生的影响，比较三种处理方法诱导肺腺癌细胞凋亡的差异，为培美曲塞联合放疗的临床应用提供实验依据。
1 材料和方法
1.1材料
1.1 肿瘤细胞：小鼠肉瘤细胞S180(购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞学研究所。
1.2 试剂和仪器：培美曲赛江苏豪森药业有限公司，流式细胞技术采用BD公司生产的细胞凋亡检测试剂盒。使用的实验仪器主要有直线加速器、CO2培养箱中、流式细胞仪、酶联免疫检测仪等。RPMI一1640培养液(Gibco公司)；新生牛血清(杭州四季清生物工程材料研究所)；四氮唑蓝（MTT, Sigma公司)；紫外分光光度计(Beckman DU series 530)。
1.2方法
1.2.1 人肺腺癌SPC-A4细胞细胞培养及传代：
将人肺腺癌SPC-A4细胞以4×105/ml的密度接种于50ml培养瓶中，加入RPMI-1640培养基10ml，置于CO2培养箱中（5% CO2，37℃，饱和湿度），每3日换液传代1次。取对数生长期的腺癌细胞为实验对象[6]。
1.2.2 MTT法检测三种处理方式对肿瘤细胞抑制作用
以四唑盐比色法(MTT法)检测。 取对数生长期的人肺腺癌SPC-A4细胞按5×103/孔加于96孔板中，培养24h后，分为3个实验组：电子线照射组、培美曲塞组、培美曲塞+电子线照射组，细胞接种于96孔板，设空白调零孔，每个剂量点设6个复孔，细胞贴壁后1组给予电子线照射（单次射线照射4 Gy），2组给予培美曲塞药物处理，培美曲赛50?l（药物浓度为1mmol／L），阴性对照孔加无血清1640 50?l。培养24 h后在2组加入培美曲赛药物组中选取1组进行照射（单次射线照射4 Gy）。照射后将96孔板置于37℃ 、5% CO2培养箱内24 h，按50?l／孔加入无血清1640配置的MTT（2mg/mL）37℃放置24 h，加入DMSO150?l/孔，酶标仪测定560nm吸收度。计算杀伤率(%)= (1-处理组A值/空白对照组A值)×100％。
1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡率
将人肺腺癌SPC-A4细胞接种于6 cm培养皿中，待培养至6o％ 一70％ 细胞融合后，将细胞分成四个处理组：空白对照组、电子线照射组、培美曲塞组、培美曲塞+电子线照射组。其中电子线照射组组单次射线照射为4 Gy，培美曲赛组为其作用48 h，培美曲塞+电子线照射组为培美曲赛组为其作用48 h后进行电子线照射，剂量为4Gy。处理48 h后，收集细胞，加入AnnexinV-FITC、PI后，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。实验重复3次，取平均值分析各组细胞的凋亡率。
1.3统计学处理
采用SPSS17．0进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差( ±s)表述。各组药物对肿瘤细胞抑制率F、LSD-t 检验，以P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 偶联物体外细胞毒性试验：
如(表1)所示电子线、培美曲赛、培美曲塞+电子线照射均对肿瘤细胞有杀伤作用。电子线组、培美曲赛组对肿瘤细胞杀伤作用较培美曲塞+电子线组有所下降（P< 0.05）。
对肿瘤细胞杀伤效应 （ ±s）
组别电子线照射组培美曲赛组培美曲塞+电子线照射组
细胞杀伤率 (%) 57.21±0.1466.39±1.2388.91±2.24
1）电子线照射组与培美曲塞+电子线照射组比较t=32.68 P<0.05
2）培美曲赛组IgG与 培美曲塞+电子线照射组比较t=21.50 P<0.05
3）培美曲赛组与电子线照射组比较t=8.91 P<0.05
两两比较时用LSD-t检验
2.2 流式检测H358细胞凋亡率
