谭莉梅1张美义2何家靖2曾庆慕2林燕芳2
（1广州中医药大学青蒿研究中心研究生广东广州510405）
（2广州中医药大学青蒿研究中心广东广州510405）
【摘要】目的：观察青蒿乙醇提取物对H22肝癌小鼠的体内抑瘤作用。方法：1.利用紫外-可见分光光度法测定青蒿乙醇提取物中总黄酮与粗多糖的含量2.取H22肝癌细胞接种于小鼠右腋皮下，随机分为模型对照组、环磷酰胺（CTX）20mg/kg组和青蒿乙醇提取物125mg/kg组、500mg/kg组。CTX组腹腔注射给药，其余各组灌胃给药，连续给药10天后，解取肿瘤称取重量，计算抑瘤率。结果：1.青蒿乙醇提取物中总多糖含量为6.45%，总黄酮的含量为16.2%2.与模型对照组比较，青蒿乙醇提取物组500mg/kg可抑制肿瘤生长(P＜0.05)，抑瘤率为48.7%。结论：青蒿乙醇提取物对小鼠H22肝癌有明显的抑制作用，中药青蒿中可能存在其它的抗肿瘤成分。
【关键词】青蒿乙醇提取物；多糖；黄酮；H22肝癌；抑瘤率
【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）07-0072-02
Title：TheinhibitoryeffectofArtemasiaEthanolExtractontumorgrowthonmurinetransplantedhepatocarcinoma22(H22)invivo
TANLimei1，ZhangMeiyi2,HeJiajing2,etal.
GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510405
【Abstract】ObjectiveObservetheinhibitoryeffectofArtemisiaEthanolExtractontumorgrowthonmurinetransplantedhepatocarcinoma22(H22)invivo.Methods1.UseUV-visiblespectrophotometrytodeterminatethecontentoftotalflavonoidsandtotalpolysaccharidesinArtemasiaEthanolExtract.2.TumorinhibitoryactivitiesweretestedinexperimentaltumorH22mice.Thetumorbearingmicewererandomlydividedintocontrolgroud,CTXgroup(20mg/kg)andArtemisiaEthanolExtracttreatmentgroups(125mg/(kg.d)group,500mg/(kg.d)group).Thesemiceweregivennormalsaline,orArtemasiaEthanolExtractdifferentdosesbygavagerespectivelyonceadayfor10days,whileCTXweregivenbyintraperitonealinjection.Tumorgrowthstatewasobservedandtumorinhibitoryratewascalculated.Results1.Thecontentoftotalpolysaccharidescontentwas6.45%,thecontentoftotalflavonoidswas16.2%.2.ArtemasiaEthanolExtracttreatedgroupswithhighdose(500mg/(kg.d))couldinhibithepatocarcinoma22(H22)(P＜0.05),theinhibitoryratewas48.7%.ConclusionsArtemisiaEthanolExtractcannihibithepatocarcinomagrowth,exceptArtemisinin,otheranti-tumorcomponentsmayexistinArtemisiaannua.
