李立[1]2001年在《Fhit基因在人支气管上皮细胞癌变发生发展中的异常改变及其作用机制》文中研究指明肺癌是西方国家最常见的死亡原因，近年来在我国的发病率明显上升。肺癌组织3号染色体短臂的片段缺失是肺支气管癌变过程中的早期事件。 Fhit基因定位于3p14.2，它的异常改变常见于多种上皮来源的肿瘤，尤其是与环境致癌物暴露相关的肿瘤。在肺支气管癌前病变阶段已经可以检测到Fhit蛋白的缺失。在肺癌中，吸烟者Fhit DNA及蛋白的缺失显着高于非吸烟者。 Y细胞是经SV40 LT抗原转染而建立的人支气管上皮永生化细胞系，Western blot的分析结果发现Y细胞缺失Fhit蛋白。为了进一步了解Fhit基因在人支气管上皮细胞癌变发生中的作用机制，本研究用Fhit基因的真核表达载体转染Y细胞，从而得到了稳定高表达Fhit蛋白的Y／Fhit细胞。 表型的研究主要包括Fhit蛋白的高表达对细胞生长、克隆形成、细胞周期及自发性凋亡的影响。与对照Y和Y／pcDNA3.1细胞相比，Y／Fhit细胞的生长速度明显降低、克隆形成率分别下降了14.8％及11.1％，这种抑制作用在培养基中加入血清后更加显着。PI染色后流式细胞仪检测细胞周期发现Y／Fhit细胞G2期的百分含量显着增加。Annexin V染色结果表明Fhit蛋白的高表达并不引起Y细胞的自发性凋亡。
张慧霞[2]2017年在《叶酸对MNNG诱导的哈族食管上皮细胞恶变的干预作用及表观遗传学机制研究》文中研究指明目的:1)构建哈族食管上皮DNA甲基化转移酶1(DNMT1)高表达细胞株模型,为今后食管癌发生机制研究提供重要的研究工具;2)探讨DNMT1高表达在N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)致哈族食管上皮细胞恶性转化中的作用,并构建哈族食管上皮DNMT1高表达细胞的恶性转化细胞模型,为今后深入探讨食管癌发生机制提供稳定的、简单易行的实验操作方法和研究工具;3)探讨叶酸在M N N G致哈族食管上皮细胞恶性转化中的干预作用和表观遗传学机制以及Wnt/β-catenin信号转导通路调控机制中的作用,为哈族食管癌的防治提供理论依据。方法:1)采用TALE技术将构建的p XanthoT M V.b a s i c.p u r o-W V 0 1 3 3、p XanthoTMV.basic.puro-WV0132和p XanthoTMV.basic.puro-WV072质粒转染至哈族食管上皮细胞,并利用嘌呤霉素对DNMT1高表达细胞进行筛选,通过荧光显微镜、RT-PCR和Western blot法检测细胞转染情况和目的基因DNMT1的表达情况;2)采用MTT法和克隆形成实验确定MNNG的恶性转化剂量;采用隔代染毒,每次染毒1小时的方法对细胞进行染毒,之后取不同代次细胞行软琼脂集落形成实验,观察不同染毒次数和传代次数的细胞集落形成情况,并克隆扩大培养哈族食管上皮细胞-zhz(恶性转化细胞);裸鼠成瘤实验选用SPF级BALB/c-nu裸鼠24只,按照随机化原则分为3组,即对照组(生理盐水组),哈族食管上皮DNMT1高表达细胞组和哈族食管上皮DNMT1高表达细胞转化细胞组(哈族食管上皮细胞-zhz),每组8只,调整细胞浓度为1×106个/m L,按0.2m L/只的剂量接种于裸鼠靠近右侧背部皮下,4周后观察哈族食管上皮DNMT1高表达细胞及其转化细胞(哈族食管上皮细胞-zhz)恶变程度,并进行组织病理学检测;3)采用高效液相色谱法(HPLC)测定基因组DNA整体甲基化水平改变;采用甲基化特异性PCR(MSP)法、RT-PCR和Western Blot法检测叶酸代谢相关基因(MTHFR和CBS)、DNA修复基因(MGMT)和肿瘤相关基因(P16、RASSF1A和FHIT)等6个基因甲基化状态、m RNA和蛋白表达水平改变;4)采用RT-PCR及Western Blot法检测Wnt/β-catenin信号转导通路中关键因子(β-catenin、APC和TCF)mRNA及蛋白表达水平改变。结果:1)pXanthoTMV.basic.puro-WV0133和pXanthoTMV.basic.puro-WV0132质粒转染组细胞DNMT1 mRNA表达水平是正常细胞组的1.786倍和2.721倍,dnmt1蛋白表达水平是正常细胞组的2.734倍和3.100倍;其中,pxanthotmv.basic.puro-wv0132质粒转染组细胞dnmt1mrna和蛋白表达水平较高;2)随着mnng染毒次数和细胞传代次数的增加,细胞形态趋向不规则形,接触抑制逐渐消失,耐受性逐渐增强,生长速度逐渐增加。染毒14次第27代的哈族食管上皮dnmt1高表达细胞在软琼脂上出现细胞集落,中央凸起,由多层细胞组成,而哈族食管上皮细胞未出现阳性结果,细胞固缩死亡。