杨庆文
深圳市宝安区中医院(检验科) 广东 深圳 ５１８１３３
【摘要】 目的 检测特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者不同时段外周血淋巴细胞亚群与调节性T 细胞水平的变化,探讨其在ITP免疫发病机制中的作用及临床意义.方法 选取２０１３年１月－２０１５年６月在我院住院治疗的１００例ITP患者作为研究对象,另选同期健康体检者１００例作为对照组.采用流式细胞仪直接免疫荧光法检测外周血淋巴细胞亚群和调节性T 细胞水平的变化.结果 治疗前ITP组的CD３＋ 、CD４＋ T 淋巴细胞及CD１６＋/５６＋ NK 细胞水平、CD４＋/CD８＋ 比值及CD４＋CD２５＋Foxp３＋T细胞占CD４＋Foxp３＋T的百分比明显低于对照组(P＜０．０５),治疗后均明显恢复(P＜０．０５),且与治疗时间呈正相关. 治疗前ITP组的CD８＋T、CD１９＋B淋巴细胞百分比、CD４＋CD２５＋T细胞占CD４＋T 细胞的百分比明显高于对照组,治疗后明显降低,且与治疗时间呈负相关. 结论 ITP患者血淋巴细胞亚群及调节性T细胞水平发生异常,可能与ITP的发生发展有关.检测外周血淋巴细胞亚群及调节性T 细胞水平检测对评估ITP 的发病、疗效及预后方面具有较高的临床价值. 【关键词】 外周血淋巴细胞亚群; 调节性T细胞; 特发性血小板减少性紫癜【中图分类号】R５４１．４【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１０－０１１４－０１
特发性血小板减少性紫癜(ITP),也称为免疫性血小板减少性紫癜,是由机体产生的抗血小板自身抗体所致的获得性自身免疫性出血性疾病,以血小板减少为特征,其发病原因及机制尚不完全清楚[１].研究表明,ITP患者既存在体液免疫异常,也存在细胞免疫异常,这间接反映出其发病可能与机体的淋巴细胞亚群和细胞因子的表达及调节性T细胞功能的改变有关[２].本研究旨在检测ITP患者外周血淋巴细胞亚群和调节性T 细胞的变化,评估其在ITP 发病机制中的作用[３]. １ 资料与方法
１．１ 实验材料美国BDBiosciences公司:MultiTESTIMK四色、免洗淋巴细胞亚群分析试剂盒;上海碧云天生物技术有限公司:红细胞裂解液;美国BDBiosciences公司:人调节性T 细胞检测试剂盒;美国Beckman－Coulter公司:BeckmanCoulterEPICSXL型流式细胞仪.
１．２ 临床资料选取我院２０１３年１月－２０１５年６月入院治疗的１００例特发性血小板减少性紫癜患者作为ITP组,其中男女分别为４８例和５２例,年龄为１８－５８岁, 平均年龄为３８．９±６．２岁.另选同期１００例体检健康者作为对照组,外周血细胞计数正常,肝肾和免疫功能正常,男女分别为４５例和５５例,年龄为１８－５９ 岁,平均年龄为３９．１±５．９岁.研究组和对照组受试者在年龄、性别等一般资料上的差异无明显差异(P＞０．０５),能进行比较.
１．３ 纳入与排除标准纳入标准:(１)与?血液病诊断及疗效标准?中关于ITP的诊断标准相符, 且无其他免疫性疾病;(２)首次发病,未使用激素和其他免疫抑制剂治疗者;(３)无心脑血管疾病史、糖尿病史者;(４)未参加其他研究者;(５)签署知情同意书者.排 除标准:(１)排除患有其他免疫性疾病者;(２)排除既往使用过激素或其他免疫抑制剂等治疗者;(３)排除特殊人群如孕妇、未成年人、癌症晚期等者;(５)排除患有严重心脑血管疾病、糖尿病史、肝肾功能异常者.
１．４ 治疗方法所有ITP患者均接受剂量为１mg/(kg/d)口服泼尼松治疗,维持治疗１个月以上,分别于治疗前、治疗后１０天和治疗后３０天的早晨空腹取外周血２ml, 加入EDTA 抗凝后用于检测淋巴细胞亚群和调节性T细胞水平.１．４．１ 外周血淋巴细胞亚群的检测 将所取的外周血平均分装于２支专用试管,各加入５０μL溶血素裂解红细胞分离单个核细胞,并用２０％ FBS细胞培养液将细胞浓度调整为１×１０９/L.一支试管中加入２０μLCD３/CD８/CD４５/CD４ 抗体,另一支试管中加入２０μLCD３/CD１６＋５６/CD４５/CD１９抗体,充分混匀,室温下,避光静置１５－２０min.其后２支试管分别加入４５０μL溶血素,混匀器中充分混匀,室温避光静置１５min.在２４h之内,放入流式细胞仪检测淋巴细胞亚群水平.１．４．２ CD４＋CD２５＋ 调节性T 细胞检测 使用调节性T 细胞检测试剂盒检测CD４＋CD２５＋ 调节性T细胞水平,严格遵守试剂盒说明书操作.流式细胞仪的检测分析软件为CellQuest软件,检测CD２５ 和Foxp３ 的表达,检测结果以CD４＋CD２５＋/CD４＋ T、CD４＋ CD２５＋high/CD４＋ T 及CD４＋ CD２５＋ Foxp３＋ T/CD４＋T表示[４].
