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【摘 要】目的：通过实验确定检查羟喜树碱注射液的细菌的内毒素的可行方法。方法：参考2015年版《中国药典》收录的检查细菌内毒素的方法，确定检查原则，展开试验，测定羟喜树碱注射液中的细菌内毒素情况。结果：在供试品的干扰试验环节中，羟喜树碱注射液的配比为2ml：5mg，将其稀释50倍之后，检查细菌内毒素并未出现干扰现象。结论：《中国药典》中的检查细菌内毒素的方法在检测羟喜树碱注射液时同样可发挥作用，这一方法的适用性强，应用效果好。
【关键词】羟喜树碱注射液；细菌内毒素；检查方法
羟喜树碱注射液是当前比较常见的具有抗癌功能的药品，其属于抗肿瘤药品，在治疗多种恶性肿瘤的过程中可发挥良好的作用，包括膀胱癌、肝癌、直肠癌与白血病等，使用该药品时，需关注其含有的细菌内毒素的情况，脂多糖是细菌内毒素的基本构成成分，具有激活人体中粒新细胞的功能，使内源性热原物质从细胞中被释放出来。检查这种物质构成成分时，需要运用标准化的方法，避免使检查结果出现错误，影响到注射液的正常使用。现结合《中国药典》，根据其提供的方法来检查该种注射液，确认其细菌内毒素的情况，现设计相关干扰实验，实验过程如下：
1 材料与方法
1.1 一般材料
细菌内毒素工作品， 鲎试剂(0 .25 Ev/ ml， 0.1 ml/支)。
样品：羟喜树碱注射液(5 ml：10 mg)。
仪器：电热干燥箱， 旋涡混合器， 电热恒温水浴箱。
玻璃器材：试管， 刻度吸管。
1.2 方法
试验所用器材，经250℃烘烤2h以上，除去可能存在的外源内毒素。
2 结果
鲎试剂灵敏度的复核按《中国药典》(2015)二部附录XI细菌内毒素检查法进行。所用上述批号鲎试剂灵敏度为0.25Eu/ml，其灵敏度标示符合规定，鲎试剂可用于试验。
样品细菌内毒素限值(L)及最大有效稀释倍数(MVD)的确定依据2015《中国药典》二部分修订部分要求，羟喜树碱注射液的内毒素限值L=K/M，根据本品用法用量:K=5Eu/(kg·h)、M=15ml/(60kg·h)、L=20Eu。内毒素限量每1ml羟喜树碱中含内毒素的量应小于20Eu，即每1mg羟喜树碱中含内毒素的量应小于10Eu。最大稀释倍数MND=L/λ=2×10/0.25=80(倍)，根据试验需要将样品溶液配成浓度Co为1mg/ml，λb为鲎试剂灵敏度标示值0.25Eu/ml。
干扰试验用BET水将羟喜树碱注射液稀释至最大有效稀释倍数(MVD)下浓度(0.025mg/ml)的溶液，用上述稀释液将细菌内毒素工作标准品按细菌内毒素稀释法稀释，得到一系列含0.5，0.25，0.125，0.06Eu/ml内毒素浓度的系列溶液，再按鲎试剂灵敏度复核操作步骤进行干扰试验，Et在0.5～2.0Es范围内，显示该批样品在0.025mg/ml稀释浓度下对试验无干扰作用。
样品的检测取样品，按《中国药典》(2015)二部附录XIE细菌内毒素检查法考察其内毒素限值结果。
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3 讨论
鲎试剂经常会被运用到检查细菌内毒素的工作中，主要是因为其敏感度极高，操作使用方法简单，可以代替其他常规检查方法，在药品质量检查过程中发挥着重要作用，其比较适合被运用到热原检查环节中，检查羟喜树碱注射液中的细菌内毒素的含有情况时也使用了这种方法，完成检查工作后获取了精准可信的检查结果。鲎试剂属于冷冻无菌干燥型产品，其制备原料为鲎这种动物的血液变形细胞灭菌，进行溶解加工处理之后，可获取该产品，含有一定的凝固酶原，可被真菌葡聚糖与细菌内毒素激活，而后可直接凝固成蛋白质，在检查测试对象是否含有细菌内毒素的工作中可发挥重大作用，因此经常会被应用到制药工作中，常用的鲎试剂主要有东方鲎鲎试剂与美洲鲎试剂两种。细菌内毒素检查工作至关紧要，检查人员使用鲎试剂必须具有良好的灵敏度，同时自凝时间不能超过一定范围，药品的成胶状态也应当保持到良好的状态。
鲎试剂的质量主要表现在其灵敏度、自凝时间与成胶状态三个方面：灵敏度稳定；自凝时间不低于24h；具有一定的缓冲能力与合适的pH；反应后即形成坚实凝胶，将成胶安瓿翻转180°而不会被破坏。而质量稍差的鲎试剂存放一定时间后(如半年)其灵敏度可能发生变化，而灵敏度的改变会使测定结果所反映的供试品中内毒素的允许限值发生变化。因此，需选择具有国家颁发的批准文号，质量稳定的鲎试剂。
进行测试时要注意一些基本的检查工作要点，在本次针对羟基喜树碱注射液的检查工作中，检查环境整洁无污染问题，并无尘埃流通，检验人员需遵守卫生方面的工作要求，主动预防微生物污染状况，启用鲎试剂时注重避免有外部污染物进入道试剂容器中，包括瓶壁污染物与脏物等。由于鲎试剂内部含有比较几乎丰富的蛋白质物质，如果振摇力度过大，容器中会产生大量气泡，彻底清除气泡的难度高，最终的检测结果将丧失可靠性，因此应当控制震动强度。获取反应物时，需要避免接触管壁，以防实验误差增加。检查工作完成后，需清理检查环境，使所用的实验器具保持整洁，清洗实验器具之后，展开灭菌处理工作，干考消毒的时间应当长于一个小时。
生成凝胶的最适pH值为6～8，对于氯化钠注射液、葡萄糖注射液(5%，10%)等注射液，不需考虑供试液的pH值，而检查其他制剂时，尤其是一些本身缓冲能力较强或偏酸、碱的供试品，应考虑供试品的pH值。
一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。另一类为内毒素。是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。
细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为1至100EU/ml。当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害。内毒素大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。由于家兔对热原的反应与人基本相似，所以半个世纪以来用家兔来检测热原，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。
供试品干扰实验提示羟喜树碱注射液(2ml∶5mg)经50倍稀释后在该浓度下供试品溶液不干扰细菌内毒素检查，即规定羟喜树碱注射液每1ml中含内毒素量应小于25EU是确实可行的，本实验说明细菌内毒素检查法适用于羟喜树碱注射液细菌内毒素的检查。
检查过程中使用鲎试剂需被妥善保管，在试剂在常温条件下能够保持稳定的状态，尽量将存储空间温度控制到2℃到8℃之间，不可将试剂长期存放到温度超过25℃的环境中，如果温度条件不合适，试剂会加大的实验误差，检查羟基喜树碱注射液的工作也将形成问题，这种内毒素检查方法的使用效果好，可在其他物质的细胞内毒素检查过程推广该方法与相应试剂。
参考文献
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论文作者:赵冬明
论文发表刊物:《中国医学人文》2019年第04期
论文发表时间:2019/6/12
标签：内毒素论文; 喜树碱论文; 细菌论文; 注射液论文; 试剂论文; 灵敏度论文; 方法论文; 《中国医学人文》2019年第04期论文;