（1 武警山东省总队医院；2 山东省中医药研究院；山东济南250014）
【摘要】目的：利用药代动力学方法，以黄芩苷为考察指标，研究柴胡黄芩药对配伍的体内代谢情况，为药效学提供更有力的数据支持。方法：①黄芩苷血药浓度测定方法学研究：色谱柱Diamonsil C18柱（4.6mm*250mm，5µm）；流动相为水-甲醇-0.2%磷酸（53：47）；进样量为20µL；柱温：35℃；流速：1mL/min。进行含药血清黄芩苷方法学考察。②不同配伍柴胡黄芩含药血清主要考察指标黄芩苷的含量测定：采集灌胃后10min，20min，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h，9h，10h，11h，12h， 14h，24h时间点的血样，按照建立的黄芩苷检测方法进行含量测定。结果：大鼠灌胃黄芩柴胡1:0提取物后，黄芩苷经0.67 h 可达最大吸收峰，峰浓度（Cmax）为53.96mg·mL-1，血药浓度-时间曲线下面积（AUC0→24h）为314.082 mg·（L﹡h）-1，黄芩苷在体内的滞留时间（MRT0→24为8.671h）；1:1提取物组，Tmax为0.33 h，Cmax为26.07 mg·mL-1，血药浓度-时间曲线下面积（AUC0→24h）为284.796 mg·（L﹡h）-1，黄芩苷在体内的滞留时间（MRT0→24h为10.39 h）；1:2提取物黄芩苷经14 h可达最大吸收峰，黄芩苷在滞留时间14 h可达最大吸收峰，峰浓度（Cmax）为25.84mg·mL-1，血药浓度-时间曲线下面积（AUC0→24h）为344.121 mg·（L﹡h）-1，黄芩苷在体内的滞留时间（MRT0→24h为11.879h）。结论：1:1提取物黄芩苷吸收加快，吸收量无明显变化，但在体内的滞留时间增长；黄芩柴胡1:2提取物黄芩苷吸收滞后，吸收量增加，在体内的滞留时间更长，从而能使其在体内发挥药效时间增长，可见三个配伍比例中，柴胡黄芩1:2配伍组黄芩苷在体内滞留的时间更长。
【关键词】药对/柴胡黄芩；药代动力学；黄芩苷
[ 中图分类号 ]R2[ 文献标号 ]A[ 文章编号 ]2095-7165（2019）02-0233-01
1、仪器与材料
1.1仪器
Waters高效液相色谱仪514泵，色谱工作站（采用ANASTAR数据处理系统），紫外检测器（Model 500 laballiance型，美国SSI公司产品）；超声波清洗器（中国玉环曙风企业制造）；微量进样针（Finnpipette 20-200µL，100-1000µL）；XW-80A漩涡混合器（上海其林贝尔仪器制造有限公司）；PICO17型高速离心机（北京路达恒宇科技有限公司）；DDL-5型低速冷冻离心机（冠森生物仪器厂）；恒温水浴箱（上海医疗器械五厂）；SM-06型电吹风（宁波市塑料电机厂）；BP211D型十万分之一分析天平（上海赞维衡器有限公司）；SLSH-74型肝素化离心管（湖南省浏阳医用仪具厂，3mL）；一次性离心管（1mL）；ZH06-16型大鼠灌胃针（北京中西远大科技有限公司）；微量进样针（北京捷安杰微量进样器厂，25µL）；标准熔点毛细管（上海同兴化工仪器有限公司， 外径0.9-1.1mm）。
1.2试验用药