【Keywords】ArtemisiaEthanolExtract；polysaccharides；flavonoids；H22；inhibitoryrate
中药青蒿是一年生草本植物菊科（Asteraceae）黄花蒿（ArtemisiaannuaL.），药用其地上干燥的叶、茎部分，俞根初的《重订通俗伤寒论》指出其具有清热解毒，截疟的作用。主要化学成分包括萜类、黄酮类、多糖类、香豆素类、苯丙酸类和挥发油等[1]。近年来，有关中药青蒿的抗肿瘤作用已有研究，但主要集中在青蒿素等萜类成分及其衍生物。郭燕[2]等研究发现青蒿素可有效抑制Lewis肺癌淋巴管生成和肺转移，降低肺转移灶大小，并减少肺转移结节数，从而提高小鼠存活率。王勤等[3]研究口服青蒿琥酯可明显抑制小鼠肝癌H22的生长并延长生存天数，与抗癌药5-FU有协同抗肝癌作用。对于中药青蒿中存在的其他成分，如青蒿黄酮等，未见有关其抗肿瘤作用的报道。实验用乙醇提取中药青蒿，同时提取出青蒿黄酮及多糖类成分，并将小鼠H22移植性肝癌作抑瘤率试验，探索其在小鼠体内的抗肝癌活性，寻找青蒿素以外的抗肿瘤有效成分。
1.材料与方法
1.1实验材料
青蒿乙醇提取物，取青蒿叶200g，以60%乙醇提取，过滤并浓缩至120g，每g相当于生药1.67g。环磷酰胺注射液（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号12010425。
KM小鼠，雌性，SPF级，体重18～22g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK（粤）2013-0020。
H22小鼠肝癌细胞株，由广州中医药大学青蒿研究中心实验室保存并提供。
1.2实验方法
1.2.1青蒿乙醇提取物中多糖的含量测定
1.2.1.1标准曲线的绘制
精密称取葡萄糖对照品适量，加水制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8ml至10ml具塞试管中，加水至2.0ml，精密加入6%苯酚溶液（精密量取80%苯酚溶液3.76ml，加水至50ml）1ml，再加入浓硫酸5ml，摇匀，静置10min，置沸水浴中加热15min，取出，冷却至室温，即得。以水2ml为空白，在490nm的波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线[4]。得回归方程为：Y=12.97387X+0.00821，r=0.9997。
1.2.1.2测定方法
精密称取青蒿乙醇提取物0.02g置100ml量瓶,加水至适量，超声5min，放冷，加水至100ml，摇匀。精取1ml，加水至2ml，自“精密加入6%苯酚溶液”起同法操作，测定吸收度。
1.2.1.3计算方法与结果
多糖%=（C×Df/W）×100%
C为样品溶液中葡萄糖浓度μg/ml，D为样品溶液的稀释因数，f为换算因子，W为样品重量（μg）。计算得出青蒿乙醇提取物中青蒿多糖的含量为6.45%。
1.2.2青蒿乙醇提取物中黄酮的含量测定
1.2.2.1标准曲线的绘制
精密称取芦丁对照品5mg置于50ml容量瓶中，用70%乙醇溶解稀释至刻度，超声1min，摇匀，得每ml中含芦丁0.1mg。精取对照品0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml分别至25ml容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液1ml,静置6min，加入10%硝酸铝1ml,静置1min，最后加入4%氢氧化钠10ml,用70%乙醇定容至25ml，摇匀，静置15min，以70%5ml乙醇为空白，于510nm处测定吸光度[5]。以吸光度（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，得回归方程：Y=73.16968X-0.07544，r=0.9999。
1.2.2.2测定方法
精密称取青蒿乙醇提取物0.02g置50ml量瓶,加70%乙醇适量，超声5min，放冷，加70%乙醇至刻度，摇匀，精取5ml至25ml容量瓶，自“加入5%亚硝酸钠溶液1ml”起同法操作，测定吸收度。
1.2.2.3计算方法与结果
黄酮%=（C×Df/W）×100%
C为样品溶液中芦丁浓度μg/ml，D为样品溶液的稀释因数，f为换算因子，W为样品重量（μg）。计算得出青蒿乙醇提取物中青蒿黄酮的含量为16.2%。
1.2.3青蒿乙醇提取物对H22小鼠肝癌的体内抑瘤作用