经过AnnexinV-FITC和PI双染后，活细胞既不被AnnexinV—FITC染色也不被P1染色，位于左下象限，凋亡早期的细胞被AnnexinV—FITC染色不被PI染色，位于右下象限，坏死细胞和凋亡晚期的细胞同时被AnnexinV—FITC和PI染色，位于右上象限，左上象限内的细胞是许可范围内的误差。按照空白对照组、电子线照射组、培美曲塞组、培美曲塞+电子线照射组处理48 h后，计算早期和晚期凋亡率，结果如图1—图4所示：与空白对照组相比，电子线照射组、培美曲塞组、培美曲塞+电子线照射组的细胞凋亡率，差异有统计学意义(F=235．76，P<0．01)，其中培美曲塞+电子线照射组凋亡作用最明显，凋亡率达(48．7±0.76)％ ，显著高于电子线照射组、培美曲塞组(P<0．01)，表明培美曲塞可诱导人肺腺癌SPC-A4细胞凋亡，且培美曲塞联合电子线照射可增加人肺腺癌SPC-A4细胞凋亡。
3 讨论
化疗增敏药物的前提是化疗药物的毒副反应较小，不会影响放疗的进程。现已有大量临床研究显示培美曲塞可以在不增加毒副反应的同时，提高放疗疗效[8,9]。本实验结果表明，电子线照射、培美曲塞、培美曲塞+电子线照射均能诱导人肺腺癌SPC-A4细胞凋亡（与对照组相比P<0.01）。本研究得出，与对照组相比，电子线照射组、培美曲塞组、培美曲塞+电子线照射组的细胞凋亡率皆增多，其中电子线照射组、培美曲赛组凋亡率为(30．4+2．17)％ 、(22．7+2．24)％ (P<0．05)，培美曲塞+电子线照射组凋亡率最高，为(44．3+1．85)％(P<0．01)。表明培美曲赛可显著诱导人肺腺癌SPC-A4细胞的凋亡，且培美曲塞+电子线照射组可增强诱导SPC-A4细胞凋亡。凋亡被认为是一种重要的放射敏感性指标，有文献报道，放疗是通过诱导凋亡发生来i大到治疗目的的 -22]。如上所述，培美曲赛可显著诱导SPC-A4细胞的凋亡，说明通过诱导凋亡增加而增加细胞对放射线的敏感性是培美曲赛对肺癌放射增敏的一种机制。有文献报道，放疗是通过诱导凋亡发生来达到治疗目的的 -22]。
参考文献：
[1]黄岩，刘云鹏，周建英 培美曲塞联合顺铂对比吉西他滨联合顺铂一线治疗晚期非鳞非小细胞肺癌的随机、对照、多中心临床研究［J］.中国肺癌杂志，2012, 15(10) 9-13.
[2]谷见法,冯沛贝,路平 三氧化二砷联合热疗对食管癌细胞株EC-1放疗的增敏作用研究[J].中国全科医学.2014,(24):2826-2830.
[3]牛晓青 培美曲塞和多西他赛单药二线治疗晚期非小细胞肺癌的疗效及安全性分析[J].河北医药，2014,2（36）：513-514
[4]贡海，景军，诸庆亚 培美曲塞结合图形引导调强放射治疗非小细胞肺癌的临床应用[J].实用临床医药杂志，2013, 17 (11): 106-107.
[5]胡建新 非鳞癌局部晚期肺癌三维适形放疗联合培美曲塞的疗效[J].实用医学杂志.2012,(12):2014-2016.
[6]张登山, 刘留成 叶酸受体介导盐酸小檗碱长循环脂质体制备及药效学研究[J]. 中国药师, 2014, (1):8-13.
[7]尹海权, 王明召 分离DNA的琼脂糖凝胶电泳技术[J]. 化学教育, 2012, (12):1-2.
[8]卢奕宇,杨文,唐武兵,等 比较培美曲塞和紫杉醇同期化放疗治疗局部晚期老年肺腺癌临床观察[J].中华肿瘤防治杂志.2012,(06):450-452.
[9]Qi Qi,Yongheng An,Hongsheng Yu,等 培美曲塞联合放疗对肺损伤的实验研究(英文)[J].The Chinese-German Journal of Clinical Oncology.2014,(04):153-156.
[10]Qin SD, Yang CC, Li S,et al Smac: its role in apoptosis induction and use in lung cancer diagnosis and treatment [J]. Cancer Letters, 2012，38(1)：9-13.
作者简介：
张婧，女，1982年出生，硕士，主治医师，主要从事肿瘤方面的治疗研究。
论文作者:张婧
论文发表刊物:《河南中医》2015年8月供稿
论文发表时间:2016/5/31
标签：细胞论文; 电子线论文; 凋亡论文; 腺癌论文; 肺癌论文; 诱导论文; 晚期论文; 《河南中医》2015年8月供稿论文;