接种哈族食管上皮转化细胞-zhz的裸鼠出现肿瘤包块,经组织病理学鉴定为鳞癌;3)在终浓度为1.500×10-5mol/lmnng致癌物的长期暴露之下,(1)随着叶酸浓度的增加,哈族食管上皮细胞和dnmt1高表达细胞dna整体甲基化水平逐渐升高(p<0.01)和dnmt1酶活性逐渐降低(p<0.01);随着作用时间的延长,哈族食管上皮细胞和dnmt1高表达细胞dna整体甲基化水平逐渐降低(p<0.01),dnmt1酶活性逐渐升高(p<0.01);在相同条件下,晚期阶段的哈族食管上皮细胞dna整体甲基化水平高于哈族食管上皮dnmt1高表达细胞组,差异有统计学意义(t早=0.696,p=0.494;t中=0.605,p=0.551;t晚=2.746,p=0.012);(2)叶酸浓度的增加对哈族食管上皮细胞和dnmt1高表达细胞mthfr、rassf1a和fhit(除哈族食管上皮细胞外)基因甲基化状态有影响,表现为在叶酸高浓度剂量时,mthfr、rassf1a和fhit甲基化出现逆转现象,而对cbs、mgmt和p16基因甲基化状态无影响;(3)随着叶酸浓度的增加,哈族食管上皮细胞和dnmt1高表达细胞mthfr、cbs、mgmt、p16、rassf1a和fhit基因mrna和蛋白表达水平逐渐增加(p<0.01);随着作用时间的延长,细胞mthfr、cbs、mgmt、p16、rassf1a和fhit基因mrna和蛋白表达水平逐渐降低(p<0.01);在相同条件下,哈族食管上皮细胞mthfr、cbs、mgmt、p16、rassf1a和fhit基因mrna和蛋白表达整体上高于哈族食管上皮dnmt1高表达细胞(p<0.01);4)随着叶酸浓度的增加,哈族食管上皮细胞和dnmt1高表达细胞wnt/β-catenin信号转导通路中关键因子β-catenin和tcf基因mrna和蛋白表达水平逐渐降低,apc基因逐渐增加,呈现出浓度依赖关系;随着干预时间的延长,各叶酸浓度组细胞β-catenin和tcf基因mrna和蛋白表达水平均逐渐增加趋势,apc基因逐渐降低,呈现出时间依赖关系;在相同条件下,哈族食管上皮细胞β-catenin和tcfmrna和蛋白表达水平低于哈族食管上皮dnmt1高表达细胞,apc基因mrna和蛋白表达水平高于哈族食管上皮dnmt1高表达细胞。结论:1)采用tale技术成功构建了哈族食管dnmt1高表达细胞株模型,为今后致癌机制研究提供了重要的研究工具;2)成功构建了哈族食管上皮dnmt1高表达细胞的恶性转化细胞模型,dnmt1高表达对细胞的恶性转化起到促进作用,可使细胞发生恶性转化的时间缩短;3)与哈族食管上皮细胞相比,哈族食管上皮dnmt1高表达细胞更易受到mnng和低剂量叶酸的损害作用影响,提示高浓度叶酸可降低MNNG对细胞的损伤,可逆转表观遗传学指标的改变,对细胞的不良反应起到一定的拮抗作用;4)充足的叶酸可抑制MNNG对细胞Wnt/β-catenin信号转导通路的活化,从而达到抑制细胞不良反应的作用。
亢春彦[3]2004年在《FHIT、p16基因甲基化与肺癌关系的研究》文中研究指明肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，近年来肺癌发病率、死亡率在世界范围内均有较大幅度的增长，究其原因是因为人们对肺癌的发病机制尚未彻底了解，缺乏有效的防治措施。因此，彻底揭示肺癌的发生发展机制，以便对其进行有效的早期预警、早期诊断、早期防治显得尤为重要。 研究资料表明：DNA甲基化机制参与了肿瘤的发生。甲基化是指DNA在甲基转移酶催化下，将甲基基团一CH3加到胞嘧啶环的第5碳原子上形成5一甲基胞嘧啶(5-mC)，多发生于基因启动子区CpG岛。真核细胞的DNA甲基化是抑制基因活性的一种重要机制，其改变了蛋白和DNA的相互作用，导致染色体结构的改变，降低基因的转录。并且有证据提示DNA甲基化发生在细胞恶变之前，因此检测DNA启动子区是否发生了高甲基化有助于早期发现突变细胞。 脆性组氨酸叁联体基因(Fragile histidine traid，FHIT)是1996年由Ohta等用定位克隆技术及外显子捕获法在3p14.2发现的一种新的抑癌基因。在人类肺癌、胃肠道癌、乳腺癌等多种实体瘤中都存在FHIT基因转录产物及蛋白表达的缺失。但FHIT基因的失活机制不同于经典的抑癌基因，其在大多数肿瘤中只出现纯合子或半合子的缺失，只有极少数肿瘤可检测到点突变，因此人们将研究目光转向FHIT基因启动子甲基化区域，但国内外文献中关于FHIT基因启动子区甲基化与肺癌关系的研究则较少。郑州大学2004年硕士论文FHIT、pl6基因甲基化与肺癌关系的研究 p16基因定位于9p21不到40kb的范围内，有3个外显子和2个内含子组成，3个外显子共同编码p16蛋白，后者是Cdk4的抑制因子，能抑制细胞分裂，是迄今为止人类发现的第一个最直接的抑制肿瘤发生的固有成分。