１．５ 观察指标与诊断标准观察２组人群外周血淋巴细胞亚群和CD４＋CD２５＋ 调节性T 细胞水平的变化. １．６ 统计学方法使用SPSS１９．０统计软件对实验数据进行分析与处理,以X±s表示计量资料,两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析的F检验,P＜０．０５为差异有统计学意义. ２ 结果２．１ 淋巴细胞亚群检测结果
表１ 受试者外周血淋巴细胞亚群测定结果(X±s,n＝１００)
注:与对照组相比较,?P＜０．０５;与治疗前相比较,＃P＜０．０５. ３ 讨论CD４被视作为T辅助/诱导细胞(Th/Ti)的表面标志,CD４T 能够辅助T 细胞和B细胞转化成效应细胞[５],并参与机体免疫调节.CD８为抑制/细胞毒性细胞(Ts/Tc)的表面标志,能对T 细胞和B细胞的活化、抗体生成产生抑制作用,从而抑制细胞和体液免疫.CD１６＋/５６＋ 是NK 细胞的特异性标志,而NK细胞能抑制B细胞的分化,对细胞的吞噬和抗体的生成具有调节作用.研究表明,Th是细胞免疫与体液免疫平衡调节的中心细胞,Th/Ts比值的升高或降低在一定程度上能反映机体免疫功能情况,也势必会引起B细胞的改变. 本研究结果显示,与健康者相比较,ITP患者的CD３＋ T 细胞、CD４＋ T 细胞及NK细胞水平和CD４＋/CD８＋ 比值均显著降低,治疗后这些淋巴细胞亚群水平则明显恢复,且与治疗的时间存在一定的关系.
研究认为,CD４＋CD２５＋T细胞数量减少会降低有效免疫抑制作用的细胞数,导致分泌的细胞因子含量也降低,进而减弱细胞免疫的抑制功能,打破机体免疫耐受的平衡,最终导致机体将大量的自身反应性T 细胞激活,参与血小板的损伤.转录因子Foxp３被认为是调节CD４＋CD２５＋T细胞的主要基因,目前临床上普遍认为其为CD４＋ CD２５＋ T 细胞的特异性标志,能够精确地反映ITP患者Treg细胞数量的变化.本研究结果显示,ITP 患者外周血CD４＋CD２５＋T/CD４＋T明显比健康者增多,治疗后则明显下降,且与治疗时间呈负相关;而ITP患者的CD４＋CD２５＋Foxp３＋T/CD４＋Foxp３＋T 明显降低,治疗后明显恢复,且与治疗时间呈正相关,这些结果与前人的结果基本一致,共同说明了ITP患者外周血调节性T细胞比例明显降低,促使机体细胞免疫抑制功能发生障碍,从而活化自身反应性T 细胞并辅助B细胞产生抗体,从而参与ITP的发生发展. 综上所述,在ITP发病的过程中,淋巴细胞免疫功能普遍发生异常,对淋巴细胞亚群水平及Treg细胞的联合检测能评估ITP发病、治疗具有较好的指导价值.
参考文献[１] 马静瑶,陈振萍,吴润晖．血小板特异性抗体与ITP发病、临床特点、治疗及预后效果的关系[J]．中国实验血液学杂志,２０１４,２２(０６):１７７１－１７７４． [２] 陈叶龙,寿黎红．儿童特发性血小板减少性紫癜患者外周血T 淋巴细胞亚群变化[J]．中国现代医生,２０１２,５０(３５):７７－７８． [３] 肖惠煊,周建中,莫焕桐,等．特发性血小板减少性紫癜患者外周血T 淋巴细胞亚群变化及临床意义[J]．中国医药科学,２０１３,３(０９):１２４－１２５． [４] 黄枝宁．特发性血小板减少性紫癜患者外周血淋巴细胞亚群的变化及其临床意义[J]．广西医学,２０１３,３５(０８):１０２１－１０２２． [５] 李彦格,毛彦娜,李慧霞,等．儿童特发性血小板减少性紫癜患者NK 细胞及T淋巴细胞亚群变化及意义[J]．医药论坛杂志,２０１１(１９):２４－２５．
论文作者:杨庆文
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年9月供稿
论文发表时间:2016/2/24
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