实验中所用药材黄芩（批号20120901）、柴胡（批号20120801）购于山东天一中药饮片有限公司，经山东中医药研究院研究员鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi和伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC1（北柴胡）的干燥根；黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：1215-9707）；色谱乙腈（天津四有精细化学品有限公司用品，批号：080612101）；色谱甲醇（北京市恒大化学试剂开发中心，批号：20130821）；磷酸（四川省琳宇化工有限公司，分析纯）；95%乙醇（山东酒精总厂，药用酒精，批号：2013122001）；实验用水（杭州娃哈哈集团有限公司，纯净水）。
1.3实验动物：雄性SPF级wistar大鼠，体重约300±25g，由山东中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鲁）20130001，№：0008636。
2、黄芩苷血药浓度测定方法学研究
2.1色谱条件：色谱柱Diamonsil C18柱（4.6mm*250mm，5µm）；流动相为甲醇-水-0.2%磷酸（47：53）；检测的波长：280nm；进样量为20µL；柱温：35℃；流速：1mL/min。
2.2对照品溶液的制备
2.2.1黄芩苷对照品溶液：取黄芩苷对照品加甲醇,配成41µg/mL的对照品溶液。
2.2.2空白对照液：取大鼠空白血浆作空白对照液。
2.3供试品溶液的制备[1-2]：称取黄芩为100g，加8倍量水浸泡0.5 h，加热回流1h，过滤后，药渣再加8倍量,70%酒精回流提取1h，过滤后，回收乙醇后与水提液后合并，于3000r/min的转速离心10min，取离心后的上清液浓缩至100mL，制得黄芩提取液（每mL提取液约相当于黄芩药材的1g）。
2.4含药血清制备：雄性wistar大鼠5只，按顺序编号（1、2、3、4、5），禁食不禁水，12h后以1mL/100g灌胃,1、2、3号大鼠给予黄芩提取液，4、5号大鼠给予生理盐水做对照，给药8h后,从大鼠腹主动脉处取血，将所取血液置于3mL肝素钠真空采血管中，摇晃均匀后以3000r/min离心15min，分离血浆置1mL离心管中，每管约1mL，-20℃下冷冻保存。精密量取给药大鼠血浆200µL加甲醇400µL， 涡漩2min后，再以3000r/ min离心5min，取得上清液，即得含药血浆供试品溶液，备用。
2.5系统适应性试验：分别取4号大鼠血浆、4号大鼠血浆加黄芩苷对照品溶液和1号大鼠血浆，按照“2.3” 项下溶液处理方法操作，得到相应的色谱图，黄芩苷和周围峰已经完全分离，黄芩苷的保留时间分别约为25min，血浆中杂质峰不会干扰对黄芩苷的测定。结果表明：本方法具有较高的专属性。
2.6标准曲线的绘制：取低温冷冻保存的5号大鼠血浆，解冻后精密量取200µL10份，各置于1mL离心管中，分别配制黄芩苷浓度为0.177，0.352，0.707，1.413，2.827，5.653，11.307，22.083，44.167，66.25µg/ml的标准系列血浆样品，按照“2.4”项下溶液处理方法操作，记录待测物黄芩苷峰面积。以峰面积积分值为纵坐标（S），对黄芩苷的质量浓度（C，μg/mL）为横坐标进行线性回归，结果得到S=32935C+2958.7，黄芩苷在0.177-66.25μg/mL范围内线性关系良好（r = 0.9998）。
2.7精密度试验：取1号大鼠血浆200μL，置于1mL离心管中，加入400μL甲醇，按“2.3”项下的方法操作。连续血浆进5针，计算精密度。RSD为0.93 %。
2.8稳定性试验：另取2号大鼠血浆300μL，置于1mL离心管中，加入甲醇700μL，按“2.3”项下方法操作。