研究显示，p16基因第1外显子5’一CpG岛的甲基化在多种肿瘤的发生发展中起重要作用。 本研究采用MSP和克隆技术检测了人原发性肺癌组织，癌旁组织，正常组织及支气管鳞状化生组织中FHIT基因CPG岛甲基化状况，分析FHIT基因与人原发性肺癌发生发展之间的关系，并进一步检测pl6基因CpG岛甲基化状况，以期探讨多基因甲基化与肺癌发生之间的关系，并为肺癌早期预警或诊断提供基础资料。方法: 1.标本收集:本研究共收集59例肺癌患者的组织标本，相对应的32例肺正常组 织和15例癌旁组织，及n例支气管鳞状化生组织作FHIT基因、P16基因的 甲基化分析。 2.甲基化特异性聚合酶链技术(Methylation speeific PCR，MSP)扩增目的基 因进行基因分析。 3.应用基因克隆和DNA测序对FHIT基因启动子区DNA的异常甲基化进行分析。 4.应用SPSS10.0软件进行统计学分析处理。结果:1.FHIT基因MSP结果 提取肺癌患者的癌组织，癌旁组织和相应正常组织的基因组DNA，进行MSP扩增，甲基化率分别为38%(22/59)、20%(3/15)、0%(0/32)，叁组相比差异有统计学意义(尸=0.000)。进一步做两两比较，肺癌组、癌旁组与正常组相比差异具有统计学意义(尸=0.002)。32例正常肺组织的FHrr非甲基化特异性引物的PCR扩增均为阳性。支气管鳞状化生组织的甲基化阳性率为18%，高于正常组(O%)，但两者相比差异不具有统计学意义(P>0.05)。FHIT基因甲基化率在肺癌患者吸烟组和非吸烟组中的差异无统计学意义(p>0.05)。同时，FHIT基因甲基化率在不同组织分型，不同病理分级和不同临床分期中，差异也无统计学意义(P>0.05)。2.P16基因的MSP结果 以肺癌患者的癌组织，癌旁组织和相应正常组织中提取的基因组DNA为模板，进行MSp扩增，甲基化率分别为51%(33/59)、20%(3八5)、o%(o/犯)，叁组相郑州大学2004年硕士论文FHIT、P16基因甲基化与肺癌关系的研究比差异有统计学意义(尸=0.000)。进一步做两两比较，肺癌组与正常组的pl6甲基化表达差异也有统计学意义(p<0.05);癌旁组与正常组的甲基化率的差异也具有统计学意义(p<0.05)。支气管鳞状化生组织的甲基化阳性率为18%(2/11)，高于正常组(0%)，但两者相比差异不具有统计学意义(p>0.05)。P16基因的甲基化在肺癌患者吸烟组和非吸烟组中的差异也无统计学意义(P>0.05)。同时，pl6基因甲基化在不同组织分型，不同病理分级和不同临床分期中，差异也无统计学意义(P>0.05)。3.FHIT基因和pl6基因的MsP联合分析结果 本实验对两者在肺癌中的甲基化状态进行相关性分析，发现两者之间并无相关性。肺癌组FHIT、pl6基因甲基化的联合检测阳性率均显着高于单一检测一种基因的阳性率。吸烟患者的两种基因甲基化联合检测阳性率明显高于单一基因甲基化的检测，并且与非吸烟组相比较，差异具有统计学意义(p< 0.05)。4.基因测序结果 FHIT甲基化扩增产物中，所有的CpG岛中的胞嗜陡均保持不变，而CpG岛二核昔酸以外的胞啼咙经过PCR扩增后，则被胸腺喀睫取代。结论: 1.肺癌患者的FHIT基因5’一CpG岛发生了高频度的甲基化，表明其参与了肺癌 的演变，在肺癌的发展过程中可能是一个早期事件。FHIT基因甲基化率与肺癌 的组织分型、病理分级、临床分期无关。 2.p16基因5’一CpG岛甲基化与肺癌的发生密切相关，可能发生在肺癌形成的早 期阶段。p
常秀军[4]2005年在《肺癌前病变、肺癌中FHIT蛋白表达的临床研究》文中进行了进一步梳理目的:研究FHIT基因在人肺癌前病变、肺癌中表达情况,探讨FHIT基因在人肺癌发生、发展过程中的可能作用。 方法:采用免抗人FHIT抗体和枸掾酸-高温-SP免疫组化方法,检测298例福尔马林固定、石蜡包埋的标本(包括161例肺癌标本;51例肺癌前病变标本;30例正常肺组织和23例良性病变标本;33例肺癌转移淋巴结标本)中FHIT蛋白表达情况,分析其在病变发展过程中不同阶段的表达情况,探讨其在病变不同阶段间表达的关系及在肺癌组织中表达与组织学类型、分化程度、淋巴结转移及预后间的关系;并探讨其与吸烟的关系。 结果: 1) 在正常肺组织及肺良性病变组织中均阳性表达,无失表达;肺癌前病变、肺癌及肺癌转移淋巴结中总失表达率为60.8%与在正常肺组织及肺良性病变组织比较有显着差异(p<0.01),其中癌前病变组织、肺癌组织中失表达率分别为54.9%、59.1%;与肺癌转移淋巴结组织78.8%比较有显着性差异(p<0.05);肺癌前病变组织与肺癌组织间比较无显着差异(p>0.05)。 2) 肺癌组织中FHIT蛋白失表达率与肺癌组织学类型、细胞分化程度、患者P-TNM分期、淋巴结转移程度存在相关性(P<0.05);而与性别、年龄无相关性(p>0.05)。