1.2.3.1小鼠H22肝癌细胞混悬液制备
选取已接种H22肝癌腹水瘤10天，且肿瘤生长良好的荷瘤小鼠，于超净工作台上腹部皮肤消毒，抽取乳白色腹水于已消毒的小烧杯内，用生理盐水稀释制成H22肝癌细胞混悬液。
1.2.3.2动物造模、分组及给药
在无菌条件下于小鼠右腋窝皮下接种肝癌细胞混悬液0.2ml（约2×106个肝癌细胞）。将造模成功的荷瘤小鼠随机分为4组，分别为模型对照组，环磷酰胺组（CTX）及青蒿乙醇提取物125mg/kg组、500mg/kg组，每组8只。青蒿乙醇提取物高、低剂量组分别灌胃给药，CTX组每天腹腔注射给药，模型对照组每天灌胃给予同容积0.3%CMC-Na溶液。接种24小时后开始给药，连续10天。
1.2.3.3抑瘤率、脾质量、胸腺质量测定
末次给药24小时后，称取小鼠体重量，随后颈椎脱臼处死小鼠，剥取瘤块、脾脏和胸腺，称取重量。计算肿瘤生长抑制率（%），计算公式如下：
肿瘤生长抑制率（%）=（对照组平均肿瘤质量—给药组平均肿瘤质量）/对照组平均肿瘤质量×100%。
1.3统计学分析
所有实验数据采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，数据采用均数±标准差（x-±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
由表1可以看出，青蒿乙醇提取物低剂量（125mg/kg）抑瘤率为9.8%，未见抑瘤效应。但高剂量组（500mg/kg）的抑瘤率达48.7%（P＜0.05）。与对照组比较，CTX组小鼠脾脏与胸腺重量均有所减轻，说明CTX可使小鼠的脾脏及胸腺受到抑制，青蒿乙醇提取物高、低剂量组脾脏和胸腺重量与对照组相比均无明显改变。实验期间，各给药组的小鼠重量都有不同程度的增加，其中青蒿乙醇提取物高、低剂量组增长均较大。
3.讨论
肝癌是病死率高、肿瘤中病程进展快的恶性肿瘤之一，对人民的生活和健康形成了极大的威胁。化学治疗是恶性肿瘤治疗的重要组成部分，但其毒副作用和抗药性的产生严重制约了临床效果。从植物中提取及筛选低毒有效的抗肿瘤药物一直是各国的研究热点。本实验研究结果显示青蒿乙醇提取物中青蒿粗多糖及青蒿总黄酮含量分别为6.45%和16.2%，对H22肝癌小鼠的体内抑瘤作用的初步研究结果显示：青蒿乙醇提取物低剂量（125mg/kg）时无抑瘤效应，但剂量增加为4倍时，则对H22小鼠肝癌具有显著抑制作用，抑瘤率为48.7%。此外，青蒿乙醇提取物高、低剂量组脾脏和胸腺重量与对照组相比均无明显改变，提示其对小鼠脾脏、胸腺等免疫器官无抑制作用。实验期间，各给药组的小鼠重量都有不同程度的增加，其中青蒿乙醇提取物高、低剂量组增长均较大，提示其对小鼠机体无明显毒副作用。
中药青蒿的抗肿瘤成分较为复杂，除了当下研究热点青蒿素等萜类成分及其衍生物，青蒿多糖也显示一定的抗肿瘤效应[6]。本研究表明，青蒿乙醇提取物也有较好的抗肿瘤作用，过去多篇报道指出多种中药的多糖与黄酮类化合物有抗肿瘤作用[7]。今后应将青蒿乙醇提取物进一步分离，分别得到青蒿多糖及青蒿黄酮和此二者以外之物质，进行抗肿瘤研究，同时与青蒿素对比其抗肿瘤效果，寻找青蒿中较有效的抗肿瘤成分，为中药青蒿的进一步研究开发提供科学依据。
【参考文献】
[1]杨云,张晶,陈玉婷,等.天然产物化学成分提取分离手册.中国中医药出版社,2003,439.
[2]郭燕,王俊,章必成等.青蒿素对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长和淋巴管生成的影响.第四军医大学学报,2007:28(4):357-360.
[3]王勤,吴理茂,赵一,等.青蒿琥酯抗肿瘤作用的机制研究.药学学报,2002;37(6):477一478.
[4]刘劲松,刘金旗.不同质地木瓜中多糖含量测定.安徽医药,2008,12(7):607-608.
[5]黄红英,邓斌,张晓军,等.青蒿中黄酮类化合物的提取及其抗氧化性研究.安徽农业科学,2009,37(7),3037-3039.
[6]薛明,田丽娟.青蒿多糖的抗肿瘤作用实验研究.时珍国医国药,2008,19(4):937-938.
[7]肖爽,肖顺汉.中药抗肿瘤作用及其有效成分概述.中国药业,2012,21(21):111-112.
论文作者:谭莉梅1张美义2何家靖2曾庆慕2林燕芳2
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第7期供稿
论文发表时间:2015/7/2
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