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考察血浆样品在采集后的稳定性，血浆样品解冻之后用甲醇提取，于配制后0，2，4，6，8h测定，在8h内的黄芩苷的RSD为3.24%，证明血浆样品在室温8h内稳定。
2.9重复性试验：取3号大鼠血浆200µL，加入甲醇400µL，按2.3样品处理方法，制成5份样品溶液，在所确定的“2.1”项色谱条件下进行测定。求得相对标准偏差，结果黄芩苷的RSD分别为1.32 %。
2.10回收率实验：取1号大鼠血浆6份，每份200μL，置于1mL离心管中，分别精密加入“2.2.1”项下黄芩苷对照品溶液25、50、100µL和甲醇溶液375、350、300µL，制成含黄芩苷1.71、3.42、6.84μg/mL溶液（每个质量浓度2份样品），按血浆样品的处理项下方法操作，记录黄芩苷峰面积。按外标法计算，以测得量与加入量之比计算方法回收率。结果表明，3个水平质量浓度黄芩苷的平均回收率分别为102.39%、102.98%、100.94%。
3、药对配伍的吸收代谢变化规律
3.1对照品溶液的制备：同于“2.2.1”项。
3.2含药血浆供试品溶液的制备：称取黄芩200g，加8倍量常水浸泡0.5h，加热回流提取1h，滤过，药渣再加8倍量70%乙醇回流提取1h，再滤过，回收乙醇后与水提液合并，在转速3000r/min离心10min，取上清液浓缩至200mL，制得黄芩药材受试药液样（每mL提取液约含相当于黄芩药材1g）。称取黄芩200g、柴胡200g，同法制得黄芩柴胡药对1:1受试药液样。称取黄芩200g、柴胡400g，同法制得黄芩柴胡药对1：2受试药液样。
72只Wistar大鼠分三个实验组（每组24只），雌雄各半，禁食不禁水，每只大鼠取4个时间点，每个点6只，每天做一个受试药液样。随机抽取24只大鼠称重后编号,根据体重随机分3组，将禁食12h后的大鼠灌胃给药，以2mL/100g灌胃，分别于灌胃后10min，20min，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h，9h，10h，11h，12h， 14h，24h，用毛细玻管自眼眶内龇动脉取血1.0 mL于离心管中，加肝素钠抗凝，离心15min（3000 r/ min），取上清液-20℃保存，每次采血后灌胃补充1mL水，连续三天重复此过程。精密量取大鼠血浆200µL加甲醇400µL，涡漩2min，3000 r/ min离心5min，取上清液，即得样品黄芩柴胡药对（1:0，1:1，1:2）含药血浆供试品溶液，备用。
3.3样品测定
3.3.1黄芩含药血浆供试品的测定：精密吸取黄芩单煎液含药血浆供试品溶液20μL，在拟定色谱条件下进样。
3.3.2黄芩柴胡药对1:1含药血浆供试品的测定：精密吸取黄芩柴胡药对1:1含药血浆供试品溶液20μL，在拟定色谱条件下进样。
3.3.3黄芩柴胡药对1:2含药血浆供试品的测定：精密吸取黄芩柴胡药对1:1含药血浆供试品溶液20μL，在拟定色谱条件下进样。
3.4统计结果
记录“3.3.1”，“3.3.2”，“ 3.3.3”检测的峰面积，计算黄芩苷的血药浓度。并以采血时间对浓度作图，得黄芩单煎液含药血浆供试品、黄芩柴胡药对1:1含药血浆供试品和黄芩柴胡药对1:2含药血浆供试品中黄芩苷的血药浓度-时间曲线，血药浓度数据采用DAS2.2药代动力学软件拟合，取统计矩参数分析。