李瑛[5]2008年在《GMA致16HBE细胞遗传物质损伤及对修复基因表达影响的研究》文中认为甲基丙烯酸环氧丙酯(Glycidyl methacrylate,GMA),别名甲基丙烯酸缩水甘油酯,是丙烯酸酯胶的主要组分,是一种高强度合成粘合剂的单体,该化学物分子既含有碳碳双键,又含有环氧基,具有很高的反应活性,能够使相关产品具有优良的防紫外、耐水和耐热等特性,因此在军事和民用工业中应用广泛。本研究课题组自80年代中后期首次从我国现场筛选出来并报道GMA致突变性以后,在国家自然科学基金等的连续资助下对其毒性、致突变性和潜在致癌性进行了一系列的研究工作。结果显示,GMA能与DNA共价结合,诱导原核生物基因突变,哺乳动物染色体损伤,人和大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤,抑制DNA半保留复制,在体外GMA可诱导BALB/C 3T3细胞、金仓鼠细胞(SHE)、正常人胚肺成纤维(HELF)细胞等不同类型细胞发生恶性转化,转化作用呈剂量-效应关系,提示GMA具有潜在致癌性。细胞体外转化试验是研究癌变机制的重要方法,以人的上皮细胞为背景进行肿瘤发生发展的试验研究,在种属和组织差异方面更具优势,是化学物致癌机制研究的发展趋势。16HBE(human bronchial epithelial)细胞是SV40 large T抗原永生化的人支气管上皮细胞株,保留着正常人支气管上皮细胞的特定形态和功能,在体外易于培养,裸鼠体内无致瘤性,可以作为一种较理想的靶细胞用于潜在化学致癌物检测及诱发细胞恶性转化机制的研究。本研究选用人支气管上皮细胞(16HBE)作为靶细胞,从染色体和DNA水平观察GMA对16HBE细胞遗传物质的损伤作用,即检测GMA致16HBE细胞染色体的损伤,以及转化细胞DNA修复基因点突变的情况;同时采用“基因组稳定和DNA修复基因芯片”检测GMA致16HBE细胞恶性转化相关DNA修复基因表达改变的情况,以探讨GMA的潜在致癌性。研究获得的主要结果如下:1.GMA致16HBE细胞遗传物质损伤的研究1.1 GMA对16HBE细胞染色体的损伤作用不同剂量GMA染毒16HBE细胞24hr,诱导16HBE细胞染色体发生畸变,呈剂量-效应关系。16μg/ml和20μg/ml剂量组与溶剂对照组相比,细胞染色体畸变率显着增高(P＜0.05)。GMA诱导16HBE细胞产生的染色体结构畸变类型主要有断裂、碎片、双着丝点、环状染色体、叁射体等。未观察到染色体数目畸变。低剂量(8μg/ml)GMA多次染毒16HBE细胞染色体畸变分析表明,16HBE细胞连续3次GMA染毒,与溶剂对照比较细胞染色体畸变率显着增高(P＜0.05),且随着染毒时间延长,细胞染色体畸变率升高。细胞染色体畸变以结构畸变为主,未观察到染色体数目畸变。对GMA诱导的16HBE转化细胞进行染色体畸变分析,转化细胞与对照细胞染色体结构畸变发生率无统计学差异(P＞0.05);染色体核型分析显示,转化的16HBE细胞失去正常核型,二倍体细胞减至79%,亚二倍体和超二倍体细胞增多,与溶剂对照相比,核型改变存在显着性差异(P＜0.05)。1.2 GMA致16HBE转化细胞DNA修复基因点突变的分析采用PCR-RFLP方法对GMA致16HBE转化细胞的DNA修复基因hMSH2基因C471A、G322A、IVS12-6(T＞C)及IVS1+9(C＞G)位点,XRCC1基因C26304T、G27466A、G36189A位点,XPD基因G23591A、A35931C位点及XRCC3基因C18067T位点的点突变情况进行分析,并应用DNA测序法(双脱氧末端终止法)对分析结果进行验证。结果显示,与对照细胞相比,转化细胞中hMSH2基因IVS12-6(T＞C)位点突变为TC基因型,未检测到其它位点的突变。2.GMA致16HBE细胞恶性转化相关DNA修复基因表达的改变采用“基因组稳定和DNA修复基因芯片”检测GMA转化细胞和对照细胞中DNA修复基因表达情况,分析两者的差异。应用GEArray Analyzer软件分析显示,GMA转化细胞与对照细胞比较,在113个基因中有8个基因的表达有显着差异,其中7个基因表达上调(ratio＞2),分别是NBS1、RAD50、RAD51、OGG1、XAB2、TOP3a、TNKS;NEIL2基因表达下调(0＜ratio＜0.5)。NBS1、RAD50、RAD51基因是双链断裂修复通路(DSBR)中的重要的功能基因,OGG1及NEIL2基因是碱基切除修复通路(BER)中的重要基因,XAB2是参与核苷酸切除修复(NER)的基因,TOP3a和TNKS是与基因组稳定相关的基因。上述DNA修复基因表达的改变进一步提示GMA致16HBE细胞恶性转化是一个多基因参与的复杂过程,涉及多个基因多条修复通路的协同作用。综上所述,本研究探讨了GMA致16HBE细胞恶性转化过程中对遗传物质的损伤,及其对DNA修复基因表达改变的影响。结果提示GMA可通过对染色体的损伤影响其所携带基因的结构和功能改变,且GMA通过改变DNA修复基因结构及对相关DNA修复基因表达的影响,从而导致细胞修复功能缺陷及损伤—修复的平衡紊乱,基因组稳定性下降,最终导致正常细胞恶性转化。本研究工作为深入探讨GMA的潜在致癌机制提供新的线索,同时也为GMA致癌危险度评定、开展流行病学监测奠定了理论基础。
安倩[6]2002年在《肺癌的分子遗传学改变及其临床意义》文中提出肺癌已成为严重危害公众健康的恶性疾病之首。深入研究肺癌的遗传学改变，寻找有价值的分子生物标记，用于辅助肺癌的筛查、早诊、治疗以及随访是极有意义的工作。 我们应用微卫星不稳定性分析和半巢式甲基化特异性PCR(MSP)技术检测中国人原发性肺癌临床标本中抑癌基因的杂合缺失(LOH)以及p16基因异常甲基化改变，结果发现： 1．FHIT、p53和p16在肺癌中存在普遍的缺失。其它抑癌基因如APC、DPC4、DCC、ATM和BRCAl似乎不是所在染色体区域缺失的靶基因。此外，PRLTS、p57和PTEN所在位点的杂合缺失率在肺鳞癌和肺腺癌中有明显差异，其中PRLTS在腺癌中的杂合缺失率远高于鳞癌，提示该基因在腺癌的发病过程中可能有重要作用。 2．半巢式MSP是一项检测微量DNA中基因异常甲基化的敏感而且特异的技术。我们分析了94例肺癌病人肿瘤和血浆标本中p16基因启动子区域的高甲基化情况，阳性率分别为78.7％和68.1％；对应的40例痰标本中，29例(72.5％)也得到了阳性结果。p16基因甲基化是肺癌发病过程中的早期事件，肺癌病人血浆和痰标本中p16甲基化可能是辅助肺癌高危人群筛查以及早诊的有效的分子生物标记。 为了分析人支气管上皮细胞恶变早期的基因表达图谱，我们利用双相抑制性差减杂交技术，建立了SV40 L-T转化的永生化人支气管上皮细胞系Y第44代细胞(Yp44)差异表达的cDNA文库，其中包括218个功能已知的基因和131个功能不明的基因或EST片段。Yp44细胞具有与原发性肺癌相似的某些遗传学改变，因此，永生化的人支气管上皮细胞系有望作为研究肺癌发生、发展的可靠的体外模型，并且有助于发现与早期癌变相关的新基因。
孔令文[7]2004年在《人支气管上皮细胞恶性转化过程中染色体畸变和FHIT蛋白表达的研究》文中提出目的 研究烟草特异性亚硝胺（NNK）诱发人支气管上皮细胞恶性转化过程中染色体畸变及FHIT蛋白表达，探讨其在吸烟高危人群罹患肺癌预警及普查方面的意义。方法 用浓度为500μɡ/ml NNK诱发BEAS-2B细胞恶性转化，并在此过程中用常规中期染色体计数及免疫细胞化学方法，动态观察染色体畸变和FHIT蛋白表达的情况。结果 1. NNK诱发BEAS-2B细胞恶性转化模型的建立 ①BEAS-2BNNK（实验组）第5代细胞血清抗性显着增强。② 第15代BEAS-2BNNK细胞具有锚着独立性生长特性（软琼脂克隆形成）。③ 第20代BEAS-2BNNK细胞超微结构出现明显异型性。④ 第25代BEAS-2BNNK细胞在裸鼠体内成瘤,病理为高分化鳞形细胞癌。 2. 染色体畸变 ① BEAS-2B（对照组）二倍体细胞占细胞总数的91%-97%，传代后核型及染色体数目稳定；从第5代开始BEAS-2BNNK细胞即逐渐失去正常2n=46核型,随着传代次数增加, 二倍体细胞比例从83%递减至54%，异倍体及多倍体细胞呈递增趋势，较对照组明显增高；第25代BEAS-2BNNK细胞可见内复制现象, 占细胞总数3%。② 各代BEAS-2B细胞非稳定性畸变发生率为2%-4%；除第5<WP=7>代BEAS-2BNNK细胞非稳定性畸变总频率（11%）明显高于BEAS-2B细胞外，其余各代细胞与BEAS-2B细胞相近。3. FHIT蛋白表达 BEAS-2B细胞FHIT蛋白表达稳定，在各代之间的差别无统计学意义。第5代BEAS-2BNNK细胞FHIT蛋白表达即开始下降，并随传代次数增加，呈现逐渐减弱趋势；但第25代细胞FHIT蛋白却呈高表达。结论 1. 浓度为500μɡ/ml NNK能成功诱发人支气管上皮细胞（BEAS-2B）细胞恶性转化，为进一步探讨肺癌发生机制、尤其是吸烟致肺癌发生机制提供了理想模型。2. 染色体的异倍性和多倍性在NNK诱发BEAS-2B细胞转化成肺癌过程中可能属早期事件；内复制被认为可能是大多数肿瘤细胞核异常增大和染色体多倍化的原因。3. 在NNK诱发BEAS-2B细胞恶性转化早期，FHIT蛋白表达随着BEAS-2B细胞恶性程度的增加而减弱，推测FHIT蛋白表达减弱在肺癌发生过程中属早期事件；FHIT蛋白在细胞恶性转化晚期上调表达值得进一步研究。总之，染色体畸变和FHIT蛋白表达可能是肺癌发生发展过程中的早期事件，有望成为吸烟高危人群罹患肺癌的预警及普查指标之一。