通过药代动力学研究结果的分析，黄芩柴胡1:0提取物后，黄芩苷经0.67 h 可达最大吸收峰，峰浓度（Cmax）为54.96mg·mL-1，血药浓度-时间曲线下面积（AUC0→24h）为324.082 mg·（L﹡h）-1，黄芩苷在体内的滞留时间（MRT0→24为8.671h）；大鼠灌胃黄芩柴胡1:1提取物后，Tmax为0.33 h，Cmax为26.07 mg·mL-1，血药浓度-时间曲线下面积（AUC0→24h）为284.796 mg·（L﹡h）-1，黄芩苷在体内的滞留时间（MRT0→24h为10.39 h）；黄芩柴胡1:2提取物，黄芩苷经14 h可达最大吸收峰，峰浓度（Cmax）为26.84mg·mL-1，血药浓度-时间曲线下面积（AUC0→24h）为344.121 mg·（L﹡h）-1，黄芩苷在体内的滞留时间（MRT0→24h为11.879h）。由此可知，相比黄芩柴胡1:0而言，黄芩柴胡1:1提取物黄芩苷吸收加快，吸收量无明显变化，但在体内的滞留时间增长；黄芩柴胡1:2提取物黄芩苷吸收滞后，吸收量增加，在体内的滞留时间更长，从而能使其在体内发挥药效时间增长，可见三个配伍比例中，柴胡黄芩1:2配伍组黄芩苷在体内滞留的时间更长。
4、讨论
黄芩苷和柴胡皂苷a、d均为黄芩柴胡药对的有效成分，但经我们预试验发现柴胡皂苷进入大鼠体内分离度不好，因为测量困难，因此看黄芩柴胡配伍该药对该药对有效成分的药代动力学的影响,我们还是选用了分离度较为好的黄芩作为考察的对象。
依据文献，为了测定方法具有精密度高，专属性强，重现性好等要求，本实验从提取的方法方面和仪器分析色谱中进行了摸索和筛选，因此药物与血浆中杂质具有比较高的分离度，更能满足体内低浓度药物检测及药代动力学合格生物利用度研究的要求。
本实验预试实验得出有机溶剂乙腈或甲醇做蛋白沉淀剂差别不大，所以用有机溶剂甲醇直接沉淀血浆中的蛋白，因为需要的血浆样品小，因此可以直接取经旋涡和离心后的上清液进行分析比较，也正是因为处理前的操作简单性，在为后续处理大量的血浆样品中减少了工作量，并且节省了时间。
采用C18色谱柱，考察对不同的比例流动相水-甲醇-磷酸，结果发现流动相水-甲醇-磷酸（53:47:0.2）时，血浆样品中的黄芩可以达到基线分离，保留时间适中，并且血中的内源性物质对此并无干扰，同时峰型良好。因此选择的色谱条件合适。我们的一些数据,用房室模型拟合不佳，因此选用统计矩进行分析。
本实验采用高效液相色谱法以比较黄芩柴胡药对配伍的有效成分在大鼠血浆中的药代动力学，结果采用DAS2.2软件处理，用统计矩分析，药对配伍后黄芩柴胡1:1达峰时间提前，吸收量减少，表明柴胡可能促进黄芩苷溶出但却吸附了部分量的黄芩苷，柴胡黄芩1:2达峰时间滞后，但吸收量增加，表明柴胡可使黄芩苷溶出滞后但随着时间延长却促进黄芩苷的吸收。相比黄芩柴胡1:0来说，柴胡黄芩1:1平均滞留时间变长，而柴胡黄芩1:2平均滞留时间更长，说明配伍后可以延缓黄芩苷的排出，可以解释黄芩苷会出现二次吸收的现象。
参考文献 ：
[1]龚明涛，虞丽芳，陈庆华，等.大鼠灌胃黄芩苷及其苷元黄芩素的药动学研究[J]， 中草药，2009，40（3）：392.
[2]赵玉男，石钺，邢东明，等.YL-2000黄芩苷在正常大鼠体内的药物动力学研究[J]，中国中医基础医学杂志，2002，8（9）：59.
[3]柳文媛，余成霞，冯锋.LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中黄芩素及黄芩苷浓度[J]，中国药科大学学报，2007，38（2）：129-132.
基金项目：为山东省中医药科技计划项目（项目编号：2009-114），
通讯作者：李克明，山东淄博人，山东省中医药研究院助理研究员。
论文作者:刘世军1 李克明2 刘宪勇1通讯作者 孙付军2 谷雨1 王伟
论文发表刊物:《医师在线》2019年1月2期
论文发表时间:2019/4/1
标签：黄芩论文; 柴胡论文; 血浆论文; 时间论文; 大鼠论文; 浓度论文; 溶液论文; 《医师在线》2019年1月2期论文;