刘勇[8]2002年在《肺癌染色体和DNA甲基化异常改变及其诊断价值的研究》文中研究说明肺癌是人类高发恶性肿瘤，其死亡率在我国的肿瘤性疾病中为第二位；在城市其死亡率为第一位；而且肺癌的发病率在我国一直呈上升趋势，严重危害人类健康。降低肺癌死亡率的策略无非在于叁个方面：预防、早期诊断和完善治疗方案。目前从国内外研究来看，早期诊断，尤其是分子细胞学诊断可能是最有效的途径之一。因此，寻找有效的早诊、分期分型以及预后的分子生物学标志物和建立有效的辅助性分子诊断方法，有着重要的理论意义和光明的应用前景。同时，深入研究肺癌发生的分子细胞遗传学、尤其是癌前病变的分子机理，不仅可为肺癌的预防、早诊和治疗以及预后提供理论依据，而且有利于从根本上控制肺癌这一恶性肿瘤。 为了筛选较好的分子标记，我们从肺癌分子细胞遗传学入手，利用原位杂交技术，分析肺癌病人痰细胞中细胞遗传学改变；利用原位杂交技术和频谱式染色体核型分析法，检测了永生化人支气管上皮细胞系M、Y中细胞遗传学异常改变。从肺癌遗传外改变入手，利用甲基化特异性PCR技术检测肺癌病人肿瘤、血浆和痰标本中抑癌基因异常甲基化改变；利用全基因组甲基化检测方法扫描了肺癌组织中基因组范围内DNA甲基化的改变情况。结果发现：一、痰细胞标本中染色体数目异常和FHIT基因缺失1、系统分析了1，3，6，7，8，9，10，11，12，15，17，18，X，Y染色体在肺癌病人痰细胞中染色体异常改变，发现染色体拷贝数的异常改变(增加和／或减少)是肺癌中常见的现象，且具有高度复杂性和随机性。从整体上看，1，3，7，8，X等染色体以拷贝数增高为主；9，15、17以拷贝数减少第叁军医大学博士研究生论文 肺癌染色体和DNA甲基化异常改变及其诊断价值的研究 为主；6，10，11，12，18，Y等染色体增加与减少共存，没有明显的差 异。此外，同一病例痰细胞中染色体数目异常通常涉及多条染色体，且 同一条染色体数目改变不止一种类型，说明在肺癌发生过程中整个染色 体水平上的调控机制出现紊乱。2、就肺癌痰细胞中染色体数目异常（增加和／或减少）作为肺癌诊断的辅助 指标来看，其特异性和敏感性均明显高于传统的疾细胞学诊断。17，18 号染色体对肿瘤检出率最高O．7O，83、9O），其次是 7，8，9，10，11， 12和X染色体；同时使用任意两条染色体组合对肺癌的检出率可达80％ 以上，说明染色体数目异常（增加或减少）是肺癌辅助诊断较好的指标。3、FHIT基因外显子1，5，6．7在痰细胞中的缺失率均较高，FHIT基因外 显子缺失主要表现为相对缺失，至少一个外显子发生缺失的比例为 76．0％＊），表明FHH基因外显子缺失是其在肺癌中失活的机制之一， 并可作为肺癌诊断的指标。4、我们建立的改良的痰细胞FISH标本制备和分析方法，降低了背景的干扰， 且探针更易于穿透细胞，其杂交信号检测的准确度和信号的强度均较高。 本研究利用多个染色体特异性探针较系统地分析了肺癌痰标本中染色体异常改变，在国内外尚未见相关报道。我们的研究表明染色体拷贝数的异常改变 市癌病人痰标本中常见的现象，是肺癌辅助诊断较好的指标之一；同时，改良的疾细胞FISH标本制备和分析方法为痰细胞分子遗传学研究奠定了基础。二、永生化人支气管上皮细胞系M、Y细胞中分子细胞遗传学异常改变 永生化的人支气管上皮细胞是目前研究肺癌癌变过程中分子遗传学机理的重要体外模型之一。在本研究中，我们分析了处于癌前病变阶段的人支 8 第叁军医大学博士研究生论文 肺癌染色体和DNA甲基化异常改变及其诊断价值的研究 气管上皮细胞系M、Y细胞在永生化过程中的分子细胞遗传学异常改变。 1、不同代龄M、Y细胞中3p异常改变的FISH分析： l）M细胞中，3plZ，3pl3，3pl4，3pZI，3p22－23和3p24主要表现为缺 失。在早代龄细胞中有一定比例的特异性缺失和纯合缺失：随着细胞 代龄的增加，主要表现为随3号染色体拷贝数的增加而发生特异性丢 失。3pl4和3p24在早代龄细胞门 代）中有明显易位；3p25和3p26 在早、中、晚代龄细胞中，主要表现为易位；在晚代龄细胞中（180 代），90％以上的细胞具有这一改变。利用染色体着丝粒探针和染色体 涂染探针对3p25上6断裂点进行了分析，结果发现3p25易位到染色 体11pl415 之间。 2）Y细胞中，3plZ、3p13、3pl4、3pZI、3p22－23和3p24、3p25、3p26 在早代龄中均仅有一个拷贝，在体外培养进程中，3plZ、3pl3、3pl4、 3pZI、3p22毛3、3p24主要随着3号染色体数目的增加拷贝数相应增 加，但没有发生明显的相对丢失。3p25、3p26在晚代细胞中具有较 高易位率产70叨。 2、利用SKY进一步分析了39代龄Y细胞分子细胞遗传学改变情况，发 现在Y细胞中存在一系列染色体缺失和?
胡迎春[9]2003年在《α粒子辐射诱发人支气管上皮恶性转化成瘤细胞的生物学特性研究》文中提出据估计，人类所受天然辐射中50％的剂量来自于氡及子体衰变时发出的α粒子，流行病学研究表明暴露于高水平的氡及其子体可导致肺癌的发病率增高，因此研究氡或者说α粒子与人类肺癌的关系是辐射致癌研究领域的热点。约80％的人类癌症起源于上皮组织，因而用上皮细胞进行研究能更好地模拟人体癌症发生的自然过程，是辐射致癌研究的发展趋势，但是以前的致癌机理研究多集中于整体动物实验或成纤维细胞的体外细胞恶性转化实验，因此采用上皮细胞的恶性转化模型进行致癌机理研究就具有十分重要的意义。辐射致癌过程大致可以分为启动、促进及恶性进展叁个阶段。为了在体外完整地建立起可以模拟辐射致癌各阶段的细胞模型，本研究以我室已建立的α粒子辐射诱发的人支气管上皮细胞恶性转化株BERP35T4为基础，将该细胞接种于裸鼠皮下，在裸鼠体内连续传代叁次后，观察到该细胞获得转移潜能，将该肿瘤组织进行体外分离肿瘤细胞并培养建系，获得了具有转移潜能的恶性转化细胞系BERP35T4-Ta；本研究还以叁种细胞系：BEP2D、BERP35T4及BERP35T4-Ta为材料，分别从免疫组化、增殖速度、锚着独立生长能力、血清抗性及染色体数日等方面对这叁种细胞系的特性进行了研究，还利用Transwell技术分析了BERP35T4-Ta的迁移能力，并进一步分离出转移细胞；最后利用微卫星不稳定性分析技术对肿瘤细胞系中抑癌基因的杂合性缺失情况进行了检测。本研究所获得的主要结果如下：1． BERP35T4(immortalized human bronchial epithelial cell transformed byα-particles)成瘤性实验：以永生化人支气管上皮细胞BEP2D为对照，将BERP35T4细胞接种于5-6周龄裸鼠皮下，每组接种9只，雌雄兼半。16周后，对照组无一长出肿瘤(0／9) ，BERP35T4组相继有4只长出肿瘤(4／9) ，其中1只裸鼠在其胸部及后肢出现肉眼可见的转移瘤，经解剖，发现肺部也出现转移灶。将BERP35T4在裸鼠体内连续传代叁次，共接种动物14只，移植瘤均能成活并生长，鼠间肿瘤传代成瘤率达到100%(14／14) 。鼠间传代肿瘤潜伏期明显缩短为7-14天，传代间隔时间也缩短为3． 5周。经病理和免疫组化染色鉴定，皮下瘤组织和肺中的转移a粒子辐射诱发人支气管上皮恶性转化成瘤细胞的生物学特性研究中文摘要瘤组织均为低分化鳞状上皮细胞癌。裸鼠肿瘤组织经体外无血清选择培养获得了具有转移潜能的细胞BE即35T4一T，通过极低密度接种的方法从BERP35T4一T中进一步分离出叁株能在体外长期传代的单克隆，分别命名为:BERP35T4一Ta、BE对35T4一Tb、BE即35T4一Tc(tumorigenic human bronchial ePithelial eelltransformed by以一Partieles)。 2.BEpZD、BERP35T4和BE即35T4一Ta的细胞生物学特性研究:①细胞增殖能力:叁种细胞的生长速度按快慢依次为BE即35T4一Ta>BERP35T4>BEPZD;倍增时间按长短依次为BEPZD>BERP35T4>BERP35T4一Ta。②锚着独立生长能力:BEPZD细胞在软琼脂中最多可以从一个细胞分裂成八个细胞，基本无法形成克隆，而且在细胞接种一周内陆续死亡，克隆率只有0.05%;而BERP35T4的软琼脂克隆形成率为0.64%，明显高于BEPZD;BE好35T4一Ta的克隆率更是高达1.26%，说明了BE即35T4经过在裸鼠体内连续传代叁次后所分离出的BE即35T4一Ta细胞，其锚着独立生长能力得到了加强。③血清抗性:在含有10%血清的培养基中，BE咒D出现鳞状分化，生长速度减慢，细胞变扁大并逐渐死亡，而BERP35T4和BE犯)35T4一Ta细胞则对血清分化产生抗性，持续保持增殖能力，并且BE即35T4一Ta对血清的抗性强于BE即35T4。④染色体众数:BEPZD具有较为稳定的细胞遗传学特性，在传代过程中可保持较为稳定的染色体众数和核型。BERP35T4二倍体数目减少，大量出现亚叁倍体(42%)，同时也存在一定比例的四倍体(35%);BERP35T4一Ta染色体数目四倍体率高达82%。⑤细胞的迁移能力:采用Transwell技术检测了叁种细胞的迁移能力，发现BEPZD与BERP35T4基本不发生迁移，而BERP35T4一Ta的迁移率可达到l%，我们还对转移细胞进行了进一步的分离和培养。综合以上实验结果，本文认为BE钟35T4一Ta细胞具有较为典型的恶性肿瘤细胞的表型，并且还具有较高的转移能力。 3.微卫星不稳定性分析技术检测抑癌基因的杂合性缺失:针对位于肺癌高缺失染色体区域的9个已知基因(尸z刀T、A尸C、尸RLTS、p肠、尸了石刃、p卯、ATM、BRcA了、p”)，选择了16个位于基因内或与基因紧密连锁的微卫星多态性位点，对上述叁种细胞系(BEPZD、BERP35T4及BERP35T4一Ta)进行了微卫星不稳定性分析。结果显示:厂万ZT基因在BERP35T4和BERP35T4一Ta细胞中均发生了杂合性缺失，而p肠基因的杂合性缺失只在BERP35T4一Ta细胞中发现，在BE即35T4细胞中没有发现。该结果提示:月W丁基因在BEPZD细胞的恶性转化过程中起着a粒子辐射诱发人支气管上皮恶性转化成瘤细胞的生物学特性研究中文摘要重要作用，而p了‘基因在该细胞恶性进展获得转移特性的过程中起着一定的作用。 综合以上实验结果，本研究所建立的BE”35T4一Ta细胞与BERP35T4细胞相比，在
黄思语[10]2014年在《甲基硝基亚硝基胍致哈萨克族正常食管上皮细胞表观遗传改变的研究》文中提出目的：探讨甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对哈萨克族正常食管上皮细胞一般生物学及表观遗传学指标的改变,为哈萨克族食管癌的防治提供理论依据。方法：1联合消化法培养原代哈族食管上皮细胞,细胞形态学和角蛋白免疫组织化学法鉴定细胞。2SV40-T抗原基因转染原代培养的哈族正常食管上皮细胞,获得永生化细胞系,采用RT-PCR法检测SV40-T抗原基因在永生化细胞中的表达。3MTT法检测细胞增殖改变、流式细胞术检测细胞周期改变、AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡改变。4高效液相色谱法(HPLC)测定基因组DNA整体甲基化水平改变。5甲基化特异性聚合酶链(MSP)法检测P16、FHIT、LRRFIP1、ALDHIL1基因甲基化状态。6RT-PCR和Wersten Blot法检测p16、FHIT、LRRFIP1、ALDHIL1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因mRNA和蛋白表达。结果：(1)原代细胞培养8～10d后汇合成片,呈铺路石样生长,免疫组织化学法检测细胞角蛋白表达阳性；(2)通过转染SV40-T获得永生化哈族正常食管上皮细胞,细胞形态和结构保持完好；(3)染毒后各组细胞抑制率均高于对照组(0μg/ml)；各组细胞G0+G1期比例低于对照组,而S期和G2+M期均高于对照组；中、高浓度组细胞凋亡率与对照组相比升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)；(4)中、高浓度组细胞基因组整体DNA甲基化水平低于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)；(5)高浓度组细胞DNMT1含量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),各浓度组细胞DNMT1活性均高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)；各浓度组细胞DNMT3a含量及DNMT3a活性均高于对照组,差异均具有统计学意义(<0.05)；各浓度组细胞DNMT3b含量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),高浓度组细胞DNMT3b活性高于对照组,差异有统计学意义(<0.05)；(6)与对照组比较各浓度组细胞p16、FHIT、LRRFIP1基因甲基化状态没有改变；高浓度组细胞ALDH1L1基因有从部分甲基化向完全甲基化转变的趋势；(7)与对照组比较各浓度组细胞p16、FHIT、LRRFIP1、ALDHIL1、DNMT1、DNMT3α和DNMT3b mRNA及蛋白表达水平均升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论：(1)成功培养出原代哈族正常食管上皮细胞并建立了永生化哈族正常食管上皮细胞系。(2)MNNG抑制哈族正常食管上皮细胞增殖,将细胞周期阻滞在S期和G2+M期,并促进细胞凋亡。(3)MNNG可降低哈族正常食管上皮细胞基因组DNA整体甲基化水平,使ALDH1L1基因从部分甲基化向完全甲基化转变。(4)MNNG提高了DNMT1、DNMT3a和DNMT3b酶活性,为抑癌基因甲基化提供了基础。MNNG对哈萨克族食管正常上皮细胞一般生物学及表观遗传学指标有一定影响。
参考文献：
[1]. Fhit基因在人支气管上皮细胞癌变发生发展中的异常改变及其作用机制[D]. 李立. 中国协和医科大学. 2001
[2]. 叶酸对MNNG诱导的哈族食管上皮细胞恶变的干预作用及表观遗传学机制研究[D]. 张慧霞. 新疆医科大学. 2017
[3]. FHIT、p16基因甲基化与肺癌关系的研究[D]. 亢春彦. 郑州大学. 2004
[4]. 肺癌前病变、肺癌中FHIT蛋白表达的临床研究[D]. 常秀军. 北京市结核病胸部肿瘤研究所. 2005
[5]. GMA致16HBE细胞遗传物质损伤及对修复基因表达影响的研究[D]. 李瑛. 中国疾病预防控制中心. 2008
[6]. 肺癌的分子遗传学改变及其临床意义[D]. 安倩. 中国协和医科大学. 2002
[7]. 人支气管上皮细胞恶性转化过程中染色体畸变和FHIT蛋白表达的研究[D]. 孔令文. 重庆医科大学. 2004
[8]. 肺癌染色体和DNA甲基化异常改变及其诊断价值的研究[D]. 刘勇. 第叁军医大学. 2002
[9]. α粒子辐射诱发人支气管上皮恶性转化成瘤细胞的生物学特性研究[D]. 胡迎春. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[10]. 甲基硝基亚硝基胍致哈萨克族正常食管上皮细胞表观遗传改变的研究[D]. 黄思语. 新疆医科大学. 2014
标签：肿瘤学论文; 上皮细胞论文; 肺癌论文; 细胞癌变论文; 甲基化论文; 肺癌转移论文; 食管肿瘤论文; 人类染色体论文; 基因合成论文; dna提取论文; 肿瘤论文; dna修复论文;